Association des génotypes HPV avec les verrues anogénitales externes : une étude transversale

Design de l’étude et participants

Une étude transversale qui utilise un échantillon non probabiliste a été menée. Les patients fréquentant les cliniques de dermatologie de la zone du district sanitaire de Farwania ont été recrutés dans l’étude de manière consécutive de novembre 2016 à mai 2017. Les patients immunocompétents avec un diagnostic clinique antérieur de verrues anogénitales externes prévus pour un traitement par cryothérapie ou laser ont été invités à signer le formulaire de consentement après une explication verbale du dermatologue sollicitant leur participation. Au moment du prélèvement, les spécimens de verrue ont été recueillis dans un milieu de transport universel (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italie), et conservés à – 80 °C. L’approbation éthique a été obtenue auprès du comité d’éthique du centre des sciences de la santé (numéro : VDR/EC/2310) et du ministère de la santé.

Des informations démographiques et cliniques ont été prises sur chaque patient, notamment : l’âge (années), le sexe (homme, femme), la nationalité (koweïtienne, non koweïtienne), le nombre de verrues (une, deux à quatre, et au moins cinq), la durée de la présence des verrues (< un mois, un à six mois, sept à 12 mois, et plus de 12 mois), la taille de chaque verrue (en centimètres) (< une, un, entre un et deux, plus de deux), les partenaires ont des verrues (oui, non), et si les verrues ont fait l’objet d’un traitement préalable (oui, non). Aucun des participants n’a reçu de vaccination contre le VPH, car la vaccination contre le VPH n’a pas encore été mise en œuvre au Koweït, bien que sa mise en œuvre soit actuellement discutée au ministère de la Santé.

Extraction d’ADN et contrôles

Les échantillons de tissus reçus ont été conservés à – 80 °C. En raison du grand nombre d’échantillons reçus, toutes les verrues par patient ont été hachées ensemble et ont été soumises à un seul isolement d’ADN. Le tissu a été haché avec des ciseaux et des pinces stériles sur une boîte de Pétri et environ 25 mg de tissu ont été pesés. Les tissus ont été lavés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et transférés dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml. L’ADN génomique a été extrait des échantillons de tissus à l’aide d’un kit QIAmp DNA Mini (Qiagen, USA) conformément aux instructions du fabricant.

Les vecteurs HPV de type 2, HPV de type 1 et HPV de type 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ont été utilisés comme témoins dans les expériences de PCR.

PCR en temps réel

Le test PCR en temps réel a été réalisé pour dépister l’ADN du HPV dans les verrues génitales. Cinq microlitres (5-μl) de l’ADN extrait ont été combinés avec 12,5-μl de mélange maître Syber Green 2X (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) contenant ROX comme référence passive, et 10 pmol d’amorces avant et arrière (10-uM, décrites ci-dessous). Tous les jeux d’amorces ont été synthétisés sur mesure par Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis. Le mélange a été complété jusqu’à un volume de 25-μl avec de l’eau sans nucléase (Ambion, Austin, TX, USA). Afin de réduire le nombre de faux résultats positifs ou négatifs, les échantillons ont été analysés en double sur une plaque de réaction à 96 puits optiques (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Des contrôles positifs et négatifs ont été inclus dans chaque lot d’amplification. Afin de quantifier le HPV dans les échantillons, une dilution sérielle de 5 à 10 fois de l’ADN du contrôle positif connu a été effectuée à côté des échantillons. L’amplification par PCR en temps réel a été réalisée dans un appareil ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Le test PCR en temps réel a été réalisé sur trois plaques différentes. La première plaque a été utilisée pour déterminer l’intégrité de l’ADN cible par le test PCR de la β-globine, en amplifiant une cible de 268 pb de fragment, comme décrit précédemment par Lum et Le Marchand en 1998 . La séquence nucléotidique des amorces β-globine est la suivante : Amorce de PCR directe de la β-globine : 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. Amorce PCR inverse de β-globine : 5′-AACAGCATCAGGAGTGGACAGAT-3′.L’amplification PCR a été initiée à 95 °C pendant dix minutes et complétée par 45 cycles d’amplification (dénaturation à 95 °C pendant 15 s, recuit à 55 °C pendant 45 s et extension à 65 °C pendant une minute).

La deuxième plaque a été utilisée pour dépister la présence d’une infection par le VPH à l’aide des amorces MY11/GP6 de l’ORF L1 du VPH . Les séquences nucléotidiques des amorces MY11/GP6 sont les suivantes : MY11 amorce directe : 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ et GP6 amorce inverse : 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. La taille attendue du fragment amplifié est de 185 pb. L’amplification par PCR a été initiée à 95 °C pendant dix minutes et complétée par 45 cycles d’amplification (dénaturation à 95 °C pendant 15 s, recuit à 45 °C pendant 45 s et extension à 65 °C pendant une minute).

La troisième plaque a été utilisée pour dépister la présence d’une infection par le VPH en utilisant les amorces HVP2/B5 de l’ORF L1 du VPH . Les séquences nucléotidiques des amorces HVP2/B5 sont les suivantes : Amorce directe HVP2 : 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′ ; Amorce inverse B5 : 5′- AYN CCR TTR TGN CCY TG -3′. La taille attendue du fragment amplifié est de 650 pb. L’amplification PCR a été initiée à 95 °C pendant dix minutes et complétée par 45 cycles d’amplification (dénaturation à 95 °C pendant 15 s, recuit à 50 °C pendant 45 s et extension à 65 °C pendant une minute).

Les spectres de fluorescence ont été enregistrés pendant la phase d’élongation de chaque cycle PCR. Le logiciel de détection des séquences (SDS v1.7) de la PCR en temps réel ABI 7500 a été utilisé pour générer la courbe d’amplification de chaque réaction. Une courbe de dissociation a été générée après chaque réaction pour différencier les amplicons spécifiques et non spécifiques. Sur la base de la courbe d’amplification, tous les échantillons présentant une amplification du HPV à partir de n’importe quel cycle et jusqu’au cycle 40 (avec une ligne de coupure de 0,2) ont été sélectionnés pour l’analyse. Seuls les échantillons dont la courbe de dissociation était comprise entre 70 °C et 80 °C et dont la valeur de la dérivée était comprise entre 0,100 et 0,500 ont été considérés comme positifs pour l’ADN HPV.

Séquençage Sanger

L’ADN HPV dans les verrues a été amplifié par PCR nichée avant le séquençage, en utilisant le mélange maître AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Les amorces HVP2/B5 ont été utilisées dans la première PCR, et les amorces CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R et C4F/C4R dans la seconde PCR. La première amplification PCR a été initiée à 95 °C pendant dix minutes et complétée par 35 cycles d’amplification (dénaturation à 95 °C pendant 15 s, recuit à 50 °C pendant 45 s et extension à 68 °C pendant une minute). La seconde amplification PCR a été réalisée en utilisant 3 μl du premier produit PCR, et les mêmes conditions de cycle. Les génotypes de HPV à large spectre que l’on s’attend à détecter à partir de verrues cutanées en utilisant les amorces HVP2/B5 et CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R et C4F/C4R comprennent les types de HPV des genres alpha (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 et 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 et 88), mu (HPV 1 et 63) et nu (HPV 41) .

Les produits PCR ont été purifiés à l’aide d’un kit de purification PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Ils ont ensuite été soumis à une réaction de séquençage Sanger en utilisant le mélange de séquençage de cycle BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), et les amorces PCR nichées décrites ci-dessus. Des purifications PCR post-séquençage ont été réalisées afin d’éliminer les terminateurs déoxy à colorant fluorescent non liés en utilisant le kit de purification BigDye XTerminator™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les échantillons ont été dénaturés pendant 2 minutes à 95 °C, puis immédiatement refroidis sur glace et chargés sur un analyseur génétique ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les échantillons ont été électrophorés sur un réseau capillaire de 50 cm utilisant le polymère POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) comme milieu de séparation.

Les échantillons ont été analysés à l’aide du logiciel Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L’alignement des séquences HPV a été réalisé avec les séquences présentées dans la base de données GenBank à l’aide du logiciel BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) et de la base de données HPV du Laboratoire national de Los Alamos Data Biologie théorique et Biophysique (https://pave.niaid.nih.gov/).

Lorsque les séquences obtenues étaient de mauvaise qualité en raison d’un faible rendement du produit PCR, les produits PCR ont été clonés dans le vecteur pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) après purification avec le kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), et le séquençage des inserts a été effectué en utilisant les amorces avant et arrière M13.

Analyse statistique

Les données du diagnostic clinique, les données démographiques et l’analyse virologique ont été tabulées et analysées à l’aide du logiciel statistique SPSS ‘Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0’ (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Des statistiques descriptives : fréquences/pourcentages, mesures du centre et de la dispersion ont été calculées. Pour tester l’égalité des moyennes, le test t à deux échantillons a été utilisé pour toutes les variables continues lorsque la normalité était respectée, sinon le test U de Mann Whitney a été utilisé. Pour comparer les moyennes de trois groupes, on a utilisé soit l’analyse de la variance, soit le test de Kruskal-Wallis, selon les hypothèses retenues. Le test d’indépendance du chi carré de Pearson ou le test exact de Fisher ont été utilisés pour tester les associations entre deux variables catégorielles lorsque les hypothèses étaient satisfaites. Pour modéliser un résultat binaire avec un ensemble de covariables, une régression logistique a été mise en œuvre, et des odds ratios bruts et ajustés ainsi que leurs intervalles de confiance à 95 % ont été estimés. Tous les tests étaient bilatéraux et une valeur P inférieure à 5% était considérée comme statistiquement significative.