Brainbow
Les techniques Brainbow reposent sur la recombinaison Cre-Lox, dans laquelle la protéine Cre recombinase conduit l’inversion ou l’excision de l’ADN entre les sites loxP. La méthode Brainbow originale comprend à la fois Brainbow-1 et Brainbow-2, qui utilisent différentes formes de recombinaison cre/lox. Brainbow-3, une version modifiée de Brainbow-1, a été développée en 2013. Pour tous les sous-types Brainbow, l’expression d’une XFP donnée est un événement stochastique, ou aléatoire.
Brainbow-1 utilise des constructions d’ADN avec différents gènes de protéines fluorescentes (XFP) séparés par des formes mutantes et canoniques de loxP. Cela crée un ensemble de possibilités d’excision mutuellement exclusives, puisque la recombinaison médiée par cre ne se produit qu’entre des sites loxP identiques. Une fois la recombinaison effectuée, la protéine fluorescente qui reste directement après le promoteur est exprimée de manière unique. Ainsi, une construction avec quatre XFP séparées par trois sites loxP différents, trois événements d’excision et la construction originale peut produire quatre protéines fluorescentes différentes.
Brainbow-2 utilise l’excision et l’inversion Cre pour permettre de multiples possibilités d’expression dans une construction donnée. Dans un segment d’ADN avec deux XFP orientées de façon opposée, Cre induira un événement d’inversion aléatoire qui laissera une protéine fluorescente dans l’orientation appropriée pour l’expression. Si deux de ces séquences inversables sont alignées, trois événements d’inversion différents sont possibles. Lorsque les événements d’excision sont également pris en compte, une des quatre protéines fluorescentes sera exprimée pour une combinaison donnée d’excisions et d’inversions de Cre.
Brainbow-3 conserve le format loxP de Brainbow-1, mais remplace les gènes RFP, YFP et CFP par mOrange2, EGFP et mKate2. Les gènes mO2, EGFP et mK2 ont été choisis parce que leurs spectres d’excitation et d’émission fluorescents se chevauchent très peu et parce qu’ils présentent une homologie de séquence minimale, ce qui permet de concevoir des anticorps sélectifs pouvant être utilisés pour les détecter dans des protocoles immunohistochimiques. Brainbow-3 aborde également la question du remplissage inégal des neurones par les XFP en utilisant des dérivés farnésylés des XFP, dont le trafic vers les membranes neuronales est plus régulier.
Brainbow est mis en œuvre in vivo en croisant deux souches d’organismes transgéniques : une qui exprime la protéine Cre et une autre qui a été transfectée avec plusieurs versions d’une construction loxP/XFP. L’utilisation de plusieurs copies du transgène permet aux XFP de se combiner d’une manière qui peut donner l’une des quelque 100 couleurs différentes. Ainsi, chaque neurone est étiqueté avec une teinte différente basée sur son expression combinatoire et stochastique donnée de protéines fluorescentes.
Afin d’élucider les modèles d’expression XFP différentielle dans une forme visible, les tranches de cerveau sont imagées avec la microscopie confocale. Lorsqu’il est exposé à un photon avec sa longueur d’onde d’excitation particulière, chaque fluorophore émet un signal qui est collecté dans un canal rouge, vert ou bleu, et la combinaison de lumière résultante est analysée avec un logiciel d’analyse de données. La superposition de neurones colorés de manière différentielle permet de démêler visuellement des circuits neuronaux compliqués.
Brainbow a principalement été testé chez la souris à ce jour ; cependant, la technique de base décrite ci-dessus a également été modifiée pour être utilisée dans des études plus récentes depuis l’avènement de la méthode originale introduite en 2007.
MiceEdit
Le cerveau de la souris compte 75 000 000 de neurones et ressemble davantage à un cerveau humain que la drosophile et d’autres organismes couramment utilisés pour modéliser cette technique, comme C. elegans. Les souris ont été les premiers organismes chez lesquels la méthode Brainbow de neuroimagerie a été employée avec succès. Livet et al. (2007) ont développé deux versions de souris Brainbow en utilisant Brainbow-1 et Brainbow-2, qui sont décrites ci-dessus. En utilisant ces méthodes pour créer une carte complète et suivre les axones d’un muscle de souris, il est nécessaire de collecter des dizaines de milliers d’images et de les compiler en piles pour créer un schéma complet. Il est ensuite possible de tracer chaque axone moteur et ses contacts synaptiques pour construire un connectome complet du muscle.
D’autres exemples de neurones examinés à l’aide de la technique Brainbow chez des souris transgéniques sont situés dans le nerf moteur innervant les muscles de l’oreille, les trajets des axones dans le tronc cérébral et le gyrus denté de l’hippocampe.
DrosophilaEdit
La complexité du cerveau de la drosophile, composé d’environ 100 000 neurones, en fait un excellent candidat pour la mise en œuvre de techniques de neurophysiologie et de neurosciences comme Brainbow. En fait, Stefanie Hampel et al. (2011) ont combiné Brainbow avec des outils de ciblage génétique pour identifier des neurones individuels dans le cerveau de la drosophile et diverses lignées neuronales. L’un des outils de ciblage génétique était un système d’expression binaire GAL4/UAS qui contrôle l’expression de UAS-Brainbow et cible l’expression sur de petits groupes de neurones. L’utilisation de méthodes « Flip Out » a permis d’augmenter la résolution cellulaire de la construction rapporteur. L’expression des protéines fluorescentes, comme avec le Brainbow original, dépendait de la recombinaison Cre correspondant à des sites lox appariés. Hampel et al. (2011) ont également développé leur propre variation de Brainbow (dBrainbow), basée sur le marquage des épitopes par des anticorps plutôt que sur la fluorescence endogène. Deux copies de leur construction produisent six couleurs vives et séparables. Ceci, ainsi que des simplifications dans l’attribution des couleurs, leur a permis d’observer les trajectoires de chaque neurone sur de longues distances. Plus précisément, ils ont tracé les neurones moteurs depuis le lobe antennaire jusqu’aux jonctions neuromusculaires, ce qui leur a permis d’identifier les cibles musculaires spécifiques de chaque neurone.
En définitive, cette technique permet de cartographier efficacement les circuits neuronaux de la drosophile, de sorte que les chercheurs sont en mesure de découvrir davantage d’informations sur la structure cérébrale de cet invertébré et la façon dont elle est liée au comportement qui en découle.