Comprendre la base structurelle de la restriction du VIH-1 par le double-domaine APOBEC3G de pleine longueur.domaine APOBEC3G

Caractéristiques structurelles globales de la fl rA3G

Un obstacle majeur dans les études structurelles des protéines APOBEC à double domaine fl a été la mauvaise solubilité-les formes sauvages sont souvent purifiées soit sous forme d’oligomères non homogènes, soit sous forme de grands agrégats à plus forte concentration. Afin d’obtenir une protéine fl A3G de bonne qualité pour la détermination de sa structure, nous avons examiné les homologues A3G de différentes espèces de primates et avons découvert que la protéine A3G du singe rhésus (rA3G) avait une meilleure solubilité. Deux constructions mutées de fl rA3G (appelées FKL et E/Q) ont donné des protéines bien conformées et des cristaux dans différentes conditions (tableau supplémentaire 1) qui ont diffracté à 2,47 et 2,40 Å, respectivement (tableaux supplémentaires 1 et 2, figure supplémentaire 1). 1), les mutations supplémentaires F126Y sur la boucle 7 de CD1, K180S/L184S sur CD1 h6, et la délétion de 8 résidus de la boucle 3 de CD2 (comme dans la construction FKL, Tableau supplémentaire 1, Fig. supplémentaire 1B). Il convient de noter que K128 de rA3G, qui agit comme une barrière pour la transmission inter-espèces, est muté en un résidu d’acide aspartique (D128) comme dans A3G humain (hA3G)36. Les constructions contiennent également une mutation catalytique de E259 en Q/A pour éviter une toxicité potentielle pendant l’expression de la protéine recombinante. Les résidus mutés et leurs emplacements sur la structure sont indiqués dans la figure supplémentaire 1B. Dans les deux structures, CD1 et CD2 sont repliés en domaines autonomes reliés par un court lieur de 5 résidus (résidus R194 à D198) (Fig. 1a, b). Les deux structures, malgré une similarité structurelle globale (Fig. 1a, b), montrent des différences évidentes dans les conformations de CD2 et l’orientation de l’emballage entre CD1 et CD2 (Fig. 1c, Fig. supplémentaire 2A).

Les deux structures rA3G FKL et E/Q ont la même structure CD1 canonique et se superposent bien l’une sur l’autre (figure supplémentaire 2B, rmsd de 0,445 Å). Les différences de conformation beaucoup plus importantes dans chaque domaine CD2 entraînent une rmsd de superposition de 0,862 Å. Lorsque l’on aligne les structures FKL et E/Q par le biais de leur domaine CD1, le domaine CD2 de la structure E/Q présente une rotation de ~29° par rapport au CD2 de la structure FKL, ce qui entraîne un déplacement du domaine CD2 E/Q de ~15 Å vers le bas et de ~8 Å vers le CD1, et une interaction d’emballage beaucoup plus étroite avec le CD1 (figure supplémentaire 2 A). L’interface d’emballage globale CD1-CD2 présente une surface enfouie de ~623 Å2 pour la structure FKL et de ~700 Å2 pour la structure E/Q. L’emballage CD1-CD2 plus serré dans la structure E/Q ne conduit qu’à une surface enfouie légèrement supérieure à celle de la structure FKL, probablement en raison du repliement et de la densité manquante des éléments structurels de localisation de l’interface (h2-boucle3) de son CD2.

Deux types d’interactions entre les domaines CD1 et CD2

Alors que la structure FKL montre un repliement canonique de son domaine CD2 (figure supplémentaire 2C), la structure E/Q montre une altération significative de la conformation du CD2 (figure supplémentaire 2D), avec des changements majeurs sur l’hélice 2 (h2), la boucle 3, la boucle 4 et le centre actif Zn. La longue h2 du CD2 dans la structure FKL (figure supplémentaire 2C) est devenue une hélice courte de 310 (h2′) dans la structure E/Q (figure supplémentaire 2D), ce qui entraîne un étirement désordonné de 14 résidus couvrant des parties de la boucle 3 et de la h2 (résidus A246 à E259) (figure supplémentaire 1A). Le passage à une structure h2 courte 310 et à une structure de bobine aléatoire étendue est nécessaire pour éviter le clash dans cette conformation d’emballage serré (Fig. 1e). Cependant, cela perturbe également la conformation du centre actif Zn de CD2 dans les régions de h2 et de la boucle 3 qui deviennent désordonnées, ce qui entraîne une absence de coordination Zn (figure supplémentaire 2D). L’absence de coordination Zn est observée dans un seul autre APOBEC, la structure CD2 de APOBEC3F (A3F)46,47. Cependant, les structures A3F-CD2 contenant du Zn ou absentes sont essentiellement identiques, qui s’alignent également bien sur plusieurs autres structures APOBEC (figure supplémentaire 2E), tandis que la CD2 E/Q est unique dans ses boucles h2 repliées 3 et 4 et dans la conformation Zn-centre (figures supplémentaires. 2E, F).

Bien qu’il soit possible que la perte de Zn et le repli de CD2 dans la structure E/Q soient le résultat des mutations dans cette construction, nous avons cherché à savoir si le variant E/Q avait une activité de catalyse défectueuse. La réversion de E259Q dans la construction E/Q en E259 catalytique WT (construction E/Q*) a rendu la pleine activité de la variante dans le test de désamination utilisant des lysats d’expression de cellules HEK293T (figure supplémentaire 3). De plus, E/Q* portant les mutations individuelles F126Y, K180S/L184S, ou CD2Δloop3 (comme dans la structure FKL) sont toutes actives, même si l’activité de la construction FKL* (avec E259A ramené à E259) avec les mutations combinées est inférieure à E/Q* et WT. Ces résultats suggèrent que, même si la structure E/Q cristallisée, dépourvue de Zn dans le domaine CD2, représente un état structural A3G catalytiquement inactif, le retour du résidu catalytique à E259 peut restaurer complètement son activité désaminase comparable à celle de WT. Les mutations combinées dans le FKL affectent partiellement son activité catalytique.

En raison de la différence de ~29° dans l’angle relatif de rotation de l’emballage entre chaque domaine dans les structures FKL et E/Q, les interactions moléculaires détaillées entre CD1 et CD2 diffèrent entre les deux structures. Les domaines CD1 et CD2 dans la structure FKL interagissent l’un avec l’autre principalement par h3, h4, et la boucle 7 de CD1 et h1, h2, β2, et la boucle 3 de CD2 (Fig. 1a, d). Dans la structure E/Q, les deux domaines interagissent principalement par l’intermédiaire de h3, h4, et h6 de CD1 avec h2′, β2, la boucle 4 et la boucle 10 de CD2 (Fig. 1b, e). Par conséquent, environ 40 % des résidus d’interaction entre CD1 et CD2 diffèrent dans les deux structures (voir la liste complète des résidus d’interaction dans la figure supplémentaire 4), et même lorsque les mêmes résidus participent à cette interaction, ils établissent souvent des contacts de liaison différents en raison du changement d’angle de tassement entre les deux domaines. La capacité d’empaqueter les domaines CD1 et CD2 avec différents angles et interactions de résidus indique un certain degré de plasticité dans l’arrangement des domaines de fl A3G.

Dimère rA3G pleine longueur et caractéristiques de la zone de dimérisation

La construction E/Q a été cristallisée dans différentes conditions de pH et de sel (tableau supplémentaire 1), mais a constamment montré la même structure et la dimérisation via des interactions CD1-CD1 (Fig. 2a, b), principalement par l’emballage direct de plusieurs résidus sur h6 (K180, L184, A187), la boucle 1 (I26) et la boucle 7 (F126, W127) des deux sous-unités (Fig. 5A, B supplémentaires). Il est intéressant de noter que ces interactions sont identiques à celles précédemment rapportées pour le domaine rA3G-CD1 seul18, malgré l’inclusion de la mutation K128D qui est critique pour faire passer rA3G d’insensible au Vif du VIH-1 à sensible à la dégradation. Il convient de noter qu’une telle dimérisation de fl rA3G ne conduit qu’à une faible augmentation de la plus grande dimension de 85 Å d’un monomère à 95 Å d’un dimère (Fig. 2a, b).

Un examen détaillé des résidus alignés de chaque côté de la zone d’interface dimérique révèle deux caractéristiques saillantes. Premièrement, un total de 18 résidus positifs/polaires et hydrophobes sont alignés autour de la jonction du dimère rA3G d’une manière adaptée à l’interaction avec des acides nucléiques monocaténaires tels que l’ARN (Encart B de la figure 2). Ces 18 résidus sont organisés en deux ensembles, avec le premier ensemble dans le sens des aiguilles d’une montre en partant du monomère supérieur (en vert), R24, H181, N177, N176, K180, et en continuant vers le monomère inférieur (en bleu clair) W127, Y125, Y124, et S28, puis avec l’ensemble miroir de ces mêmes résidus. Deuxièmement, par la dimérisation, le R24 et les résidus positifs voisins K180 et H181 de chaque monomère sont positionnés de manière rapprochée dans l’espace, avec une distance d’environ 7 Å entre les deux résidus R24. Cet arrangement spatial augmente de manière significative les potentiels électrostatiques locaux (EP) d’environ +1,9 kT/e en tant que monomère à +8,3 kT/e en tant que dimère (Fig. 2c et Inset C, Fig. 2d et Inset D). La présence de résidus bien alignés convenant à la liaison d’acides nucléiques monocaténaires ainsi que le PEP positif amélioré autour de la jonction dimère observée impliquent fortement que cette zone peut lier l’ARN en tant que dimère, et suggère que la perturbation de cette interface de dimérisation A3G peut avoir un impact sur la liaison de l’ARN en perturbant le PEP amélioré (Fig. 2c) vers le PEP faible comme dans une forme monomère (Fig. 2d).

Effet de la mutation du dimère sur l’association et la multimérisation de l’ARN

Notre étude précédente sur le domaine CD1 seul a suggéré que les résidus de l’interface du dimère FWKL (F126, W127, K180, L184) peuvent être impliqués à la fois dans la dimérisation et la liaison de l’ARN, soit par interaction directe avec l’ARN, soit indirectement en générant une surface de liaison de l’ARN via la dimérisation18. L’inspection de la structure du dimère fl rA3G révèle que, tandis que les résidus FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) participent directement aux interactions de dimérisation (figure supplémentaire 5A), seul W127 est accessible pour le pi-stacking ou la liaison hydrogène avec une base d’acide nucléique, ce qui suggère que c’est W127 qui a le double rôle critique dans la dimérisation ou/et la liaison ARN, ce qui a également été suggéré par des études mutationnelles précédentes15,18,40,48.

La boucle 7 de rA3G est située près de l’interface de dimérisation et contient un ensemble de résidus hydrophobes (Y124, Y125, et F126) qui s’entassent avec et stabilisent probablement W127 (Fig. 5B supplémentaire). Pour déterminer si la dimérisation est nécessaire à l’association de l’ARN et pour envisager le double rôle possible de W127, nous avons conçu un ensemble de mutants d’interface de dimère de rA3G qui laissent la boucle 7 inchangée (tableau supplémentaire 3, figures supplémentaires 5A, B). Ainsi, seuls les résidus d’interface enterrés en dehors de la boucle 7 ont été mutés, générant les mutants rM10, rM11 et rM15 (tableau supplémentaire 3). À titre de contrôle, nous avons également inclus un mutant rM9 avec des modifications à la fois sur la boucle 7 et h6 de CD1 (F126A-W127A-A187Y) qui devait entraîner un phénotype similaire à celui du mutant FWKL du CD1 seul18 précédemment rapporté, c’est-à-dire une perturbation à la fois de la dimérisation et de l’association avec l’ARN. Un rA3G de type quasi sauvage (WT) avec une commutation de boucle améliorant la solubilité sur la boucle 8 de CD1 et son mutant catalytiquement inactif correspondant (construction E/Q) ont également été inclus (tableau supplémentaire 3). L’association ARN et le statut d’oligomérisation de ces mutants après l’expression recombinante dans E. coli ont été examinés.

Après purification sur colonne d’affinité à partir des lysats cellulaires d’E.coli, l’association ARN de la protéine de fusion sumo-rA3G a été analysée par urée-PAGE dénaturante (Fig. 3a-c). Alors que le WT et le mutant E/Q (voies 7, 8 dans les Fig. 3b, c) avaient une association d’ARN similaire, tous les mutants de l’interface dimère (rM10, rM11, rM15 dans les voies 2, 3, 5, respectivement, dans les Fig. 3b, c) avaient une association d’ARN fortement réduite (voie 7) avant ou après le traitement à la RNase A, avec rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) et le mutant témoin rM9 montrant peu d’ARN détectable après avoir subi le même processus de purification (voies 1, 2, 5). La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) a révélé que rM10 et rM15, ainsi que le mutant témoin rM9, étaient élués principalement sous forme de monomère avant et après le traitement à la RNase A (Fig. 3d, e ; Fig. 6A, B supplémentaires), confirmant la perturbation de la dimérisation/multimérisation. Ainsi, ces résultats suggèrent que dans les conditions expérimentales, la mutation des résidus enfouis dans l’interface perturbe non seulement la dimérisation, mais affecte également l’association de l’ARN même lorsque la boucle 7 est inchangée, probablement en raison de la perte de la PEP améliorée suite à la perturbation du dimère (Fig. 2c, d).

Parce que nous n’avons pas pu réaliser le même type de test biochimique pour évaluer des mutants similaires dans l’A3G humain (hA3G) en raison de sa faible solubilité, nous avons généré un mutant chimère rA3G-hA3G (chimère h6) dans lequel le rA3G CD1 h6 est remplacé par le hA3G CD1 h6 (voir tableau supplémentaire 3). Cette chimère h6 s’est comportée de manière similaire à la rA3G WT pendant la purification en termes de dimérisation/multimérisation avant ou après le traitement à la RNase A (figures supplémentaires 7A, B), ainsi que d’association à l’ARN, en particulier après le traitement à la RNase A (figures supplémentaires 7C, D). Il est intéressant de noter que, comme le montre la figure supplémentaire 7A, B, alors que la protéine chimère H6 est également passée aux fractions dimère (D) et monomère (M) après le traitement par la RNase A (gel de SDS-PAGE dans la figure supplémentaire 7D), son profil SEC montre que la protéine chimère H6 est associée à l’ARN. 7D), son profil SEC présente des pics plus hétérogènes que celui de la rA3G WT, peut-être parce que la protéine chimère possède trois résidus (Y181, I183, I187) de la hA3G qui sont plus hydrophobes que ceux de la rA3G (H181, T183, A187), et donc moins stables/solubles. Ces résultats suggèrent la possibilité que CD1 h6 puisse être interchangeable entre rA3G et hA3G, ce qui conduit à la présence de la même zone PEP qui a essentiellement le même ensemble de résidus de surface sur les deux protéines.

Effet de la mutation PEP sur l’association et la multimérisation de l’ARN

Nous avons ensuite cherché à savoir si la surface PEP améliorée formée autour de la jonction du dimère (figure 2. Encart b) est importante pour l’association de l’ARN. Quatre résidus positifs/polaires centrés autour de R24 ont été mutés pour générer rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, tableau supplémentaire 3). Un mutant contenant uniquement R24T a également été inclus. L’association à l’ARN de rM12 était réduite par rapport à R24T et WT (voies 4, 6, 7 dans les Fig. 3b, c), indiquant un rôle de ces résidus dans la zone PEP dans l’amélioration de la liaison à l’ARN. Cependant, comparé à rM9 (F126A/W127A/A187Y), rM12 avait encore une quantité substantielle d’association d’ARN avant et après le traitement à la RNase A (voies 1, 4 dans la Fig. 3b, c), probablement en raison d’une perturbation partielle de la liaison de l’ARN à la zone PEP mais pas aux autres zones de rA3G. De façon inattendue, l’analyse SEC a révélé que rM12 avait un pic monomère majeur même avant le traitement à la RNase A (Fig. 3d, e, Fig. 6A, B supplémentaires), indiquant une perturbation de la dimérisation/multimérisation sans mutation directe de l’interface de dimérisation. Cet effet négatif de la mutation PEP sur l’association de l’ARN et la dimérisation/multimérisation a été confirmé par deux autres mutants rA3G contenant des mutations PEP, rM13 et rM14 (tableau supplémentaire 3, figure supplémentaire 7). Ces deux mutants ont montré différents niveaux de perturbation de l’association de l’ARN (figure supplémentaire 7A) et de dimérisation/multimérisation même avant le traitement à la RNase A dans la condition testée (profils SEC et gels dans la figure supplémentaire 7C).

Intéressant, même si le mutant unique R24T et WT ont montré des quantités similaires d’ARN associé détecté par les gels d’ARN dans les figures. 3b, c, l’analyse détaillée de SDS-PAGE de leurs fractions de pic SEC avant le traitement de RNase A a révélé que la plupart de la protéine R24T distribuée dans les fractions réparties autour de l’emplacement du pic monomère (M) (figure supplémentaire 6A), ce qui est en contradiction avec le WT qui est principalement distribué dans les fractions de volume vide (V). Ces résultats indiquent un changement du comportement d’association et de multimérisation de l’ARN avec une seule mutation R24T dans la zone PEP, ce qui est cohérent avec les études antérieures des mutations R24A14,30,38,40. Pris ensemble, ces résultats démontrent que, dans ces conditions d’essai, les résidus dans la zone PEP améliorée de la jonction du dimère (R24/S28/N176/N177) jouent un rôle important dans la médiation de l’association de l’ARN, et l’association de l’ARN par ces résidus est inversement nécessaire pour stabiliser la dimérisation et la multimérisation d’ordre supérieur ultérieure.

Effet des mutations PEP/dimères sur la liaison ARN/ADN in vitro

Les structures rA3G fl révèlent des zones supplémentaires avec des résidus chargés positivement en dehors de la zone PEP améliorée, comme indiqué sur la figure 2c. Bien que ces résidus chargés positivement à l’extérieur de la zone PEP puissent ne pas jouer un rôle majeur dans la formation de complexes A3G-ARN stables comme observé à partir de lysats cellulaires d’E. coli, ils peuvent encore contribuer à la liaison des substrats ssRNA et ssDNA définis. Pour le vérifier, chaque échantillon de protéine purifiée a été soumis à un traitement intensif à la RNase afin d’éliminer autant d’ARN lié que possible, et l’affinité de liaison avec des oligomères d’ARNs ou d’ADNs de 50 nt a été testée en utilisant un test de décalage de gel. Tous les mutants ont montré une liaison à 50 nt ssRNA ou ssDNA, et les constantes de dissociation estimées (Kd, tableau supplémentaire 3) ont indiqué que la plupart des mutants avaient une liaison réduite par rapport à WT et E/Q. Ces résultats indiquent que dans ce système reconstitué où des concentrations élevées de protéines et d’acides nucléiques étaient présentes, ces divers mutants de l’interface du dimère rA3G et de la zone PEP sont encore capables de se lier à l’ARN et à l’ADNss par l’intermédiaire d’autres résidus en dehors de la zone PEP à la jonction du dimère.

Dans l’ensemble, la réduction de la liaison de ces mutants est plus sévère pour la liaison de l’ADNss que pour la liaison de l’ARN. De façon intéressante, le test de désaminase utilisant les protéines purifiées de ces mutants rA3G (rM9-rM12 et rM15) a révélé que ces mutants de l’interface dimère et les mutants de liaison à l’ARN ont tous montré une activité désaminase réduite par rapport à WT (figure supplémentaire 8). La liaison réduite à l’ADNsc de ces mutants pourrait expliquer, au moins partiellement, les différents niveaux de réduction de l’activité désaminase. Cependant, le degré de réduction de la liaison à l’ADNss ne semble pas avoir une corrélation stricte avec le niveau de perturbation de l’activité de la désaminase. Par exemple, rM12 a affiché la plus faible liaison à l’ADNsc (tableau supplémentaire 3) mais n’est pas celui qui a la plus faible activité désaminase (figure supplémentaire 8).

Effets des mutations de l’interface PEP/dimère sur la restriction du VIH

La mutation W127A sur l’A3G humain (hA3G) est connue pour perturber l’emballage des virions et, par conséquent, la restriction du VIH, probablement en abolissant la liaison à l’ARN médiée par ce résidu. Cependant, les études qui ont induit l’encapsulation des mutants W127 de hA3G par une fusion peptidique Vpr ont identifié des déficiences dans la restriction du VIH15. Afin de mieux comprendre le mécanisme de restriction du VIH-1 par la hA3G, nous avons conçu des mutants hA3G supplémentaires guidés par la structure de la rA3G et les données mutationnelles. L’intention de ces mutations hA3G (tableau supplémentaire 4) était de perturber les interactions intramoléculaires CD1-CD2 (M2, M3, M4) (figures supplémentaires 9A, B), de perturber la liaison ARN autour de la jonction du dimère en mutant un nombre croissant de résidus polaires/chargés (M12, M13, M14), ou de perturber les interactions protéine-dimère en mutant un nombre croissant de résidus enfouis (M6, M10, M11) (figure supplémentaire 9C). 9C).

Comme prévu, la hA3G WT n’avait aucune activité de restriction du VIH-1 en présence de Vif, mais restreignait totalement le VIH-1 en l’absence de Vif, et la construction M1 (D128K) résistante au Vif restreignait totalement l’infection par le VIH avec ou sans Vif (Fig. 4a-c). En revanche, le mutant M9 contenant W127A (avec les mutations F126A/W127A/I187Y, figure supplémentaire 9C), connu pour perturber à la fois la liaison à l’ARN et la dimérisation, n’avait aucune activité de restriction, indépendamment de la présence de Vif (figure 4a-c). Ce résultat est conforme à la littérature antérieure indiquant que W127 est important pour l’activité de restriction du VIH en raison de sa capacité de liaison à l’ARN qui est nécessaire pour l’encapsulation des virions hA3G et la restriction indépendante de la désamination de la transcription inverse14,15. En effet, même si sa sensibilité à la dégradation par Vif semble réduite (figure supplémentaire 10A), la protéine mutante M9 a été encapsulée dans le virion en présence ou en l’absence de Vif dans une proportion d’environ 5 à 10 fois moins importante que la protéine hA3G WT (figure 4a, b). Ces résultats de WT et des mutants témoins M1 et M9 de hA3G ont démontré une activité complète ou une absence d’activité dans notre étude.

Pour les mutants conçus pour affecter les interactions intramoléculaires CD1-CD2, plusieurs résidus à proximité ou à l’intérieur de l’interface inter-domaine du côté CD2 ont été mutés pour M2 et M3 et du côté CD1 pour M4 (figures supplémentaires 9A, B). M2 et M3 présentaient toutes deux une activité de restriction du VIH-1 significativement plus faible en l’absence de Vif (Fig. 4c). M2 portant des mutations sur les boucles 1 et 3 de CD2 autour de l’interface avec CD1 a montré une perte totale d’activité catalytique (Fig. 4e), probablement parce que certains de ces résidus mutés, tels que H216, sont importants pour l’interaction du substrat ADNsc49. M3 portant des mutations sur l’interface CD2 avec CD1, à partir des résidus de liaison R194/H195 (figures supplémentaires 9A, B), n’a présenté qu’environ 10 % d’activité désaminase WT (figure 4e), probablement en raison de la perte de l’interaction correcte entre CD2 et CD1, qui affecte la liaison coordonnée du substrat ADNs pour une activité catalytique efficace. M4 portant de multiples mutations autour de l’interface inter-domaine sur CD1 a montré des caractéristiques similaires à WT indiquant que ces mutations n’ont pas d’effet évident sur la capacité de restriction. De façon intéressante, cette mutation avait une activité catalytique complète (Fig. 4e), suggérant une certaine plasticité entre les interactions de l’interface CD1-CD2 pour les fonctions.

M12 et M13 ont été conçus pour perturber uniquement la liaison de l’ARN à la zone PEP à la jonction du dimère, et M14 contient la plupart des mutations de M12 et M13 plus quatre résidus R/K supplémentaires (K52/K63/R69/K76) pour éliminer la seule surface chargée positivement restante sur A3G-CD1 (Fig. 9C supplémentaire). De façon surprenante, ces mutants ont tous montré une activité de restriction du VIH-1 de ~70% en l’absence de Vif (Fig. 4c). Même s’il a été difficile de quantifier la sensibilité à Vif en raison du faible niveau d’expression persistant de M12, M13 et M14 dans le test de sensibilité à Vif (figure supplémentaire 10A), les trois mutants, comme WT, n’ont présenté aucune activité de restriction du VIH en présence de Vif (figure 4c), ce qui suggère qu’ils étaient en fait encore suffisamment sensibles à la dégradation médiée par Vif. La raison pour laquelle l’activité de restriction du VIH-1 de M12-14 n’était que de 70 % n’était pas due à leurs niveaux de protéines plus faibles à l’état d’équilibre détectés dans les lysats de cellules HEK293T (Fig. 4a, b), puisque la transfection d’un plasmide d’expression WT moins important pour obtenir des niveaux d’expression cellulaire similaires à ceux de M12-M14 a tout de même entraîné une restriction du VIH-1 environ 4 fois supérieure à celle de WT (Fig. 10B supplémentaire). Ceci est cohérent avec l’activité de restriction indépendante de la désamination, car ces trois mutants avaient une activité de désamination perturbée (Fig. 4d, e). En particulier, M14 présentait une perte totale de l’activité désaminase (Fig. 4e). Le taux de mutation de fond de M14, basé sur les résultats du séquençage de l’ADN proviral, est cohérent avec cette constatation (tableau supplémentaire 5). Et pourtant, elle présentait une activité de restriction du VIH-1 de ~70 %. Ces résultats démontrent clairement que les résidus mutés dans M12-14 pour perturber la liaison ARN dans le PEP et les zones voisines sur CD1 n’ont montré qu’un défaut partiel dans la restriction du VIH, indiquant qu’ils ont conservé un certain niveau d’encapsidation des virions et de restriction du VIH-1, ce qui contraste avec le rôle de la liaison ARN médiée par des mutations contenant W127 dans le mutant M9 qui est critique pour l’encapsidation des virions et la restriction du VIH (Fig. 4a-c).

Ces mutants destinés à perturber uniquement les interactions protéine-dimère protéique avec un nombre croissant de mutations sont de M6 à M11 (tableau supplémentaire 4, figure supplémentaire 9C). M6 et M7 n’ont présenté qu’une perte partielle de l’activité de restriction en l’absence de Vif, malgré la perte de 95 % de l’activité catalytique de M7 due aux trois mutations supplémentaires sur CD2 (Fig. 4e). Par conséquent, les mutations dans M6 et M7 ne sont pas critiques pour la restriction du VIH. M10 a montré un phénotype plus sévère dans la restriction du VIH-1 en l’absence de Vif, même si elle a conservé une certaine activité catalytique (Fig. 4e), ce qui suggère que les mutations sur M10 sont importantes pour l’emballage des virions et la restriction du VIH. M11 est similaire à M10 dans l’activité désaminase, mais avec un phénotype moins sévère en termes d’activité de restriction et d’intégration (Fig. 4c, d). Il est possible que M11 ait conservé une plus grande capacité de liaison à l’ARN que M10 (à partir des rM10-11 de l’analyse des mutants rA3G, Fig. 3a-e), d’où un phénotype moins sévère. Dans l’ensemble, ces résultats ont montré que la mutation des résidus au sein de l’interface protéine-dimère protéique enfouie conservait à elle seule l’activité de restriction du VIH à des niveaux réduits (Fig. 4c), et que la perturbation de l’activité désaminase de ces mutants (Fig. 4e) peut expliquer en partie la réduction de l’activité de restriction du VIH. Ceci est encore une fois en contraste avec le mutant M9 qui n’a montré aucune activité de restriction du VIH (Fig. 4a-c).