BiomedicalReports

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur maligne primaire des hépatocytes, représentant 80% de tous les cancers primaires du foie. Les patients atteints de maladies chroniques du foie associées à des infections par le virus de l’hépatite B ou de l’hépatite C développent fréquemment un CHC (2). Il y a eu une amélioration des techniques chirurgicales et le développement de plusieurs modalités de traitement non chirurgicales ; cependant, l’amélioration du pronostic extrêmement mauvais des patients atteints de CHC reste limitée (3).

Des recherches approfondies sur l’apoptose, également connue sous le nom de mort cellulaire programmée, au cours des dernières décennies ont mis en évidence ce processus comme une méthode appropriée pour la thérapie du cancer (4,5). Cependant, de nombreux médicaments ayant des effets apoptotiques sont actuellement limités pour le traitement du cancer en raison de leurs effets secondaires. Par conséquent, il est important d’identifier des agents thérapeutiques nouveaux et fiables qui peuvent induire efficacement l’apoptose des cellules cancéreuses dans le traitement des patients atteints de CHC.

Récemment, la médecine traditionnelle chinoise a animé un rôle important dans le traitement des tumeurs malignes en raison de ses effets significativement améliorés et des effets secondaires plus faibles (6). Le gecko, l’une des médecines traditionnelles chinoises les plus populaires, a été utilisé comme un médicament brut pour traiter les tumeurs malignes dans la pratique clinique (7-9). Les peptides bruts de gecko et l’extrait éthanolique de gecko peuvent induire l’apoptose dans les cellules humaines de HCC et exercer une activité antitumorale chez les souris porteuses d’ascite H22, ce qui a été démontré dans nos études précédentes (10,11). L’objectif de la présente étude était d’examiner l’effet apoptotique et le mécanisme sous-jacent du mélange de peptides de gecko (GPM) dans les lignées cellulaires HepG2 de carcinome hépatique humain in vitro.

Matériels et méthodes

Matériels médicaux et réactifs

Gecko japonicus a été acheté à BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co., Ltd. (Anhui, Chine). La lignée cellulaire humaine de CHC HepG2 a été présentée par le Medical Science ResearchInstitute of Henan (Henan, Chine).

Le bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT)et le Hoechst 33258 ont été achetés chez Sigma (St. Louis, MΟ, USA).Le kit de dosage de l’activité caspase a été acheté auprès du BeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, Chine). L’anticorps primaire contre le facteur induisant l’apoptose (AIF) a été acheté auprès de BosterInc. (Wuhan, Hubei, Chine), et l’anticorps contre la β-actine a été acheté auprès de Proteintech (Wuhan, Hubei, Chine). L’anticorps primaire contre le cytochrome c (Cyt c) et l’anticorps secondaire conjugué à la souris ou au lapin ont été achetés auprès de Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co, Ltd. (Beijing, Chine).

Le lecteur de microplaques était le produit de BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, USA). Les microscopes à fluorescence et inversés BX41 étaient le produit d’Olympus (Tokyo,Japon).

Préparation des GPM

Les poudres de gecko (100 g) ont été mélangées avec 400 md’eau doublement distillée et transformées en un homogénat. Après centrifugation à 5 600 × g pendant 5 min, le précipité a été recueilli et trempé dans 400 ml de solution d’éthanol à 55%. Le surnageant a été obtenu après centrifugation à 5 600 × g pendant 5 minutes, et a été évaporé sous pression réduite à 55°C. Ensuite, des poudres jaunes ont été recueillies après lyophilisation du liquide résiduel. La chromatographie par filtration sur gel (SephadexG-25) a été utilisée pour purifier les poudres jaunes, et finalement, le GPM a été recueilli.

Culture cellulaire et observation morphologique

Les cellules HepG2 ont été cultivées dans le milieu Dulbecco’s modifiedEagle’s complété par 10% de sérum bovin fœtal, 100 U/mlpenicilline et streptomycine à 37°C dans un incubateur humidifié à 5%CO2. Le milieu de culture a été remplacé tous les 2 jours et les cellules en phase de croissance logarithmique ont été utilisées pour les expériences suivantes. Les cellules HepG2 (3,0×104 cellules/ml) ont été incubées avec différentes concentrations de GPM pendant 24h. Les cellules ont été observées et les images capturées par un microscope inversé à contraste de phase pour détecter les changements morphologiques.

Dosage MTT

Les cellules HepG2 ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 6,0×103 cellules/puits. Après une incubation de 20, 44 et 68 heures, respectivement, 20 µl de réactif MTT (5 mg/l) ont été ajoutés par puits et incubés pendant 4 heures supplémentaires. Le surnageant a été remplacé par 200 µl de diméthylsulfoxyde et l’absorbance (A) à 490 nm a été mesurée avec un lecteur universel de microplaques ELX800. Le taux d’inhibition de la prolifération cellulaire (IR) était le suivant : IR = (1-AGPM/Acontrôle) ×100%.

Coloration au Hoechst 33258

Après une nuit de culture dans une plaque à 6 puits, les cellulesHepG2 ont été traitées avec différentes concentrations de GPM (0,0,06 ou 0.08 mg/ml) et 0,003 mg/ml de 5-Fu dans un milieu de culture frais à37°C pendant 24 h. Les cellules ont été lavées deux fois avec du phosphate-bufferedsaline (PBS) et colorées avec la solution de coloration Hoechst 33258 (10µg/ml). Après 15 min d’incubation dans l’obscurité, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS froid et ont été examinées au microscope à fluorescence.

Analyse de l’activité de la caspase

La détermination de l’activité de la caspase-3 et de la caspase-9 a été réalisée avec le kit de dosage de l’activité de la caspase, en suivant le protocole du fabricant. Après exposition à plusieurs concentrations de GPM (0, 0,06 ou 0,08 mg/ml) et 0,003 mg/ml de 5-Fu pendant 24 h, les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans un tampon de lyse. Ensuite, les cellules ont été incubées dans le tampon de lyse pendant 20 minutes et ont été centrifugées à 16 000 × g à 4°C pendant 3 minutes. Les surnageants ont été recueillis et les niveaux de protéines ont été déterminés par la méthode Bradford, et les activités de la caspase-3 et de la caspase-9 ont été mesurées par le tampon de réaction (contenant du dithiothréitol) et les peptides de substrat de caspase Ac-DEVD-pNA et Ac-LEHD-pNA, respectivement. Les valeurs obtenues à la densité optique à 405 nm ont été exprimées comme:AGPM/AContrôle.

Analyse Western blot

Les cellules HepG2 ont été traitées avec GPM (0, 0,06 ou 0,08mg/ml) et 0,003 mg/ml de 5-Fu pendant 24 h, respectivement. En bref, les cellules ont été traitées avec un tampon de lyse sur la glace pendant 30 minutes, et ont été centrifugées à 13 000 × g pendant 30 minutes à 4°C. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode Bradford. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE à 12% et ont été transférées sur une membrane PVDF. La membrane PVDF a été bloquée avec 5% de lait sec non gras dans du PBS pendant 1h à 37°C, lavée 3 fois avec du Tris-buffered saline contenant 0,1% de Tween-20 (TBST) pendant 15 min, puis incubée avec les anticorps primaires : Caspase-3 (cat. no. sc-7148 ; 1:200, lapin polyclonal anti-humain), caspase-9 (cat. no. sc-8355 ; 1:200, lapin polyclonal anti-humain), Cyt c (cat. no. sc-13156 ; 1:500, anti-humain monoclonal de souris), AIF (cat. no. PB0388 ; 1:200, anti-humain polyclonal de lapin) et β-actine (cat. no. 66009-1-Ig;1:5,000, anti-humain monoclonal de souris) pendant la nuit à 4°C.Ensuite, les échantillons ont été lavés avec TBST pendant 30 min, et la membrane a été incubée avec les anticorps secondaires correspondants pendant 1 h. La chimioluminescence a été détectée avec ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Analyse statistique

Les données expérimentales sont représentées sous forme de moyenne ±écart-type. Les différences entre les groupes ont été examinées par une analyse de variance à sens unique à l’aide du système SPSS 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). P<0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative.

Résultats

La GPM inhibe la prolifération des cellulesHepG2

L’effet de la GPM sur la croissance des cellules HepG2 a été évalué par le test MTT. Les résultats ont montré que le GPM inhibait significativement la prolifération des cellules HepG2 de manière dose et temps-dépendante (Fig. 1). Après traitement avec GPM pendant 24, 48 ou 72 h, les valeurs deIC50 étaient de 0,154, 0,133 et 0,051 mg/ml, respectivement.Les cellules traitées avec GPM ont présenté une morphologie arrondie, un rétrécissement et une perte d’attachement (Fig. 2).

Effets de GPM sur la nucléarmorphologie

La morphologie apoptotique des cellules a été identifiée par colorationHoechst 33258. Comme le montre la Fig.3, les changements morphologiques des caractéristiques apoptotiques, tels que la condensation nucléaire, la condensation chromosomique et les corps apoptotiques granulaires dans les cellules traitées par GPM ont également été observés par microscopie à fluorescence.

Effets de GPM sur l’activité de la caspase

En tant qu’initiateurs et exécuteurs de la mort cellulaire,les cystéines protéases ont un rôle important dans le processus apoptotique(12). Comme le montre la Fig. 4, le traitement par GPM a provoqué une augmentation significative dose-dépendante de l’activité de la caspase-3 et de la caspase-9,suggérant un effet apoptotique de GPM dans les cellules HepG2.

Effets de GPM sur les niveaux d’expression des protéines apoptotiques

Comme le montre la Fig. 5,le western blotting a démontré que la libération de Cyt c et d’AIF de la mitochondrie au cytosol a augmenté, tandis que les niveaux d’expression de la caspase-3 et de la caspase-9 ont été régulés à la hausse par le traitement par GPM d’une manière dose-dépendante. Les changements dans les protéines étaient significativement différents par rapport au groupe témoin (Fig. 6) (P<0,05).

Discussion

Au cours des dernières décennies, l’incidence du cancer a augmenté de façon marquée, ce qui cause de graves dommages à la santé humaine(13). Bien que les stratégies thérapeutiques contemporaines aient montré une capacité anticancéreuse évidente, des effets secondaires graves restent inévitables. La recherche de nouveaux agents antitumoraux plus efficaces mais moins toxiques a suscité une attention croissante (14).L’extraction de peptides de médicaments naturels pour le traitement du cancer a fait l’objet de nombreux rapports dans le monde entier et est prometteuse pour le traitement du cancer. Les peptides pourraient jouer un rôle de diverses manières, comme l’inhibition de la prolifération des tumeurs, l’arrêt du cycle cellulaire, la suppression de l’angiogenèse tumorale et l’induction de l’apoptose (15). Le gecko est largement utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise depuis des centaines d’années. Dans nos études précédentes, les peptides bruts de gecko ont montré une activité antitumorale efficace sur les souris porteuses de H22 et la lignée cellulaire HepG2 (16,17).Cependant, les effets du GPM sur les hépatocytes humains restent à élucider. Par conséquent, l’objectif de la présente étude était de révéler davantage le mécanisme moléculaire sous-jacent par lequel le GPM induit l’apoptose dans la lignée cellulaire humaine de CHC HepG2.

Dans la présente étude, le test MTT a révélé que le GPM pouvait inhiber la croissance des cellules HepG2 de manière dépendante de la dose et du temps. D’autres expériences ont démontré que cetteinhibition était due au traitement par GPM, qui a induit une mort cellulaire dose-dépendante avec des changements morphologiques typiques. Ces données suggèrent que le GPM peut être un agent potentiellement efficace pour le traitement du cancer.En utilisant la coloration Hoechst 33258, il a été démontré que la mort cellulaire induite par le GPM dans les cellules HepG2, qui appartient à l’apoptose, pour les niveaux d’expression de la caspase-3 et de la caspase-9 était augmentée après le traitement par le GPM. L’analyse par Western blotting a également montré que le GPM pouvait stimuler la libération de Cyt c et d’AIF depuis les mitochondries vers le cytosol, ce qui suggère que l’apoptose induite par le GPM dans les cellules HepG2 est médiée par la voie apoptotique mitochondriale.

L’apoptose est le principal mécanisme de contrôle par lequel les cellules meurent dans de nombreuses conditions, comme la réparation incorrecte des dommages à l’ADN (18). Ce processus cellulaire autodestructeur est essentiel pour le développement des organes, le remodelage des tissus, la régulation immunitaire et plusieurs maladies (19). De nombreux agents antitumoraux exercent leurs effets thérapeutiques en induisant l’apoptose (20-24). Les mitochondries ont un rôle essentiel dans la régulation de l’apoptose cellulaire, et certaines protéines sont étroitement associées à l’apoptose cellulaire dans l’intermembrane (25).

L’ultrastructure mitochondriale est normale pendant l’apoptose cellulaire, mais sa fonction a considérablement changé.Le dysfonctionnement mitochondrial induit l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale et libère des protéines mitochondriales apoptogènes, telles que AIF (26) et Cyt c (27). Normalement, les protéines AIF et Cyt c sont situées dans l’espace intermembranaire des mitochondries, tandis que sous l’action de divers AIF, elles sont libérées des mitochondries vers le cytoplasme. Les AIF sont finalement transférés vers le noyau, provoquant les changements caractéristiques de l’apoptose. AIF a été la première protéine découverte qui a médié la mort cellulaire indépendante de la caspase (28). Le cyt c est libéré dans le cytosol et induit une apoptose dépendante des caspases, conduisant à l’activation des caspases et à l’apoptose (29,30). L’AIF pourrait augmenter les signaux apoptotiques en favorisant la libération mitochondriale de Cyt c. Bien que l’apoptose induite par l’AIF ne dépende pas de la caspase, il existe une action croisée, une synergie et même un antagonisme entre l’AIF, la caspase et Cyt c. En raison des différents signaux de mort et des types de cellules, la régulation de l’apoptose cellulaire est en fait accomplie par diverses interactions et l’ensemble du réseau de signaux, qui nécessitent une étude plus approfondie.

La caspase, une famille de protéases à cystéine, est une section intégrale de la voie apoptotique. L’induction de l’apoptose est associée à l’activation de la caspase (31). La caspase-3 se trouve en aval de l’apoptose cellulaire, et la caspase-9 est la caspase apicale dans la voie de l’apoptose initiée par la mitochondrie (32). L’activation de la caspase-3 est corrélée à l’activation de la caspase-9 (33).La libération de Cyt c déclenche l’activation de la caspase-9 par la formation de l’apoptosome. L’activation ultérieure de la caspase-9 initiatrice provoque le clivage de la caspase-3 effectrice, qui active ensuite la DNase et provoque la fragmentation de l’ADN dans le noyau (34). En résumé, la caspase-3 est une caspase exécutrice qui peut être activée par la voie mitochondriale suivante impliquant l’activation de la caspase-9 en raison de la libération de Cyt c dans le cytosol (35), provoquant finalement la mort cellulaire programmée.

En conclusion, le GPM a probablement induit la mort cellulaire apoptotique dans les cellules HepG2 en activant la voie apoptotique mitochondriale. Ces résultats démontrent que le GPM peut être un agent thérapeutique potentiel pour le traitement du CHC.

Reconnaissance

La présente étude a été soutenue par une subvention des programmes clés pour le développement des sciences et des technologies de la province du Henan (no 142102310031).

Glossaire

Abréviations

Abréviations :

GPM	mélange de peptides du gecko
Cyt. c	cytochrome c

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