Des anticorps spécifiques nécessitent une validation spécifique
Différents anticorps nécessitent des tests spécifiques, en fonction de la biologie de leur cible.Crédit : MOLEKUUL/SCIENCE PHOTO LIBRARY/Getty Images
L’un des outils les plus utilisés dans la recherche biomédicale est l’anticorps monoclonal. Ces protéines ont le potentiel de rechercher et de se lier à n’importe quelle cible souhaitée, et peuvent être utilisées pour l’imagerie cellulaire, le tri cellulaire, les immunoessais et de nombreuses autres applications.
Mais ces bêtes de somme de laboratoire ne fonctionnent pas toujours correctement. Selon la nature de sa cible, un anticorps peut être incohérent dans certains tests – se liant à la mauvaise cible pour donner des résultats faussement positifs, par exemple. Compte tenu de la prévalence de l’utilisation des anticorps pour la recherche, il s’agit potentiellement d’un problème d’un milliard de dollars.
Un objectif majeur est de développer des stratégies de validation des anticorps afin que les chercheurs puissent avoir la certitude qu’un anticorps est adapté à leurs besoins particuliers – et que leurs résultats seront reproductibles.
Thermo Fisher Scientific a développé une plateforme de validation des anticorps en deux parties pour tester non seulement la spécificité de ses anticorps InvitrogenTM (qu’ils se lient à la bonne cible), mais aussi leur adéquation à différentes applications. Toutefois, le même test n’est pas approprié pour tous les anticorps : Thermo Fisher utilise un test approprié pour chaque cible protéique, en fonction de sa fonction biologique. Certains anticorps seront mieux testés en utilisant CRISPR-Cas9 pour éliminer le gène qui code pour la protéine cible, et en vérifiant que l’anticorps ne se lie plus à rien. D’autres anticorps pourraient être testés en utilisant l’immunoprécipitation suivie de la spectrométrie de masse pour vérifier qu’ils se lient aux bonnes cibles.
Thermo Fisher développe et affine les tests de validation des anticorps en se basant sur la fonction biologique de l’antigène cible. Voici deux études de cas de protéines spécifiques et de leurs tests de spécificité.
Les anticorps contre le cancer
Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une protéine bien étudiée : la dysrégulation de la voie de l’EGFR est impliquée dans divers cancers. Afin de tester si les anticorps sont spécifiques à l’EGFR ou à l’une de ses cibles en aval, les chercheurs peuvent éliminer des protéines critiques dans la voie de l’EGFR et voir comment le signal de liaison des anticorps change.
Ces dernières années, le système CRISPR-Cas9 est devenu connu comme le moyen le plus fiable et le plus puissant d’éliminer un gène. Cela le rend idéal pour tester la spécificité des anticorps dans une cascade de signalisation. Les chercheurs de Thermo Fisher ont pris une lignée de carcinome humain standard (A-431) et ont utilisé un western blot pour obtenir une ligne de base pour le signal de liaison. Ils ont ensuite utilisé CRISPR-Cas9 pour éliminer le gène cible et créer des knockouts EGFR. Un western blot des protéines extraites de ces cellules knockout a montré qu’il n’y avait plus de signal pour une protéine cible (figure 1).
Des tests supplémentaires ont confirmé le résultat. La cascade de signalisation en aval de l’EGFR comprend des protéines telles que RAS, RAF, MEK et ERK. L’activation de l’EGFR par le facteur de croissance épidermique (EGF) entraîne la phosphorylation de ces protéines en aval, qui peut être détectée à l’aide d’autres anticorps qui reconnaissent ces états phosphorylés. Cependant, l’ajout d’EGF aux cellules dépourvues d’EGFR ne devrait pas entraîner de phosphorylation en aval. L’ajout des mêmes anticorps qui reconnaissent les cibles phosphorylées n’a produit aucun signal. Les chercheurs de Thermo Fisher sont donc convaincus que l’anticorps anti-EGFR est spécifique à la cible.
En partant de la lignée cellulaire A-431, CRISPR-Cas9 a été utilisé pour assommer le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). Un western blot montre que les anticorps contre l’EGFR (n° de cat. MA5-13269, 1 μg/mL) se lient aux cellules témoins mais pas aux cellules EGFR KO. La protéine tubuline a été utilisée comme contrôle de chargement.
Un ensemble de modifications
Dans le noyau cellulaire, l’ADN est étroitement emballé – enroulé autour des protéines histones pour former la chromatine. L’étude des histones est difficile, car elles peuvent être affectées par un certain nombre de changements chimiques, connus sous le nom de modifications post-traductionnelles (PTM). Par exemple, les résidus d’une histone peuvent gagner un ou plusieurs groupes méthyle, acétyle ou phosphoryle, qui ont chacun un effet sur la fonction cellulaire.
Certaines techniques, telles que l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), le western blotting, l’immunofluorescence et l’immunohistochimie, utilisent des anticorps contre des PTM d’histones spécifiques pour comprendre l’état de l’histone et sa liaison. Cependant, plusieurs modifications d’histones ont des schémas de liaison à l’ADN similaires ; un anticorps qui n’a pas été rigoureusement testé contre toutes les PTM d’histones pourrait se lier au mauvais type et fournir un résultat faussement positif.
Thermo Fisher a testé ses anticorps spécifiques des PTM d’histones en utilisant un ensemble de peptides portant une variété de PTM. Si un anticorps est vraiment spécifique à un PTM, il ne se fixera qu’aux taches qui portent ce PTM. Les chercheurs de Thermo Fisher ont mesuré les signaux à l’aide d’un facteur de spécificité : l’intensité moyenne de tous les spots contenant un PTM particulier divisée par l’intensité moyenne de tous les spots sans PTM (figure 2). Les anticorps ont montré un facteur de spécificité de 4 à 190 fois plus élevé pour leur état PTM cible que pour les états non ciblés, ce qui donne confiance dans leur haute sélectivité.
Un anticorps est nécessaire pour distinguer le type de méthylation sur un résidu de lysine spécifique. Un anticorps candidat a été testé contre une matrice peptidique avec des spots portant des résidus lysine mono-, di- ou tri-méthylés. Le facteur de spécificité a montré que l’anticorps (n° de cat. 710795) ne reconnaissait qu’un seul type de méthylation, ce qui signifie qu’il est hautement sélectif.
Thermo Fisher dispose de sept autres tests de spécificité au-delà du knock out génétique et des tableaux peptidiques. Il s’agit notamment de l’utilisation de l’ARNi pour neutraliser l’expression des gènes, d’un anticorps soulevé de manière différentielle pour vérifier indépendamment le ciblage, et de l’expression variable naturelle pour confirmer la spécificité. Ce n’est que par le biais de ces tests minutieux et rigoureux que les chercheurs peuvent être sûrs que leurs chevaux de bataille de laboratoire sont adaptés à leur objectif – et que leur travail résistera à l’examen le plus minutieux.
Retrouvez des notes d’application sur ces anticorps Invitrogen et plus d’informations sur l’approche de test en deux parties de Thermo Fisher Scientific ici.