BétaGalactosidase Assay (A better Miller)

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Background

β-La galactosidase est codée par le gène lacZ de l’opéron lac chez E. coli. C’est une protéine de grande taille (120 kDa, 1024 acides aminés) qui forme un tétramère. La fonction de l’enzyme dans la cellule est de cliver le lactose en glucose et galactose afin qu’ils puissent être utilisés comme sources de carbone/énergie. Le composé synthétique o-nitrophényl-β-D-galactoside (ONPG) est également reconnu comme un substrat et clivé pour donner du galactose et de l’o-nitrophénol qui a une couleur jaune. Lorsque l’ONPG est en excès par rapport à l’enzyme dans une réaction, la production d’o-nitrophénol par unité de temps est proportionnelle à la concentration de β-Galactosidase ; ainsi, la production de couleur jaune peut être utilisée pour déterminer la concentration en enzyme.

Alors, pourquoi s’en soucier ? Habituellement, les expériences sont conçues de telle sorte que la concentration de β-Galactosidase dans la cellule est une lecture pour un certain aspect d’un système étudié. Par exemple, un chercheur peut fusionner un promoteur au gène lacZ et utiliser les niveaux de β-Gal comme indicateur de l’activité du promoteur dans diverses conditions. En 1972, Jeffrey Miller a publié « Experiments in Molecular Genetics » qui contenait un protocole pour déterminer la quantité de β-Gal avec l’ONPG. Pour cette raison, les essais ONPG/β-Gal sont appelés essais « Miller », et une quantité normalisée d’activité β-Gal est une « unité Miller ».

1 unité Miller = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1.75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

où:

• Abs420 est l’absorbance du jaune o-nitrophénol,
• Abs550 est la dispersion des débris cellulaires qui, multipliée par 1.75, se rapproche de la diffusion observée à 420nm,
• t = temps de réaction en minutes,
• v = volume de la culture dosée en millilitres,
• Abs600† reflète la densité cellulaire.

†Notez que cette valeur est différente pour chaque spectrophotomètre utilisé et qu’elle doit être étalonnée en plaçant des dilutions de cultures Abs600 connues pour déterminer les unités formant des colonies par Abs600.

Dans son livre, le Dr. Miller explique que cette formule donne environ 1 unité de Miller pour les E. coli non induits (faible production de β-Gal) et environ 1000 unités pour une culture complètement induite (cultivée sur lactose ou IPTG).

Dans mon expérience, les cultures de MG1655 induites avec 1 mM d’IPTG en phase logarithmique ont 1500-1800 unités de Miller. La raison de cette différence n’est pas connue, mais je soupçonne qu’elle provient des différences de densité Abs600/cellules entre le spectrophotomètre du Dr Miller et celui que j’utilise et du fait que je réalise mes essais de Miller à 30 °C (pour des raisons de commodité) alors que le Dr Miller a réalisé ses essais à 28 °C. J’ai fait des fusions de promoteurs qui génèrent ~40 000 unités de Miller ; cependant, comme on le verra plus loin, c’est trop élevé pour le test et le protocole a donc été modifié pour abaisser cette valeur.

Protocole

Le protocole que j’utilise est dérivé d’un article de Zhang et Bremer (JBC 270, 1995, Texte intégral gratuit !) dans lequel le protocole original de Miller a été grandement simplifié pour permettre de mesurer plus d’échantillons avec moins de manipulation.

En bref, le protocole consiste à mesurer la densité cellulaire d’une culture de bactéries (Abs600), puis à retirer une aliquote des cellules de la cuvette et à les mélanger avec une solution de « perméabilisation » qui contient un détergent qui perturbe les membranes cellulaires (mais laisse le β-Gal intact). Cela tue les cellules et arrête la traduction. Après incubation, on ajoute une solution de « substrat » ONPG et on laisse la couleur jaune se développer. Une solution « d’arrêt » est ensuite ajoutée et l’absorbance de l’o-nitrophénol est mesurée.

1. Cultiver des cultures dans les conditions que vous souhaitez tester.
2. Pendant la croissance, mesurer au préalable des aliquotes de 80 μL de solution de perméabilisation dans des tubes microfuges de 1.5 mL de tubes microfuges et fermez-les.
3. Mesurez l’Abs600 et ENREGISTREZ-LE !
4. Retirez une aliquote de 20 μL de la culture et ajoutez-la aux 80 μL de solution de perméabilisation.

L’échantillon est maintenant stable pendant plusieurs heures. Cela vous permet d’effectuer des expériences de parcours temporel.

1. Après le prélèvement du dernier échantillon, déplacez les échantillons et la solution de substrat dans la salle chaude à 30 °C pendant 20 à 30 minutes.
2. Ajoutez 600 μL de solution de substrat à chaque tube et NOTEZ L’HEURE DE L’ADDITION.
3. Après le développement d’une couleur suffisante, ajoutez 700 μL de solution d’arrêt, mélangez bien et NOTEZ L’HEURE D’ARRET.
4. Après avoir arrêté le dernier échantillon (certains peuvent prendre plus de temps que d’autres, mais en général, ils sont terminés en 30-90 minutes), transférez les tubes dans une microfugeuse et faites tourner pendant 5-10 minutes à pleine vitesse.
5. Sortez délicatement les tubes de la centrifugeuse et transférez la solution du TOP des tubes dans votre ou vos cuvettes. Vous essayez d’éviter d’avoir des particules dans la cuvette afin que la diffusion n’influence pas la lecture.
6. Enregistrez l’Abs420. Cette valeur doit être inférieure à 1 et supérieure à 0,05. Si elle est un peu en dehors de cette plage, ne vous en faites pas.

Calculez les unités de Miller comme suit :

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{de la culture échantillonnée})*(\text{volume } )*(\text{temps de réaction}))} }. }

Commentaires sur le test

• Reshma 11:28, 15 Octobre 2007 (CDT) : Miller recommande une culture avec une OD600 = 0,28 à 0,70. Cependant, il affirme que les cultures de nuit peuvent également être utilisées mais que les cellules à croissance exponentielle donnent des essais plus précis .

• Quand la réaction est-elle faite ? Je n’ai jamais trouvé de bonne réponse à cette question dans la littérature. Si je laisse une réaction aller jusqu’à son terme, j’ai mesuré une Abs420 de ~2-3. Bien sûr, c’est en dehors de la plage de fiabilité du spectrophotomètre, mais cela donne une indication de la portée de la réaction. J’ai obtenu des données reproductibles lorsque la couleur jaune était juste détectable avant l’ajout de la solution d’arrêt jusqu’à environ la couleur du bouillon LB avant l’arrêt. Rappelez-vous que vous avez besoin du substrat pour saturer l’enzyme au cours de la réaction, donc ne les laissez pas aller trop loin. Je fais couramment trois mesures distinctes pour chaque culture et j’en fais la moyenne.
  • Reshma 11:28, 15 octobre 2007 (CDT) : Miller recommande que la lecture de l’OD420nm soit idéalement de 0,6 à 0,9 .

• Fréquemment, les gens utilisent des cuvettes en plastique jetables pour mesurer à la fois la turbidité de la culture et le jaune o-nitropénol. D’après mon expérience, les cuvettes jetables ont une optique HORRIBLE : oui, elles sont claires, mais le trajet de la lumière est pathétiquement déformé (il suffit de regarder à travers l’une d’elles un objet distant). Ce n’est pas un gros problème si la même cuvette est utilisée pour le blanc et l’échantillon et si elle est orientée de la même manière dans le spectrophotomètre. Le problème survient lorsque de nombreux échantillons différents sont mesurés dans des cuvettes différentes. Les valeurs peuvent varier GRANDEMENT même pour la même culture mesurée dans différentes cuvettes. Je recommande d’utiliser soit une cuvette en verre ou en quartz de haute qualité, soit de mesurer les échantillons dans un lecteur de plaques utilisant des plaques à 96 puits à fond plat. J’ai constaté que mon erreur en pipettant 150 μL de culture pour les mesures Abs600 était BEAUCOUP moins importante qu’en utilisant des cuvettes jetables. Bien sûr, la turbidité mesurée doit être calibrée en cellules/mL comme avec une cuvette de 1 cm.

• En essorant les échantillons et en retirant soigneusement le un échantillon du surnageant, vous évitez d’avoir à mesurer la diffusion à 550nm et à deviner ce qu’elle serait à 420nm.

• Si votre réaction a trop de β-Gal, le tube deviendra jaune en quelques minutes (ou même quelques secondes). C’est trop rapide. L’une des plus grandes contributions à l’erreur sera votre estimation du temps de réaction. En réglant les conditions de la réaction de façon à ce qu’elle dure environ une heure, les erreurs de temps deviennent insignifiantes. Si vous devez ralentir la réaction, vous pouvez utiliser moins de cellules et augmenter la quantité de tampon de perméabilisation pour que le volume soit toujours de 100 μL. Sinon, vous pouvez réorganiser le site de liaison au ribosome de votre construction β-Gal pour l’affaiblir. J’ai constaté que si mes cellules fabriquaient 40 000 unités de Miller de β-Gal, elles étaient très malades à cause du stress de traduction. Il était préférable dans ce cas d’affaiblir la traduction de l’ARNm β-Gal.
  • Je fais ces réactions comme je fais de la cinétique enzymatique. Je commence les échantillons à 10 secondes d’intervalle (avec le décompte du temps), il est donc possible d’obtenir des temps de réaction précis même si vous ne laissez vos réactions se dérouler que pendant quelques minutes. J’obtiens des résultats très reproductibles avec des temps de réaction de 1,5 à 30 minutes. Une fois que vous avez une idée de la durée de vos réactions, il est facile de regrouper les échantillons qui auront besoin du même temps de réaction. Faire chaque échantillon en triple exemplaire vous donnera une certaine confiance dans la reproductibilité de votre timing.–Kathleen 16:43, 14 décembre 2005 (EST)

• Voici un exemple de données réelles que j’ai obtenues en utilisant ce test. Il s’agissait d’une expérience en temps réel. À chaque fois, j’ai prélevé 1 mL de chacune de mes cultures, j’ai mesuré l’OD600, j’ai prélevé trois aliquotes de 20 µL directement dans la cuvette et j’ai ajouté chacune à 80 µL de solution de perméabilisation. J’ai effectué le test exactement comme décrit ci-dessus, et tous les échantillons ont été conservés à température ambiante jusqu’à la fin de la série chronologique. L’OD600 de ces cultures a varié de 0,4 à 4 (dans mon spécimen) au cours de cette expérience et les temps de réaction pour les dosages β-Gal ont varié de 2 à 25 min. Les trois dosages β-Gal individuels pour chaque point de temps pour chaque culture (symboles rouges ou noirs) sont reportés dans le graphique pour illustrer la reproductibilité du dosage dans chaque expérience.–Kathleen

Recettes

Solution de perméabilisation

Vous avez besoin de 80 μL par échantillon.

• 100 mM de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)
  • (Le protocole de Zhang a 200 mM de phosphate de sodium. Je n’ai jamais pu le mettre en solution avec les autres composants, peu importe ce que j’ai essayé, alors j’ai reculé à 100 mM. J’ai même utilisé 50 mM sans changement détectable.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/mL CTAB (bromure d’hexadécyltriméthylammonium)
• 0.4 mg/mL de désoxycholate de sodium
• 5,4 μL/mL de bêta-mercaptoéthanol

Solution de substrat

Vous avez besoin de 600 μL par échantillon.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrophényl-β-D-Galactoside (ONPG)
• 2.7 μL/mL de β-mercaptoéthanol

(Le protocole de Zhang contient également 20 μg/mL de CTAB et 10 μg/mL de désoxycholate. Je les laisse de côté en me disant qu’il y en a encore beaucoup de la solution de perméabilisation et, s’ils ne sont pas encore morts, ils ne le seront pas.)

Solution d’arrêt

Vous avez besoin de 700 μL par échantillon.

• Carbonate de sodium 1 M (Na2CO3)

Le pH élevé de la solution d’arrêt dénature le β-Gal et double approximativement la couleur jaune de la réaction.