Découverte, activité et caractérisation d’une oxygénase polysaccharide lytique AA10 du symbiote du taret Teredinibacter turnerae

Expression et caractérisation enzymatique de la LPMO AA10 de T. turnerae

La gamma-protéobactérie T. turnerae est le seul endosymbiont trouvé dans les branchies du taret à avoir été isolé avec succès, cultivé et à avoir son génome cartographié . Grâce à l’annotation automatique et aux recherches BLAST manuelles du protéome prédit de T. turnerae, nous avons identifié un gène (séquence de référence NCBI : WP_019602454.1) codant pour un LPMO AA10 (ci-après TtAA10A). La séquence protéique prédite comporte un peptide signal N-terminal, le domaine LPMO et une région de liaison riche en sérine suivie d’un domaine CBM (carbohydrate binding module) 10 (Fig. 1a). Les AA10 ont été trouvés avec des domaines CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 et CBM73 annexés (communication personnelle de Bernard Henrissat) et sont connus pour être actifs sur la cellulose ou la chitine. On pense que les domaines CBM10 se lient à la cellulose et peuvent donc fournir une reconnaissance de la cellulose qui n’est probablement pas associée à un événement catalytique. Bien qu’il soit différent des CBM communément trouvés attachés aux protéines AA10 , sa présence dans la structure de domaine du gène TtAA10A donne une indication que cette protéine peut être principalement active sur les polysaccharides à base de glucose.

Après de multiples tentatives d’expression du gène avec diverses étiquettes d’affinité, de solubilité et différents signaux de sécrétion, une quantité suffisante de protéine pour l’analyse a finalement été obtenue par la production d’un domaine catalytique LPMO étiqueté strep en C-terminal (de His25 à Gly228) dans E. coli (Fig. 1b). La protéine étiquetée purifiée a été chargée avec un excès de cuivre, désalée par chromatographie d’exclusion de taille, analysée pour la pureté par SDS-PAGE (Fig. 1c) et l’identification des protéines par spectrométrie de masse (non montré), et utilisée pour les expériences ultérieures.

TtAA10A recombinant (domaines catalytiques, 25-228, seulement) présente les caractéristiques d’un AA10 correctement plié. L’analyse du déplacement thermique (Thermofluor) de la TtAA10A purifiée et chargée de Cu indique une température de fusion (Tm) de 50,4 °C. L’élimination du cuivre avec 10 mM d’EDTA abaisse la Tm à 42,5 °C, ce qui suggère un effet de stabilisation de la protéine par le cofacteur métallique, comme indiqué dans la littérature précédente pour d’autres LPMO (par exemple, Fig. 1d). Nous avons également remarqué une variabilité dans les préparations de protéines, certaines préparations contenant un seul Cu (centre actif), tandis que d’autres contenaient deux atomes de Cu, décrits ci-dessous.

Des essais d’activité, sur des échantillons à site Cu simple et double, ont été réalisés sur une gamme de substrats polysaccharidiques commerciaux (Avicel, β-chitine de la plume de calmar, α-chitine de la carapace de crevette, cellohexaose, amidon de maïs, pachyman, xylane de hêtre, glucomannane, xyloglucane, lichenane, galactane, galactomannane et mannane) en présence du cofacteur réducteur, l’acide gallique. Les échantillons ont été analysés après 24 heures par MALDI-TOF MS et les masses des pics des produits de la réaction ont été comparées aux données publiées précédemment, révélant un schéma d’oxydation mixte en C1-C4, exclusivement sur la cellulose, et dépendant de la présence du donneur d’électrons (Fig. 2a, b). Les produits n’ont été détectés dans aucun des contrôles négatifs (fichier supplémentaire 1 : figure S1). L’analyse MALDI-TOF MS de l’extrait brut des essais d’activité réalisés avec la TtAA10A chargée en Cu en présence de 10 mM d’EDTA n’a pas permis de détecter la libération de produits (données non présentées), ce qui indique que, comme prévu, le cuivre est essentiel à l’activité.

Des expériences de synergie ont été réalisées en co-incubant TtAA10A et des glycosides hydrolases commerciales (GH6 et GH9) en présence d’Avicel et d’acide gallique, et les mono- et oligosaccharides résultants ont été quantifiés par chromatographie échangeuse d’anions à haute performance (HPAEC). Alors que les réactions contenant soit le LPMO soit la GH seuls ont libéré des quantités négligeables de sucres libres, les réactions de co-incubation ont montré un fort effet synergique, encore renforcé par la présence du donneur d’électrons (Fig. 2c, d, fichier additionnel 2 : Figure S2). Il convient de noter que les deux GH commerciales (GH6 et GH9) testées au cours de ces expériences appartiennent à des familles qui ont été identifiées comme étant parmi les plus abondantes dans le protéome digestif des tarets , renforçant la pertinence biologique des essais d’activité susmentionnés dans le contexte de la digestion du bois dans le milieu des tarets.

Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique

Notre première preuve que certaines préparations protéiques contenaient deux sites Cu est venue des analyses RPE. Le spectre RPE CW en bande X de la solution congelée (165 K) de la TtAA10A saturée en Cu (figure 3) présentait deux ensembles de pics hyperfins dans la région parallèle du spectre, indiquant la présence de deux géométries de coordination du cuivre distinctes, provenant soit de différents environnements de coordination au sein d’un seul site (par exemple, des différences dans les états de protonation des ligands), soit d’un second site distinct de liaison au cuivre. En effet, une simulation précise de la région parallèle du spectre a pu être obtenue avec deux espèces différentes, chacune donnant un ensemble différent de paramètres hamiltoniens de spin, gz = 2,267 et |Az| = 425 MHz (espèce 1), et gz = 2,314 et |Az| = 465 MHz (espèce 2), tableau 1, avec un rapport entre les espèces 1 et 2 d’environ 3:2. La valeur gz de l’espèce 2 est élevée par rapport à ce que l’on pourrait attendre de la coordination typique du cuivre du LPMO AA10 dans le site actif (la spectroscopie des LPMOs a récemment été revue dans la Réf. ), sur la base de laquelle nous assignons l’espèce 1 à un cuivre lié au site actif canonique du crochet d’histidine. Ses valeurs hamiltoniennes de spin sont typiques d’une géométrie de coordination axiale de Cu qui contient un mélange de ligands donneurs de N et de O . (Notez que l’espèce 2 ne peut pas provenir d’une espèce de cuivre libre en solution, car toutes les espèces de petites molécules sont éliminées pendant la préparation de la protéine ; par conséquent, tous les signaux de cuivre dans la RPE proviennent du cuivre lié à la protéine.)

Pour déterminer si les deux signaux provenaient d’un seul site de liaison au cuivre avec des géométries de coordination différentes, ou de deux sites de cuivre distincts, une expérience de titrage CW-EPR en bande X a été réalisée. La protéine a été prétraitée avec de l’EDTA (10× la concentration de la protéine) pour éliminer tout cuivre, puis a subi un échange de tampon pour éliminer tout EDTA. Cet échantillon de protéine sans cuivre a été testé et, comme prévu, n’a montré aucun signal à base de cuivre. L’ajout de 0,2 équivalent de cuivre (par rapport à la concentration de la protéine) a montré un seul signal dans la région parallèle, attribué à l’ion cuivre (II) dans le site actif du crochet de l’histidine (espèce 1). Des ajouts supplémentaires de cuivre ont augmenté ce signal de cuivre de l’accolade histidine, avec une croissance concomitante du signal pour l’espèce 2, déjà évidente après 0,4 équivalent de cuivre (fichier supplémentaire 3 : figure S3). Ces expériences de titrage ont été réalisées à un pH fixe et montrent que les deux espèces dans le spectre RPE de la TtAA10A saturée en cuivre représentent deux sites de liaison au cuivre différents avec des affinités de liaison au cuivre légèrement différentes, l’espèce 1 étant le site de plus grande affinité. De plus, l’échantillon de TtAA10A avec 0,4 équivalents de Cu a été laissé à 4 °C pendant 48 h, et son spectre RPE a été réexaminé. Cet échantillon n’a montré aucune différence dans le rapport des espèces de cuivre, ce qui démontre que les différents sites de liaison ne sont pas apparus en raison de grandes différences dans la cinétique de la liaison du cuivre.

Notamment, dans plusieurs préparations que nous avons produites, un échantillon de TtAA10A a été isolé qui ne présentait qu’un seul signal de cuivre dans le spectre RPE. Les raisons de cette différence dans la stœchiométrie du cuivre de la protéine isolée ne sont pas claires car ces échantillons ont été ostensiblement préparés en utilisant des conditions identiques à celles qui ont permis d’obtenir la TtAA10A avec deux signaux distincts de cuivre dans le spectre RPE en bande X (espèces 1 et 2). Nous n’avons pas pu détecter de différences d’activité pour ces préparations à cuivre unique occupé par rapport aux échantillons précédents, mais nous avons pu profiter de ces échantillons pour mesurer les spectres EPR CW dans la bande X et dans la bande Q pour le Cu du centre actif de TtAA10A (Fig. 4) avec seulement l’accolade histidine occupée, comme jugé par référence aux spectres précédents. Cet échantillon nous a donc permis d’effectuer un ajustement simultané des spectres en bande X et en bande Q pour obtenir des paramètres hamiltoniens de spin plus précis pour l’ion cuivre dans le site actif de l’accolade histidine (espèce 1). Ces valeurs sont indiquées dans le tableau 2. L’ajout de PASC à TtAA10A n’a pas provoqué de changement des spectres EPR (données non présentées).

Structure 3D de TtAA10A

Pour mieux comprendre la base moléculaire des propriétés biochimiques de TtAA10A, et pour sonder cette structure double Cu, potentiellement inhabituelle, nous avons déterminé la structure cristalline de la protéine exprimée de façon recombinante à une résolution de 1,4 Å (fichier supplémentaire 4 : tableau S1). La structure globale a révélé un pli central de type immunoglobuline décoré par des boucles et un faisceau hélicoïdal, comme cela est typiquement observé pour les enzymes de cette famille (Fig. 5). En effet, les comparaisons structurales utilisant le serveur DALI révèlent des correspondances structurales les plus proches avec Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) et Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) avec des RMSD de 2,4 Å et 2,3 Å sur 180 et 170 positions Cα, respectivement, représentant seulement 30% d’identité au niveau de la séquence. Étant donné la forte activité de la TtAA10A sur la cellulose, il peut être quelque peu surprenant que les deux correspondances structurelles les plus proches de cette enzyme soient des AA10 actives sur la chitine. La troisième correspondance structurelle la plus proche, cependant, était l’AA10 de Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ) qui est une AA10 spécifique à la cellulose donnant une RMSD de 2,5 Å sur 160 atomes Cα. TtAA10A et ScAA10 partagent seulement 26% d’identité de séquence, même s’ils sont actifs sur le même substrat, ce qui souligne encore la difficulté de relier la spécificité du substrat LPMO sur la base de la séquence et de la structure globale uniquement (discuté plus en détail dans le contexte de AA9 dans Ref. ).

Comme pour tous les LPMO étudiés jusqu’à présent (comme défini par leur activité), le site actif de TtAA10A est formé par le motif « histidine brace » qui est situé au centre d’une surface presque plate (Fig. 5a, b). Un seul ion cuivre a été modélisé à cette position, coordonné dans une géométrie typique en forme de T par l’extrémité amino et la chaîne latérale de His 1 et la chaîne latérale imidazole de His 107. Dans les positions axiales autour de l’ion cuivre du site actif, TtAA10A a Phe 195 et Gly 105. Ces positions sont souvent occupées par une phénylalanine/tyrosine et une chaîne latérale d’alanine, respectivement, dans d’autres AA10. Ce dernier a été impliqué dans la création d’un environnement stérique qui conduit à la formation de la géométrie de coordination distordue du site actif observée dans les AA10 spécifiques de la chitine dans leur état d’oxydation Cu(II). Ici, le remplacement de Ala par Gly permet au cuivre du site actif d’adopter une géométrie de coordination légèrement plus axiale, plus proche de celle typique des AA9 et des AA10 actifs sur la cellulose et cohérente avec les paramètres hamiltoniens de spin de l’espèce 1 dans notre analyse RPE décrite précédemment, Fig. 4. Les structures cristallines des LPMO sont souvent affectées par la photo-réduction résultant des dommages causés par les radiations, de sorte que la géométrie de repos du site actif ne peut pas être directement observée dans les structures cristallines (par exemple). L’analyse de la sphère entourant l’ion cuivre dans TtAA10A ne révèle qu’une faible densité pour une molécule d’eau située à 2,6 Å du cuivre et une densité plus forte pour une seconde molécule d’eau située à 3,2 Å et se liant par hydrogène au Glu 53. Ces molécules d’eau sont trop éloignées du cuivre pour être considérées comme des coordinateurs directs. Il semble donc que le cuivre de cette enzyme ait également subi une photo-réduction à l’état d’oxydation Cu(I).

Notre structure révèle la position du second site de liaison au cuivre qui a été observé dans les spectres RPE. Ce site se trouve à 14,4 Å (Cu…Cu) de l’ion cuivre de l’histidine brace dans un grand patch chargé négativement sur la surface de la protéine (Fig. 5a, b ; fichier additionnel 5 : Figure S4). Ce deuxième ion de cuivre est directement coordonné par His 165, Glu 5, Asp 101, une molécule d’eau et His 207* qui est fourni par le Strep-tag d’une molécule adjacente dans le cristal. En raison de l’observation de cette interaction, nous avons vérifié l’état oligomère de la protéine en solution en utilisant SEC-MALLS (fichier additionnel 6 : Figure S5). Cela a confirmé que la protéine est monomère, ce qui suggère que l’interaction cuivre-His207* est un artefact cristallin (bien qu’il puisse suggérer une interaction protéine-protéine potentielle). Néanmoins, ajoutée aux données de la RPE, la structure suggère que ce second site est occupé en solution, His 207* étant probablement remplacé par une molécule d’eau. L’alignement de séquences multiples des 500 premiers orthologues de TtAA10A identifiés par des recherches BlastP montre que, si un résidu acide en position 5 n’est pas rare parmi les AA10, les résidus 101 et 165 sont largement conservés uniquement au sein des LPMOs de bactéries étroitement apparentées à Teredinibacter.

Il y a eu un débat considérable sur les positions possibles dans lesquelles les donneurs d’électrons, à la fois petites molécules et protéiques, peuvent se lier aux LPMOs pour permettre la catalyse lorsque l’enzyme est liée à la surface du substrat solide (voir, par exemple ). En effet, l’examen de la structure de la TtAA10A pour les voies potentielles de transfert de charge à l’aide du programme EHPath montre qu’une voie claire et rapide de saut de trou avec un temps de résidence moyen de trou de seulement 20 ms existe entre l’histidine 1 et la tyrosine 3 (séparation de 10 Å). La tyrosine 3 est adjacente (5,3 Å) au deuxième site de Cu, fournissant ainsi une voie de transfert de charge efficace entre les deux sites de cuivre. Par conséquent, étant donné la voie de transfert de charge potentielle entre les deux sites de cuivre, nous avons cherché à savoir si le deuxième site métallique (dans notre cas occupé par le cuivre, bien que nous n’ayons pas pu déplacer le Cu avec des sels de Fe, Ni, Zn et Mn) représente un site de liaison pour un partenaire redox protéique (la liaison d’une autre protéine à ce site est suggérée par l’association du Strep-tag avec une molécule voisine dans le réseau cristallin), et nous avons essayé de tirer des protéines du sécrétome prédit de T. turnerae qui pourraient interagir de manière stable avec TtAA10A en utilisant une colonne d’affinité (StrepTrap HP) immobilisée avec TtAA10A. Ces expériences (données non présentées) n’ont pas permis d’isoler d’activateurs protéiques candidats pour TtAA10A, mais on ne peut exclure qu’une enzyme activatrice puisse se lier transitoirement dans cette région pour permettre le transfert d’électrons vers la LPMO et donc l’initiation de la catalyse. Il faut noter, cependant, que pendant le raffinement de la structure, nous avons également identifié un site de liaison au sodium à la surface de la protéine (fichier additionnel 7 : figure S6). La question de savoir si ces sites de liaison supplémentaires sont le résultat de la charge accrue que cette protéine doit avoir pour être stable dans l’environnement salin dans lequel T. turnerae réside reste ouverte. Néanmoins, ces caractéristiques de surface de TtAA10A peuvent être intéressantes pour les ingénieurs enzymatiques si les LPMO doivent être stabilisés ou adaptés à des conditions spécifiques pour être déployés dans des bioréacteurs industriels.