De nouveaux aperçus de la structure et de la fonction de l’apoptosome

Des informations structurelles précoces ont été essentielles pour révéler l’organisation en domaines de l’apoptosome . L’apoptosome humain contient sept molécules Apaf-1 disposées symétriquement dans une structure en forme de roue pour former un moyeu central composé de NODs avec sept bras HD2 étendus, chacun se terminant par une région en forme de V qui est formée par les deux β-propulseurs . Les plis α/β du NBD et du HD1 lient l’ADP/dATP entre eux, tandis que les répétitions WD40 forment les β-propulseurs à 7 et 8 pales . Contrairement aux suggestions antérieures, on a découvert que les interactions latérales entre les plis α/β des molécules adjacentes d’Apaf-1 sont utilisées pour organiser le moyeu central, tandis que les CARDs N-terminaux se trouvent au-dessus de cet anneau et sont désordonnés en l’absence de pc-9 (PDB 3J2T). Cependant, de récentes structures quasi atomiques ont démontré que les CARDs de l’Apaf-1 forment une caractéristique en forme de disque sur la surface de l’apoptosome actif en présence de CARDs pc-9, et cet arrangement diffère de celui trouvé dans CED-4 et Dark (Figs. 1 et 2) . La stabilité du hub central est maintenue par un réseau complexe d’interactions α-hélicoïdales, de liaisons hydrogène et de ponts salins entre les modules NBD et HD1 adjacents des molécules d’Apaf-1 voisines . Les contacts WHD/HD1 sur les protomères adjacents semblent soutenir l’assemblage de l’apoptosome, les domaines WHD reliant les domaines NBD et HD1 adjacents. Comme cela se produit dans Dark, l’hélice ISM dans Apaf-1 (α12) est jumelée avec l’hélice α13 par des interactions hydrophobes étendues pour former un motif hélice-boucle-hélice dans chaque sous-unité, qui à son tour, interagit latéralement avec les sous-unités adjacentes pour former une clôture de piquets hélicoïdaux qui borde le pore central de l’anneau .

Dans les cellules saines, les monomères d’Apaf-1 existent dans une conformation fermée et inactive avec l’ADP incorporé dans une crevasse dans l’interface de la NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Cette conformation fermée laisse présager la nécessité de changements conformationnels importants du monomère pour faciliter l’assemblage de l’apoptosome. Contrairement à la formation de l’apoptosome chez C. elegans et la drosophile, le cytochrome c libéré des mitochondries pendant la signalisation de l’apoptose se lie à l’Apaf-1 monomère, ce qui déclenche des changements de conformation menant à l’échange de nucléotides (l’ATP ou le dATP peut remplacer l’ADP), puis à l’oligomérisation d’un Apaf-1 étendu pour former l’apoptosome (Fig. 3) . Afin de comprendre les changements de conformation qui se produisent, des modèles précis sont nécessaires pour les états inactifs et étendus de l’Apaf-1. Deux structures cristallines de monomères d’Apaf-1 inactifs avec de l’ADP lié ont été déterminées, l’une manquant de β-propulseurs et la seconde manquant des domaines CARD N-terminaux pour faciliter la cristallisation. Cependant, le NOD dans ces deux formes cristallines est pratiquement identique, ce qui a permis de construire un modèle consensuel pour le monomère entier de l’Apaf-1 avec l’ADP lié. Des structures quasi atomiques de l’apoptosome humain ont maintenant été réalisées par plusieurs groupes en utilisant la cryo-EM à une seule particule, pour fournir un aperçu de la conformation étendue de l’Apaf-1 en l’absence et en présence de pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE ; Fig. 3). Comme prévu, la conformation de l’Apaf-1 dans le moyeu central, les bras HD2 et la région régulatrice est essentiellement identique dans les apoptosomes inactifs et actifs. Ces études ont fourni des détails importants sur les résidus spécifiques impliqués dans les contacts de van der Waals interdomaines au sein de molécules uniques d’Apaf-1, ont révélé des résidus critiques pour les interactions de domaine qui stabilisent l’apoptosome actif, et ont montré des interactions au sein du domaine capteur en forme de V des hélices β- à 7 et 8 lames en tandem, qui forme la surface de liaison du cytochrome c

Dans l’apoptosome Apaf-1, le site de liaison au dATP est situé à l’interface NBD-HD1, et est formé en partie par la boucle A de Walker et la boucle entre HD1 et WHD. Bien que l’Apaf-1 puisse lier l’ADP à l’état inactif, il existe une petite préférence pour l’utilisation du dATP pour l’assemblage de l’apoptosome in vitro (revue dans la réf. ), alors que l’ATP est beaucoup plus abondant in vivo (~ 2 mM pour l’ATP contre 10 μM pour le dATP) . Une certaine stabilisation se produit par des interactions entre un résidu d’arginine (Arg265) dans le NBD, ainsi que Ser325 et Tyr359 dans le HD1 et la molécule d’ATP/dATP liée. Une rotation de la paire NBD-HD1 autour de l’hélice α 20 dans le WHD, positionne la boucle HD1-WHD au fond de la poche nucléotidique, ce qui permet à la paire NBD-HD1 de former des interactions circonférentielles dans le moyeu central pendant l’assemblage. Cela rompt également les interactions avec le WHD qui stabilisent normalement une configuration fermée .

Capteur β-propulseurs et liaison du cytochrome c

Les « rayons » de la roue de l’apoptosome font saillie vers l’extérieur du moyeu par les domaines HD2 et chaque bras forme la base de la région en forme de V contenant les deux domaines β-propulseurs du capteur. Dans l’isoforme la plus longue de l’Apaf-1 (Apaf-1XL), qui est exprimée dans la plupart des tissus, les quinze répétitions WD40 forment des β-propulseurs à 7 et 8 lames en tandem et une étude cryo-EM récente a indiqué qu’il s’agissait d’un nouveau mécanisme de fermeture. Cette topologie des hélices β est similaire à celle trouvée dans la protéine d’interaction avec l’actine (Aip1p), dans laquelle le linker de HD2 forme le brin d de la dernière lame de l’hélice β à 8 lames (indiquée par la petite région bleue présente au début de l’hélice à 7 lames dans la Fig. 1a), avant de traverser pour former l’hélice β à 7 lames. Cette topologie a été vérifiée par une structure cristalline de l’Apaf-1 murin à une résolution de 3,0 Å et semble être conservée dans les β-hélice sombres .

Dans l’apoptosome Apaf-1, les β-hélice en forme de V forment la poche de liaison du cytochrome c, et l’interaction avec le cytochrome c semble être stabilisée par des liaisons hydrogène et des ponts salins . Les formes réduites et oxydées du cytochrome c peuvent interagir avec l’apoptosome pour médier son activation. Il est intéressant de noter que le cytochrome c semble interagir préférentiellement avec l’hélice β à 8 lames, tandis qu’une surface de contact plus limitée est formée avec l’hélice β à 7 lames. Le cytochrome c est résolu à une résolution de ~ 6 Å dans les nouvelles cartes, en raison du mouvement local et la molécule est tournée de ~ 90°, par rapport à un modèle antérieur basé sur l’amarrage moléculaire dans une carte où les hélices n’étaient pas résolues . La mutagenèse dirigée a révélé des résidus critiques dans le cytochrome c requis pour une association stable avec les β-propulseurs de l’Apaf-1, et certains de ces résidus (G56, P76, I81) sont importants pour la formation d’apoptosomes et l’activation ultérieure des caspases .

Les molécules d’Apaf-1 tronquées dépourvues de régions répétées WD-40 peuvent également s’assembler pour former des apoptosomes qui sont constitutivement actifs mais se désassemblent avec le temps . Cela a suggéré que les β-propulseurs peuvent être quelque peu inhibiteurs de l’assemblage tout en stabilisant également l’apoptosome Apaf-1 . Cependant, les β-propulseurs dans l’apoptosome Apaf-1 sont situés à un rayon élevé et n’interagissent pas avec les sous-unités adjacentes, ni avec les autres domaines du monomère, à l’exception du HD2. Par conséquent, le mécanisme de déstabilisation reste mystérieux. Bien que spéculatif, le manque de β-propulseurs dans les apoptosomes tronqués pourrait affaiblir les interactions de HD2 avec le moyeu central conduisant à un désassemblage dépendant du temps.

Il est maintenant clair que la liaison du cytochrome c provoque une rotation vers le haut de la région de l’hélice β, qui perturbe la connexion entre l’hélice β à 7 lames et la paire NBD-HD1 dans le monomère Apaf-1 inactif , tandis que l’hélice β à 7 lames tourne vers l’hélice β à 8 lames dans un mouvement de serrage . Ces événements déstabilisent la conformation auto-inhibée de l’Apaf-1 et facilitent l’échange de nucléotides en favorisant les changements de conformation qui exposent la poche de liaison de l’ADP pour permettre la liaison ATP/dATP. Cela stabilise le monomère Apaf-1 dans une conformation étendue de sorte qu’il puisse interagir avec les protomères voisins. Les expériences de décalage de bande suggèrent que l’échange de nucléotides et les changements de conformation associés dans l’Apaf-1 peuvent se produire en réponse à la liaison du cytochrome c, car aucune altération significative de la conformation de l’Apaf-1 n’a été détectée avec l’ajout de dATP en l’absence de cytochrome c . Prises ensemble, ces données soutiennent un modèle séquentiel dans lequel la liaison du cytochrome c se produit avant l’échange de nucléotides, pour faciliter la transition d’une conformation fermée à une conformation étendue de l’Apaf-1. En outre, ces résultats indiquent que les répétitions WD40 agissent comme des capteurs qui déclenchent l’assemblage initial de l’apoptosome en liant le cytochrome c.

Mécanismes possibles de l’activation de la procaspase-9

La procaspase-9 est recrutée par l’apoptosome pour former une holoenzyme qui augmente son activité catalytique . En solution, la pc-9 est un monomère constitutif lorsqu’elle n’est pas liée à Apaf-1, alors que les caspases actives en général sont des dimères . De façon remarquable, une interaction dimérique entre deux monomères de pc-9 dans un réseau cristallin favorise la formation d’un site actif sur une sous-unité catalytique, tandis que la seconde sous-unité reste dans une configuration inactive (PDB 1JXQ) et un phénomène similaire se produit dans les dimères de CED-3 à haute concentration . Le CARD N-terminal dans pc-9 interagit avec le(s) CARD(s) d’Apaf-1 pour recruter la procaspase apicale à l’apoptosome et ceci favorise l’activation du domaine catalytique, qui est séparé du CARD par un long linker (Fig. 2a) . De plus, les sous-unités p20 et p10 du domaine catalytique sont également reliées par un linker qui est sujet à l’autoclivage. Ainsi, pour comprendre comment pc-9 est activé, nous devons comprendre le rôle des CARDs et des linkers pc-9 dans l’holo-apoptosome.

Différents modèles expliquant les mécanismes d’activation de pc-9 par l’apoptosome ont été proposés . Le « modèle de dimérisation induite par la proximité » prédit que le recrutement des molécules pc-9 à l’apoptosome Apaf-1 peut faciliter l’homodimérisation, qui est censée conduire à l’auto-activation pc-9 . Cependant, jusqu’à récemment, aucune preuve structurelle ou biochimique n’avait démontré que le pc-9 est homodimérique lorsqu’il est lié à l’apoptosome (voir ci-dessous). Le « modèle de conformation induite » proposait que l’apoptosome Apaf-1 soit une plateforme qui lie le pc-9 pour faciliter sa conformation active. Une modélisation récente a suggéré que l’activation de pc-9 est principalement médiée par une régulation allostérique par la plateforme de l’apoptosome. Dans tous ces modèles, la fonction principale de l’apoptosome est d’assembler un complexe multimérique entre Apaf-1 et les CARDs du pc-9 pour faciliter l’activation du pc-9 en augmentant la concentration locale du zymogène. En outre, les données sur un pc-9 modifié qui est un dimère constitutif en solution suggèrent que la CARD et son lieur peuvent inhiber les domaines catalytiques. Par conséquent, la formation d’un hétérodimère CARD sur l’apoptosome peut libérer cette inhibition, cependant, cette idée reste à tester.

Bien que la dimérisation puisse jouer un rôle clé dans l’activation, la façon dont cela se produit sur l’apoptosome est restée inexpliquée, et en fait, des données récentes ont suggéré la possibilité d’un mécanisme d’activation plus compliqué qui implique à la fois l’homodimérisation des molécules pc-9 et la formation d’un hétérodimère d’un seul domaine catalytique pc-9 avec le NBD d’Apaf-1 . De manière intrigante, une conformation inactive du monomère d’Apaf-1 n’empêche pas la liaison du pc-9 via des interactions CARD-CARD, comme le montrent les expériences de déplacement de bande. Ainsi, les hétérodimères pc-9/Apaf-1 peuvent être recrutés dans l’assemblage de l’apoptosome dans le cadre de son activation (Fig. 3). La question reste ouverte de savoir si l’assemblage d’Apaf-1 en présence de pc-9 est guidé par des interactions supplémentaires entre les CARD dans le disque naissant.

Une structure cristalline initiale a révélé un complexe 1:1 stable entre les domaines CARD d’Apaf-1 et de pc-9 avec une interface complémentaire (connue sous le nom de type I), qui est indispensable pour l’activation de pc-9 . Cependant, il a été démontré par la suite que ce complexe 1:1 stable était insuffisant pour activer la protéine pc-9. Au lieu de cela, les CARDs d’Apaf-1 et de pc-9 forment des complexes oligomériques d’ordre supérieur, stabilisés principalement par deux des trois interfaces possibles (connues sous le nom de Type I, II et III), que l’on retrouve également dans d’autres complexes du domaine de la mort. La comparaison des interactions impliquées dans le disque CARD-CARD dans les apoptosomes CED-4, Dark et Apaf-1, met en évidence une certaine conservation des interfaces de type II et III, les interactions CARD de type I n’étant présentes que dans l’apoptosome humain . Une structure cristalline récente à une résolution de 2,1 Å a révélé un complexe hétérotrimérique composé de deux CARD d’Apaf-1 avec un CARD de pc-9 pris en sandwich entre les deux. Les interactions de type II impliquant des résidus dans les CARDs du pc-9 (Arg36/ Arg65) et de l’Apaf-1 (Glu78) se sont avérées critiques pour l’activation du pc-9, ainsi que les interactions de type I décrites précédemment. De plus, un seul résidu (Glu41 dans la CARD de l’Apaf-1) peut former une interaction bifurquée avec une CARD du pc-9 dans une interface minimale de type III . Des interactions supplémentaires avec Lys58 et Lys62 sur le CARD de l’Apaf-1 se sont également avérées nécessaires pour l’activation du pc-9 et peuvent aider à positionner les CARD de l’Apaf-1 sur la plateforme. Ainsi, la formation d’un complexe CARD hétérotrimérique fournit un moyen d’attacher plusieurs domaines catalytiques pc-9 à la plate-forme de l’apoptosome .

Deux structures à résolution quasi atomique de l’apoptosome Apaf-1 actif ont révélé l’architecture globale de l’arrangement du disque Apaf-1 et pc-9 CARD crée un disque incliné qui se trouve dans un au-dessus du moyeu central (Figs. 2 et 3) . Le décalage de symétrie entre le disque et la plate-forme entraîne un positionnement acentrique du disque CARD vu du dessus (Fig. 3) . Le disque peut être décrit comme une spirale de paires de CARD Apaf-1 et pc-9, quatre CARD Apaf-1 formant une « couche » inférieure tandis que trois ou quatre CARD pc-9 sont présentes sur la surface supérieure (Fig. 2b-d). De plus, les Apaf-1 CARDs s’éloignent davantage de la surface du moyeu central, car elles spiralent vers le haut d’une manière gauchère et ont donc des conformations de liaison différentes et des interactions différentes avec leurs NBDs cognates dans le moyeu central. Les paires de CARDs Apaf-1 et pc-9 interagissent par le biais d’interfaces de type II, et se rejoignent latéralement autour de la spirale principalement par des interactions de type I. Il est remarquable que seulement quatre des sept CARDs de l’Apaf-1 interagissent avec les CARDs du pc-9 dans le disque. Ceci est dû au fait que les trois molécules CARD Apaf-1 restantes ne s’intègrent pas facilement dans le modèle de liaison des sous-unités de la spirale et ne peuvent pas continuer la spirale parce que leurs liens CARD-NBD sont trop courts. Les CARDs de l’Apaf-1 provenant des sous-unités adjacentes de l’apoptosome sont situées à un point de jonction (entre les positions 1a et 7a), où la spirale cesse de s’allonger verticalement (Fig. 2c, d) . La formation du disque CARD Apaf-1/pc-9 est nécessaire pour l’activation de l’apoptosome et les domaines catalytiques pc-9 sont reliés de manière flexible aux CARDs par un linker (Fig. 2a) . Dans une structure, un disque avec quatre CARDs Apaf-1 et trois CARDs pc-9 a été visualisé, avec une faible densité indiquant qu’une quatrième CARD pc-9 pourrait se lier au sommet de la spirale hélicoïdale à une occupation plus faible. Dans une deuxième structure, la configuration prédominante du disque contenait 8 CARDs, la conformation des CARDs dans la spirale étant très similaire entre les deux structures résolues indépendamment (voir superposition, Fig. 2d). Les variations du pH et de la concentration en sel peuvent expliquer la différence d’occupation de la huitième position. Ainsi, l’assemblage de l’apoptosome favorise le recrutement et la concentration locale des CARDs pc-9, ce qui permet la formation d’un nouvel oligomère hélicoïdal avec 7 ou 8 CARDs.

Une analyse récente (par MALS et SAXS) a montré que la formation du complexe CARD dépend de la concentration et que des quantités égales de CARDs Apaf-1 et pc-9 s’associent en paires à travers l’interface de type I plus forte, avec un complexe 3:3 prédominant formé à une concentration élevée en solution . Ce complexe CARD a été cristallisé et la structure déterminée à une résolution de 3,0 Å pour révéler une spirale gauche de trois paires de CARD Apaf-1/pc-9 avec une conformation similaire à celle observée dans l’apoptosome mais avec quelques différences (PDB 5WVC ; Fig. 2e). Cependant, l’environnement dans le cristal est très différent de celui rencontré sur l’apoptosome en cours d’assemblage, en partie à cause des contacts du réseau et de l’absence d’une surface de nucléation avec des contraintes imposées par les lieurs CARD-NBD. Cela peut expliquer les différences observées entre les structures hélicoïdales de CARD. Il s’agit notamment de l’ajout d’une ou deux CARD supplémentaires à la spirale en forme de disque dans l’holo-apoptosome et de la présence de quatre CARD d’Apaf-1 qui forment la base du disque, plutôt que trois comme on le trouve en solution et dans le cristal. Après alignement optimal du disque de 8 CARDs avec la spirale de 6 CARDs de la structure cristalline, il y a une bonne congruence entre les CARDs aux positions 2p, 3a, et 4p, avec une certaine divergence dans la dernière moitié de la spirale de 6 CARDs (Fig. 2f, g). En particulier, la CARD de l’Apaf-1 en position 7a est mal positionnée verticalement à une position intermédiaire, en l’absence de la CARD de l’Apaf-1 en position 1a (Fig. 2g). Ainsi, les interactions entre la plateforme et le disque CARD sont essentielles pour nucléer les plus grandes spirales 7 et 8 CARD que l’on trouve sur l’apoptosome.

Pendant l’assemblage du disque, la nucléation de la spirale peut se produire de différentes manières, notamment par la formation d’un hétérotrimère CARD composé de deux CARD Apaf-1 et d’un CARD pc-9, avec un CARD Apaf-1 situé à la base de la spirale (en position 1a). L’ajout ultérieur de deux paires Apaf-1/pc-9 CARD qui interagissent par le biais de leurs interfaces de type I peut alors se produire avec un coiffage final de la spirale par une pc-9 CARD en position 8p dans certains cas. Cependant, d’autres permutations sont possibles étant donné la nature flexible du lieur Apaf-1 CARD-NBD, de sorte que trois paires Apaf-1/pc-9 CARD de « Type I » peuvent être nucléées séquentiellement à partir du moyeu central, avec l’ajout d’une Apaf-1 CARD à la base de la spirale (en position 1a), pendant les premières étapes de l’assemblage. De manière importante, l’assemblage du disque peut être coopératif afin de maintenir l’espacement approprié des quatre CARDs Apaf-1 sur l’apoptosome, qui forment la base de la spirale .

Pour l’apoptosome actif, une différence majeure est apparente sur le moyeu central, lors de la comparaison des structures publiées (figures 3 et 4) . En bref, la densité identifiée comme un domaine catalytique de pc-9 (p20/p10) est située sur le moyeu central dans une carte 3D récente, et cette caractéristique s’est avérée être présente dans environ 50% des complexes . De plus, une densité similaire a été visualisée dans une carte précédente à plus basse résolution de l’holo-apoptosome, ce qui a permis un amarrage raisonnable, bien que préliminaire, des sous-unités p20/p10 ; la caractéristique observée est donc reproductible. Cependant, cette nouvelle densité n’a été visualisée qu’à basse résolution, ce qui peut refléter une certaine flexibilité dans l’attachement des sous-unités p20/p10 au moyeu central. Dans une carte à résolution quasi atomique déterminée par le groupe de Yigong Shi, une densité supplémentaire en forme de faucille a été résolue à une résolution de ~ 7 Å sur le moyeu central, adjacente au disque CARD. Cette densité contient clairement une CARD pc-9 supplémentaire au centre, qui interagit avec deux CARD Apaf-1 situées de chaque côté, d’une manière similaire à celle observée dans deux structures cristallines . Cependant, cette configuration hétérotrimérique n’a pu être résolue que dans ~ 10% des particules . Il semble donc que les conditions expérimentales lors de la préparation de l’échantillon et de la congélation de la grille peuvent influencer la manière dont pc-9 interagit avec les sites de liaison potentiels sur le moyeu central, y compris la formation d’une spirale en forme de disque avec un nombre variable de CARDs pc-9 et dans l’utilisation des sites de liaison qui sont situés à côté du disque acentrique. Lorsque les deux structures asymétriques récentes de l’holo-apoptosome sont alignées sur la base de leurs disques CARD, les nouveaux pics de densité situés sur le moyeu central se trouvent dans des endroits très distincts (Fig. 4). Alors que le domaine catalytique pc-9 (p20/p10) peut être situé à deux endroits (le plus probable étant montré dans la Fig. 4c), la densité des trois CARD est tournée et a un profil différent vu de côté (non montré), comparé à celui du domaine catalytique pc-9 (Fig. 4b, d). Le schéma des densités de liaison CARD-NBD de l’Apaf-1 permet une cartographie précise de toutes les liaisons CARD-NBD pertinentes dans l’holo-apoptosome à trois CARD avec six CARD ordonnés de l’Apaf-1 (Fig. 4d). De façon critique, la longueur du linker (~ 25-30 Å) et les positions relatives des linkers peuvent empêcher la liaison d’un module de trois CARD à la position 1 ou 2 sur le moyeu central. Ainsi, il semble qu’il existe plusieurs sites sur le moyeu central qui peuvent être utilisés de manière distincte pour lier un pc-9 CARD ou un domaine catalytique.

On a estimé que la caspase-9 se lie à l’apoptosome avec des ratios entre 2-5 zymogènes pour 7 molécules d’Apaf-1 , il semble donc que le nombre exact de molécules de pc-9 liées à l’apoptosome puisse varier en fonction des conditions pendant l’assemblage, ce qui peut refléter la nature dynamique de cette machine protéolytique. Par extension, il semble clair qu’un sixième ou un septième CARD pc-9 n’est pas lié par leurs homologues Apaf-1, par rapport aux sites déjà documentés sur l’apoptosome, ce qui peut refléter soit une limitation stérique, soit la nécessité d’un oligomère plus grand pour stabiliser les CARD pc-9 liés. Il est important de noter que certains domaines catalytiques pc-9 ne sont pas vus dans les cartes de densité cryo-EM actuelles, en raison de leur fixation flexible par le biais de longs lieurs CARD-p20, ce qui rend difficile le déchiffrage et la compréhension des mécanismes précis d’activation, tout en soulignant la nécessité de poursuivre les études sur les molécules uniques.

La fonction principale de l’apoptosome est d’activer pc-9 afin qu’il puisse exécuter l’apoptose. Alors que les études structurelles ont fourni un aperçu du recrutement et des exigences pour l’activation de pc-9, une série de tests biochimiques ont maintenant démontré que la dimérisation induite par la proximité et la régulation allostérique de pc-9 monomère sont critiques pour réguler la fonction de l’apoptosome et peuvent également régir la durée de l’activité de l’apoptosome. Tout d’abord, le recrutement de pc-9 par l’apoptosome augmente sa concentration locale pour permettre l’homodimérisation, ce qui augmente son affinité pour le complexe . Il est intéressant de noter qu’une pc-9 non clivée a une plus grande propension à l’homodimérisation et présente une activité protéasique accrue (clivage de la caspase-3) au sein de l’apoptosome, que la caspase-9 clivée. Par conséquent, le clivage du lien inter-sous-unités p20/p10 du domaine catalytique réduit l’affinité de la pc-9 pour l’apoptosome et, une fois transformée, la caspase-9 est libérée et ne se lie pas à nouveau à l’apoptosome. Il est important de noter que ces études ont démontré que l’homodimérisation de la pc-9 est l’événement clé requis pour l’activation et que l’apoptosome agit pour faciliter cet événement. Ceci est cohérent avec les études biochimiques d’autres caspases CARD, telles que la caspase-2 et la Dronc, où l’activation initiale nécessite la dimérisation, plutôt que le clivage du zymogène. La stabilisation de la liaison de la pc-9 à l’apoptosome nécessite non seulement des interactions CARD-CARD, mais aussi des interactions de la petite sous-unité de la pc-9 (p10) via son motif GCFNF404 pour former des homo- et des hétérodimères. Ce qui n’est pas clair à ce stade, c’est comment la formation d’homodimères pc-9 affecte la stabilité du disque CARD-CARD, car les dimères du domaine catalytique semblent être assez flexibles, puisqu’ils peuvent être libérés de l’holo-apoptosome par une thrombinolyse dirigée vers un site et ne sont pas résolus dans les cartes cryo-EM affinées sans symétrie . Le motif GCFNF du pc-9 interagit également avec un NOD d’Apaf-1 pour former des hétérodimères pc-9/Apaf-1 qui clivent efficacement la caspase-3. Ces données suggèrent qu’un domaine catalytique de pc-9, qui interagit directement avec l’apoptosome, pourrait être actif. Ce site actif putatif pour le clivage de la caspase-3 pourrait correspondre à la nouvelle densité observée sur le moyeu central qui a été interprétée comme une molécule p20/p10 et des études supplémentaires sont nécessaires sur ce point. Pris ensemble, ces résultats indiquent que pc-9 peut avoir deux conformations actives différentes dans l’apoptosome, avec un ou peut-être deux homodimères attachés au disque CARD et un hétérodimère pc-9/Apaf-1 lié au moyeu central. Si l’on tient compte des holo-apoptosomes avec un module à trois CARD lié au moyeu central, au moins six permutations sont possibles pour la disposition de trois à cinq domaines catalytiques pc-9 (Fig. 5). Ainsi, le nombre de domaines catalytiques pc-9 actifs possibles (en tant qu’homodimères et hétérodimères) variera en fonction du nombre de molécules pc-9 recrutées dans l’apoptosome, car elles remplissent les sites de liaison possibles médiés par les CARDs d’Apaf-1.

Enfin, le clivage complet de pc-9 par la caspase-3 supprime le linker inter-sous-unité et restaure l’activité complète de la caspase-9, ce qui indique que la caspase-3 a également une rétroaction protéolytique sur pc-9 qui peut amplifier le signal apoptotique . Un mécanisme similaire a été proposé pour la caspase-2. Ces études biochimiques ont en outre présenté un modèle de minuterie moléculaire où la vitesse de dissociation de la caspase-9 de l’apoptosome est déterminée par un clivage initial de la liaison p20-p10 qui réduit son affinité de liaison à l’apoptosome . Cependant, la dissociation complète de la caspase-9 clivée de l’holo-apoptosome nécessiterait la libération de son CARD du disque ou du module à trois CARD. Ainsi, il peut exister une hiérarchie pour la libération des molécules de caspase-9 actives qui dépend de l’environnement local de leurs CARDs. La conception du disque CARD, avec toutes les CARDs pc-9 situées sur la surface supérieure, peut également faciliter la libération de la caspase-9.