Effets antiasthmatiques de la décoction de Sanglong Pingchuan par l’induction d’une réponse immunitaire équilibrée Th1/Th2

Abstract

Objectif. Étudier les effets antiasthmatiques de la décoction de Sanglong pingchuan (SLPCD) et explorer ses mécanismes d’action. Méthodes. Le sérum, le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) et les tissus pulmonaires de souris asthmatiques allergiques induites par l’OVA ont été collectés 24 heures après la dernière administration. Les changements pathologiques pulmonaires ont été observés par coloration H&E. Les cellules inflammatoires dans le LBA ont été comptées par cytométrie de flux. Les taux d’IgE totales dans le sérum et de cytokines dans le LBA ont été déterminés par ELISA. Les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines dans les poumons ont été évalués par qRT-PCR. Résultats. Le SLPCD a inhibé de manière significative l’inflammation des voies aériennes, réduit les cellules inflammatoires dans le LBA, diminué les niveaux d’IgE totaux dans le sérum et les cytokines Th2 (IL-10 et IL-13) dans le LBA, et régulé à la baisse les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13) dans le poumon des souris asthmatiques. Cependant, le SLPCD a remarquablement élevé le niveau de la cytokine Th1 IFN-γ dans le LBA et a augmenté les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines Th1 (IL-2 et IFN-γ) dans le poumon des souris asthmatiques. Conclusion. SLPCD pourrait atténuer l’inflammation des voies respiratoires et atténuer la pathogenèse chez les souris asthmatiques en induisant une réponse Th1/Th2 équilibrée et pourrait agir comme un médicament efficace pour le traitement de l’asthme.

1. Introduction

L’asthme est une maladie respiratoire chronique complexe qui se caractérise par une hyperréactivité bronchique, une inflammation et un remodelage des voies respiratoires, une obstruction du flux d’air et une infiltration de différents types de cellules inflammatoires induite par des cytokines et d’autres médiateurs . L’asthme est causé par des facteurs environnementaux tels que des allergènes, des virus et des expositions professionnelles chez des individus génétiquement prédisposés ; cependant, sa cause définitive n’est pas claire. L’incidence de l’asthme a considérablement augmenté dans le monde, en particulier chez les jeunes enfants, pour devenir l’une des maladies respiratoires les plus courantes. On estime que 300 millions d’individus sont affectés par l’asthme parmi différents pays .

A l’heure actuelle, les corticostéroïdes sont les médicaments les plus efficaces pour le traitement de l’asthme . Bien que ces médicaments puissent améliorer les symptômes de l’asthme, ils ne guérissent pas cette maladie . Ces agents ont également des effets secondaires graves, en particulier chez les enfants, notamment une immunodépression, des infections secondaires, une atrophie musculaire, une ostéopénie, une ostéoporose, une cataracte et un glaucome . Par conséquent, la recherche continue de nouveaux médicaments sûrs et efficaces est de la plus haute importance.

De nombreux médicaments traditionnels chinois ont été utilisés dans le traitement de l’asthme pendant des siècles et sont encore largement utilisés dans les pays asiatiques . Récemment, le mécanisme d’action de nombreuses formules à base de plantes utilisées pour traiter l’asthme allergique a été rapporté . Divers produits naturels dérivés de plantes ayant des propriétés anti-inflammatoires ont également été examinés pour une application potentielle dans le traitement de l’asthme .

La décoction de Shanglong pingchuan (SLPCD) est une préparation hospitalière prescrite par le professeur Qing Chang, un vétéran national de la médecine traditionnelle chinoise hérité du mentor du studio, à l’hôpital de médecine traditionnelle chinoise de Shaoxing. Le SLPCD est dérivé du Shegan Mahuang Tang par addition et soustraction. Le Shegan Mahuang Tang est un médicament traditionnel chinois bien connu, mentionné pour la première fois dans le Jin Kui Yao Lve. En tant que formule représentative de la dissipation du froid, du soulagement du syndrome extérieur, du réchauffement des poumons, de l’élimination des mucosités et du soulagement de l’asthme, le Shegan Mahuang Tang est largement utilisé pour le traitement de l’asthme, de la bronchite chez les enfants, de l’asthme bronchique, de la pneumonie, de la bronchite aiguë et chronique chez les personnes âgées, de l’emphysème et de la rhinite allergique. La formule du SLPCD est composée de treize médicaments traditionnels chinois énumérés dans le tableau 1. Un essai randomisé a démontré que le SLPCD est efficace dans le traitement de l’asthme, notamment pour réduire le taux d’exacerbation. Cependant, l’efficacité du SLPCD n’a pas été prouvée par des expériences contrôlées.

Dans la présente étude, pour fournir une base expérimentale pour l’application clinique de SLPCD dans le traitement de l’asthme et pour explorer ses mécanismes d’action, en utilisant le modèle de souris asthme allergique induit par l’OVA, les effets anti-inflammatoires du SLPCD ont été étudiés par l’examen histologique, l’énumération des cellules immunitaires dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA), la quantification des IgE totales dans le sérum, la cytokine dans le LBA et l’expression de l’ARNm de la cytokine dans les tissus pulmonaires.

2. matériaux et méthodes

2.1. Matériaux végétaux et réactifs

Cortex Mori (numéro de lot : 140901), Pheretima Aspergillum (numéro de lot : 150406), Herba Ephedrae traité au miel (numéro de lot : 150302), Rhizoma Belamcandae (numéro de lot : 141213), Semen Armeniacae Amarum (numéro de lot : 150312), Fructus Perillae cuit au four (numéro de lot : 150115), Scorpio (numéro de lot : 150126), Semen Descurainiae (numéro de lot : 150208), Flos Farfarae frit au miel (numéro de lot : 150301), Herba Houttyniae (numéro de lot : 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (numéro de lot : 150308), Radix Angelicae Sinensis (numéro de lot : 150213), et Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (numéro de lot : 140917) ont été achetés à l’hôpital de médecine chinoise de Shaoxing et ont été authentifiés par le professeur Yonghai Jiang de l’Institut de contrôle des aliments et des médicaments de Shaoxing, Zhejiang, Chine. Les étalons d’acide chlorogénique et de rutine ont été achetés auprès de l’Institut de contrôle des aliments et des médicaments du Zhejiang, Hangzhou, Chine, et les puretés des deux composés étaient supérieures à 98 %.

L’ovalbumine (OVA) a été achetée auprès de Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO, USA ; les kits ELISA de détection de l’IL-10, de l’IL-13 et de l’IFN-γ de souris ont été achetés auprès de Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd, Hubei, Chine ; le kit ELISA d’IgE de souris provenait de RayBiotech Inc, Norcross, GA, USA, le sérum de veau fœtal (FCS) provenait de Gibco, Grand Island, NY, USA. Les anticorps purifiés anti-souris CD16/CD32 (bloc récepteur Fc), Ly-6G-FITC (clone : RB6-8C5), antigène F4/80 PE-Cy5 (clone : BM8), Ly-6C-APC (clone HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alpha (FceR1)-APC (clone : MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, clone : 2B8), et siglec-F-PE (clone : E50-2440) ont été achetés chez eBioscience, Inc, San Diego, CA, USA. Le réactif Trizol a été acheté auprès d’Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ; la transcriptase inverse revert Aid™ M-MLV a été fournie par Fermentas, Amherst, NY, USA ; l’inhibiteur de ribonucléase et l’oligo(dT)18 ont été fournis par Sangon Biotech (Shanghai) Co. Ltd, Chine ; le maître FastStart Universal SYBR Green (ROX) a été fourni par Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA. Le gel d’hydroxyde d’aluminium (Alum) a été acheté auprès de China Animal Husbandry Industry Co, Ltd, Beijing, Chine ; la dexaméthasone (Dex) provient de Hubei Tianyao Pharmaceutical Co, Ltd, Xiangyang, Chine.

2.2. Préparation de SLPCD

Les médicaments de prescription de SLPCD (440 g) ont été mis à macérer dans 8 aliquotes d’eau distillée pendant 30 min, puis dans de l’eau bouillante pendant 1 h. Après la première décoction, les lies ont été bouillies dans 6 aliquotes d’eau distillée pendant 30 min supplémentaires. Le surnageant obtenu à partir de la double décoction a été filtré à travers une gaze stérile et concentré par un rotavapor (Buchi, Suisse) sous pression réduite à 65°C jusqu’à une concentration finale de 1,1 g de médicament brut/ml. La décoction concentrée a été stockée à -20°C puis diluée par de l’eau distillée à plusieurs concentrations différentes avant utilisation.

2.3. Analyse par chromatographie liquide haute performance (CLHP) du SLPCD

L’analyse CLHP a été réalisée à l’aide d’une colonne Diamon C18 (250 mm × 5 mm, 5 μm) et d’un détecteur PDA Waters 2996 sur l’instrument CLHP Water 600E. La phase mobile était un mélange d’acétonitrile (A) et d’acide phosphorique à 0,1 % (B). Une élution à gradient linéaire a été réalisée comme suit : 0-8 min à 2 % A, 8-35 min à 6 % A, 35-40 min à 8 % A, 40-45 min à 13 % A, 45-70 min à 14 % A, 70-80 min à 17 % A et 80-90 min à 17-2 % A. Le débit était de 1 ml/min et le volume d’injection de 10 μl. La température de la colonne a été maintenue constamment à 30°C. L’analyse par HPLC des standards (acide chlorogénique et rutine) et des échantillons a été réalisée dans les conditions expérimentales établies comme mentionné ci-dessus.

2.4. Animaux expérimentaux

Des souris BALB/c femelles âgées de 5 semaines ont été achetées au Centre des animaux expérimentaux de Shanghai de l’Académie chinoise des sciences, Shanghai, Chine (certificat n° SCXK 2007-0005). Les souris ont été acclimatées pendant une semaine avant d’être utilisées. La nourriture de laboratoire pour rongeurs et l’eau du robinet ont été fournies ad libitum et maintenues dans des conditions contrôlées avec une température de 24 ± 1°C, une humidité de 50 ± 10% et un cycle lumière/obscurité de 12/12 heures. Toutes les procédures étaient strictement conformes à la législation de la RP de Chine sur l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire et aux directives établies par l’Institut des animaux expérimentaux de l’Université de Zhejiang et ont été approuvées par le comité universitaire pour les expériences sur les animaux.

2.5. Sensibilisation, défi et traitement des souris

Les souris BALB/c femelles ont été divisées en six groupes : groupe témoin normal (NC), groupe témoin modèle (MC), groupe témoin positif (traité avec Dex, 2 mg/kg) et groupes SLPCD (5,5, 11 et 22 g/kg). Chaque groupe était composé de dix souris. L’inflammation des voies respiratoires des souris a été induite par l’OVA. Les animaux ont été immunisés par injection intrapéritonéale d’une solution contenant 50 μg d’OVA et 200 μg d’hydroxyde d’aluminium pendant 3 jours. Une sensibilisation de rappel a été administrée le 14e jour. Une semaine après la dernière sensibilisation, les souris ont été exposées à de l’OVA à 2 % en aérosol à l’aide du nébuliseur PARI TurboBOY N (1205) (PARI GmbH, Allemagne) pendant 1 h par jour pendant 8 jours. Quatre jours avant l’exposition, les souris sensibilisées ont reçu par voie orale des doses de SLPCD de 5,5, 11 et 22 g/kg ou une injection intrapéritonéale de 2 mg/kg de dexaméthasone (Dex) tous les jours pendant 12 jours. Les groupes témoins ont reçu le même volume de solution saline. Le volume de la dose était de 0,2 ml/10g de poids corporel. Dix souris, qui constituent le groupe témoin normal, ont seulement été sensibilisées et stimulées avec une solution saline. Les procédures employées pour la sensibilisation et les défis à l’OVA, ainsi que le traitement avec le SLPCD, ont été présentées dans la figure 1.

Figure 1

Protocole expérimental pour le modèle asthmatique induit par l’OVA et les processus de traitement.

2.6. Histopathologie pulmonaire

Les tissus pulmonaires ont été collectés 24 h après la dernière administration, puis fixés avec du paraformaldéhyde à 4%, inclus dans de la paraffine et sectionnés à 5 μm d’épaisseur. Une série de microsections a été colorée à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour une évaluation histologique.

2.7. Collecte du liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) et cytométrie en flux

Le LBA a été collecté par lavage du poumon avec une solution tamponnée au phosphate (PBS) délivrée par un cathéter endotrachéal 24 h après la dernière administration. Le LBA a été centrifugé pendant 5 min et les cellules ont été lavées avec du PBS glacé contenant 2% de FCS. Les cellules ont été bloquées avec 0,5 μg d’anticorps anti-souris CD16/CD32 purifié (blocage FcR) pendant 10 min sur glace pour inhiber la coloration non spécifique, puis colorées avec la combinaison d’anticorps anti-souris Ly-6G-FITC, antigène F4/80-PE-Cy5 et Ly-6C-APC, ou FceR1-APC, CD117-FITC et Siglec-F-PE à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité. Les cellules colorées ont été lavées avec du PBS glacé et remises en suspension dans du PBS. Cent mille cellules viables par traitement ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux BD FACScan utilisant le logiciel CellQuest.

2.8. Mesure de l’anticorps IgE total dans le sérum

Le sérum a été collecté 24 h après la dernière administration. L’anticorps IgE total a été détecté dans les échantillons de sérum individuels par le kit RayBio® mouse IgE ELISA. Les échantillons de sérum dilués au 1:1250 ou le standard d’IgE ont été ajoutés à des plaques à 96 puits recouvertes d’anticorps spécifiques anti-IgE de souris. Les plaques ont été incubées pendant 2,5 h à température ambiante, puis lavées quatre fois. L’anticorps de détection a été ajouté à chaque puits. Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant 1 h avant l’ajout de l’ABC conjugué à la peroxydase de raifort. Après une incubation de 45 min, les plaques ont été lavées et développées avec du TMB pendant 30 min à température ambiante. La réaction a été arrêtée par l’ajout de 20 μl de solution d’arrêt. L’absorbance a été mesurée sur un lecteur ELISA (BIO-RAD 680) à 450 nm.

2.9. Mesure des cytokines dans le BALF

Les concentrations de cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13) et Th1 (IFN-γ et IL-2) dans le BALF ont été détectées à l’aide de kits ELISA commerciaux comme précédemment .

2.10. PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

Les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13) et Th1 (IFN-γ et IL-2) dans les tissus pulmonaires ont été déterminés en utilisant la qRT-PCR. L’ARN total a été isolé à partir de tissus pulmonaires homogénéisés en utilisant le réactif Trizol selon le protocole du fabricant, et la transcription inverse a été réalisée comme précédemment . Ensuite, l’amplification a été réalisée dans 20 μl de réaction en utilisant le maître FastStart Universal SYBR Green. La PCR en temps réel a été réalisée à l’aide d’un système de PCR en temps réel ABI 7400. Les amorces pour la qRT-PCR ont été synthétisées par Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (Chine), et les séquences ont été répertoriées dans le tableau 2. Les cycles de la qPCR ont été réalisés comme suit : dénaturation initiale à 95°C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95°C pendant 10 s, puis d’un recuit à 60°C pendant 1 min. La GAPDH a été utilisée comme contrôle endogène. L’efficacité et la spécificité de l’amplification des amorces ont été vérifiées pour chaque jeu d’amorces. Les niveaux d’expression des gènes testés par rapport à la GAPDH ont été déterminés selon la méthode et en tant que fold induction .

2.11. Analyse statistique

Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type (ET) et examinées pour leur signification statistique de différence avec ANOVA et un test post hoc de Tukey. -Les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

3. Résultats

3.1. Profil HPLC du SLPCD

Les teneurs en acide chlorogénique et en rutine dans le SLPCD ont été analysées par HPLC. En comparaison avec les composés de référence standard, l’acide chlorogénique et la rutine ont été identifiés et déterminés (Figure 2). Les équations de régression de la courbe d’étalonnage des normes étaient A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) et A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) pour l’acide chlorogénique et la rutine, respectivement. Les concentrations d’acide chlorogénique et de rutine dans le SLPCD étaient de 1,4 mg/g et de 0,15 mg/g, respectivement.

(a)

(b)

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(a)
(b)

Figure 2

Chromatogrammes HPLC du SLPCD. Des chromatogrammes représentatifs des composés de référence standard (a) et du SLPCD (b) ont été montrés. ① Acide chlorogénique et ② rutine.

3.2. SLPCD a atténué l’inflammation des voies respiratoires chez les souris asthmatiques

L’effet du SLPCD sur l’inflammation pulmonaire chez les souris asthmatiques induites par l’OVA a été observé via la coloration H&E, et les résultats ont été présentés dans la figure 3. Les souris modèles asthmatiques présentaient une infiltration cellulaire inflammatoire interstitielle, péribronchiolaire et périvasculaire plus importante dans le poumon par rapport aux souris témoins normales. En tant que contrôle positif, le Dex a significativement soulagé l’infiltration de cellules inflammatoires interstitielles, péribronchiolaires et périvasculaires dans les poumons des souris asthmatiques. Les infiltrats inflammatoires dans les poumons des souris stimulées par l’OVA ont également été significativement atténués par le SLPCD par rapport au contrôle modèle.

(a)

(b)

(c)

.

(d)

(e)

(f)

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(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figure 3

Effets du traitement SLPCD sur les changements histopathologiques dans les poumons. Les sections pulmonaires ont été colorées à l’aide d’hématoxyline et d’éosine. Les photomicrographies illustrées sont représentatives des coupes de poumon de dix souris par groupe. (a) Contrôle normal (NC) ; (b) contrôle du modèle (MC) ; (c) dexaméthasone (Dex, contrôle positif) ; (d) SLPCD (5,5 g/kg) ; (e) SLPCD (11 g/kg) ; et (f) SLPCD (11 g/kg).

3.3. SLPCD a réduit les cellules inflammatoires dans le BALF des souris asthmatiques

Pour vérifier les effets du SLPCD sur l’infiltration des cellules inflammatoires dans le poumon des souris asthmatiques induites par l’OVA, le comptage des cellules inflammatoires, y compris les éosinophiles (Sigilec F+), les basophiles (CD117+), les neutrophiles (Ly-6C+y-6), les macrophages (F4/), les monocytes (Ly6G-Ly6C+) et les mastocytes (FcER1+) dans le LBA a été effectué par cytométrie de flux. Comme le montre la figure 4, le nombre d’éosinophiles (multiplié par 1756), de macrophages (multiplié par 114), de neutrophiles (multiplié par 110), de basophiles (multiplié par 91,7), de monocytes (multiplié par 45,8) et de mastocytes (multiplié par 6,9) dans le LBA de souris asthmatiques était nettement plus élevé que chez les souris témoins normales. Le dex a diminué de manière significative le nombre d’une variété de cellules inflammatoires testées dans le LBA de souris asthmatiques (), presque proche des niveaux des souris normales. Le nombre de ces cellules inflammatoires dans le LBA des souris asthmatiques a été significativement réduit de manière dose-dépendante par le SLPCD par rapport au groupe témoin modèle (, , ou ).

Figure 4

Effet du SLPCD sur le recrutement des cellules inflammatoires dans le LBA chez les souris asthmatiques induites par l’OVA. Le BALF a été collecté 24 h après la dernière administration et la composition cellulaire a été analysée par FACS décrite dans le texte. Les valeurs sont présentées sous forme de moyennes ± SD (). Les différences significatives par rapport au groupe de contrôle du modèle asthmatique (MC) sont désignées par , , et . Dex : dexaméthasone (contrôle positif), NC : groupe témoin normal.

3.4. Le SLPCD a diminué les niveaux d’IgE totaux sériques des souris asthmatiques

Les effets du SLPCD sur les niveaux d’IgE totaux sériques des souris asthmatiques ont été montrés dans la figure 5. Les taux sériques d’IgE totales chez les souris asthmatiques étaient significativement plus élevés que ceux des souris témoins normales (). En tant que médicament positif, le Dex a diminué de manière significative les niveaux d’anticorps IgE totaux sériques chez les souris asthmatiques induites par l’OVA (). Les niveaux d’anticorps IgE totaux sériques chez les souris asthmatiques ont été significativement diminués de manière dose-dépendante par le SLPCD par rapport au groupe témoin modèle ().

Figure 5

Effets du SLPCD sur les niveaux d’IgE totaux dans le sérum des souris asthmatiques induites par l’OVA. Le sérum a été collecté 24 h après la dernière administration et les niveaux d’IgE totales ont été mesurés à l’aide de kits ELISA décrits dans le texte. Les valeurs sont présentées sous forme de moyennes ± SD (). Les différences significatives par rapport au groupe témoin du modèle asthmatique (MC) sont désignées par . Dex : dexaméthasone (contrôle positif) et NC : groupe témoin normal.

3.5. SLPCD a modulé les niveaux de cytokines dans le BALF de souris asthmatiques

Les niveaux de cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13) et Th1 (IFN-γ et IL-2) dans le BALF ont été mesurés par ELISA. Comme le montre la Figure 6, la provocation par l’OVA a conduit à l’augmentation significative du niveau de IL-10 et IL-13 et à la diminution de celui de IFN-γ dans le LBA des souris asthmatiques par rapport au groupe de contrôle normal ( ou ). Cependant, les teneurs en IL-4, IL-5 et IL-2 dans le LBA des souris témoins modèles se sont révélées très faibles et proches de la limite de détection. L’administration de SLPCD à trois doses et de Dex a significativement diminué les niveaux d’IL-13 et d’IL-10, ainsi que remarquablement élevé celui de l’IFN-γ dans les BALF des souris asthmatiques induites par l’OVA par rapport aux souris témoins modèles ( ou ) (Figure 6).

Figure 6

Effets du SLPCD sur les niveaux de cytokines dans le LBA des souris asthmatiques induites par l’OVA. Le LBA a été collecté 24 h après la dernière administration. Les niveaux de cytokines Th1 (IL-10 et IL-13) et Th1 (IFN-γ) dans le LBA ont été mesurés en utilisant les kits ELISA décrits dans le texte. Les valeurs sont présentées sous forme de moyennes ± SD (). Les différences significatives par rapport au groupe témoin du modèle asthmatique (MC) sont désignées par et . Dex : dexaméthasone (contrôle positif) et NC : groupe témoin normal.

3.6. SLPCD a régulé les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques

Les effets de SLPCD sur l’expression de l’ARNm des cytokines de type Th1 et Th2 dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques induites par l’OVA ont été détectés en utilisant la qRT-PCR, et les résultats ont été présentés dans le tableau 3. Par rapport aux souris témoins normales, les niveaux d’expression des ARNm des cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13) ont été nettement augmentés et ceux des ARNm des cytokines Th1 (IL-2 et IFN-γ) ont été significativement réduits dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques (P < 0,001). L’administration de SLPCD à trois doses et de Dex a entraîné une baisse significative des niveaux d’expression des ARNm des cytokines Th2 IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13 et une augmentation de ceux des cytokines Th1 IL-2 et IFN-γ dans les tissus pulmonaires de souris asthmatiques par rapport aux groupes de modèles asthmatiques (P < 0,05, P < 0,01 ou P < 0,001).

Groupe Dose IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 IL-2 IFN-γ NC – 1.00±0.14 1,00±0,23 1,00±0,19 1,00±0,31 1,00±0,19 1,00±0,13 MC – 38.91±2.96 5.22±0.64 7.49±0.23 142.3±14.6 0.73±0.13 0.59±0.15 CTX (mg/kg) 50 19,08±2,62 2,56±0,42 5,07±0.67 44,00±7,74 1,20±0,20 2,14±0,34 SLPCD (g/kg) 5.5 21.70±4.64 4.06±0.38 6.68±0.68 71.26±10.62 1.28±0.20 1.12±0.20 11 21.30±3.71 3.74±0.37 6.21±0.44 65.4±11.99 1.33±0.26 1.53±0.21 22 23.09±3.27 3.07±0.34 6.03±0.65 61.51±8.77 1.49±0.34 1.71±0,23

Les tissus pulmonaires ont été collectés 24 h après la dernière administration et les niveaux d’expression de l’ARNm de la GAPDH et des cytokines ont été détectés par qRT-PCR en utilisant des amorces spécifiques. Le gène domestique GAPDH a été utilisé comme contrôle endogène. Les valeurs sont présentées sous forme de moyennes ± SD (). Les différences significatives par rapport au groupe de contrôle du modèle asthmatique (MC) sont désignées par , , et . Dex : dexaméthasone (contrôle positif) et NC : groupe témoin normal.

Tableau 3

Effet du SLPCD sur les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques induites par l’OVA.

4. Discussion

L’asthme est devenu un problème de santé publique dans le monde entier, en particulier dans les pays développés . Les glucocorticoïdes sont la thérapie de première ligne pour le traitement et le contrôle de l’asthme. Bien que ces médicaments puissent améliorer les symptômes de l’asthme, leur utilisation persistante a été strictement contrôlée en raison de leurs graves effets secondaires . De nouvelles approches thérapeutiques de l’asthme sont donc nécessaires. De nombreux médicaments traditionnels chinois présentent diverses activités biologiques, notamment des effets antibactériens, antifongiques, anti-inflammatoires, antianaphylaxiques et immunomodulateurs, qui ont un potentiel pour le traitement de l’asthme. Divers modèles d’inflammation broncho-pulmonaire allergique chez les souris expérimentales ont été décrits. Le modèle de souris pour l’asthme allergique induit par l’OVA reproduit de nombreuses caractéristiques de l’asthme humain et a été largement accepté. Par conséquent, nous avons étudié les effets antiasthmatiques de SLPCD et exploré ses mécanismes moléculaires en utilisant ce modèle.

SLPCD se compose de 13 médicaments traditionnels chinois. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum, et Herba Ephedrae sont les principaux composants qui dispersent le poumon et soulagent l’asthme. Le Semen Armeniacae Amarum, le Fructus Perillae cuit au four, le Semen Descurainiae et le Flos Farfarae frit au miel sont des composants auxiliaires qui réduisent les mucosités, soulagent la toux et l’asthme. Les composants adjuvants comprennent Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae, et Rhizoma Fagopyri Dibotrydis qui éliminent le mal de la chaleur et expulsent les maux superficiels, ainsi que Scorpio et Radix Angelicae Sinensis qui dispersent la stase sanguine, draguent les collatéraux, spasmolisent et arrêtent l’asthme. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmonisent tous les médicaments. Pris ensemble, tous les composants se complètent pour atteindre les résultats de dispersion du poumon, de descente du Qi et de soulagement de la toux et de l’asthme. Le contrôle de qualité de SLPCD utilisé dans cette étude a été entrepris en utilisant HPLC, et deux produits chimiques de référence (acide chlorogénique et rutine) ont été identifiés comme des composants majeurs de l’indice (Figure 2).

L’asthme allergique est défini comme une maladie inflammatoire aiguë-chronique des voies respiratoires avec un recrutement éosinophile caractéristique, une hyperplasie des cellules gobelets, une hypersécrétion de mucus, un dépôt de collagène, une hypertrophie des cellules musculaires lisses et une fibrose sous-épithéliale . Dans cette étude, les effets du traitement par SLPCD sur l’inflammation pulmonaire chez des souris asthmatiques stimulées par l’OVA ont été évalués par coloration H&E. L’accumulation allergique typique et l’infiltration de cellules inflammatoires ont été observées dans les tissus pulmonaires des souris modèles asthmatiques. Le traitement du SLPCD a réduit les infiltrats inflammatoires dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques (figure 3), ce qui suggère que le SLPCD atténue nettement l’inflammation des voies respiratoires.

Les cellules immunitaires inflammatoires jouent un rôle clé dans la pathogenèse et la gravité de l’asthme . Les cellules inflammatoires recrutées à partir des ganglions lymphatiques régionaux vers les voies respiratoires pourraient sécréter des cytokines et des chimiokines, entraînant une hyperréactivité des voies respiratoires . La réduction des cellules inflammatoires dans les voies respiratoires est un moyen efficace de traiter l’asthme. Pour confirmer que le SLPCD peut inhiber l’infiltration des cellules inflammatoires, nous avons compté les éosinophiles, les macrophages, les neutrophiles, les basophiles, les monocytes et les mastocytes dans le LBA. L’inhalation d’OVA a conduit à des augmentations significatives du nombre de ces six types de cellules inflammatoires dans le LBA (Figure 4). Les plis d’augmentation étaient de 1756, 114, 110, 91.7, 45.8, et 6.9 plis pour les éosinophiles, les macrophages, les neutrophiles, les basophiles, les monocytes, et les mastocytes, respectivement, indiquant un établissement satisfaisant d’un modèle d’asthme exacerbé dans cette étude. Le traitement par SLPCD a diminué de manière significative et dose-dépendante le nombre de ces cellules inflammatoires, en particulier les éosinophiles, dans le LBA par rapport aux souris asthmatiques (Figure 4). Ces résultats suggèrent que le SLPCD réduit l’infiltration de la cellule inflammatoire dans le poumon chez les souris asthmatiques induites par l’OVA, étant cohérent avec les résultats de l’observation histopathologique.

Il est bien connu que l’élévation des niveaux d’anticorps IgE a été corrélée avec l’inflammation allergique des voies respiratoires et l’hyperréactivité bronchique chez les souris modèles d’asthme . Coyle et al. ont signalé que les anticorps anti-IgE atténuaient l’inflammation éosinophile des voies aériennes et l’hyperréactivité bronchique chez les souris asthmatiques. Les IgE induites par les allergènes ont déclenché la sécrétion par les éosinophiles, les basophiles et les mastocytes des cytokines IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13. Par conséquent, nous avons évalué les niveaux d’IgE totaux sériques et avons constaté que le SLPCD pouvait réduire de manière significative les niveaux d’IgE totaux sériques chez les souris asthmatiques stimulées par l’OVA (Figure 5).

Le déséquilibre des cellules Th1/Th2 est considéré comme la cause immunologique de l’asthme . Dans l’asthme, l’activité des cellules Th1 est réduite, tandis que celle des cellules Th2 est activée, ce qui entraîne une augmentation des cytokines de type Th2 et une diminution des cytokines Th1 . Les cellules Th2 qui migrent vers les poumons sécrètent les cytokines prototypiques de type Th2, IL-4, IL-5 et IL-13, ce qui entraîne une hyperplasie des cellules des gobelets, une bronchoconstriction et une éosinophilie dans les voies respiratoires. In vitro, l’IL-13 peut médier la production d’IgE et jouer un rôle clé dans la pathogenèse des maladies allergiques médiées par les IgE. L’IL-13 peut également favoriser la survie des éosinophiles et contribuer aux activités pathologiques de ces cellules dans l’asthme. Les souris qui surexpriment l’IL-13 reproduisent plusieurs caractéristiques de l’asthme, notamment l’éosinophilie pulmonaire, l’hyperplasie épithéliale, l’obstruction des voies respiratoires et l’hyperréponse aux cholinergiques.

Supprimer la production de cytokines Th2 s’avérerait utile pour l’immunothérapie allergénique . D’autre part, les cellules activées par Th1 peuvent inhiber l’inflammation des voies respiratoires asthmatiques . Les cytokines Th1, telles que l’IFN-γ, inhibent le recrutement des éosinophiles induit par les allergènes et la libération d’IgE via la régulation à la baisse de l’expression de GATA-3, IL-4 et IL-5 dans les tissus pulmonaires du modèle asthmatique. Dans cette étude, nous avons évalué l’effet du SLPCD sur les niveaux de cytokines dans le LBA des souris asthmatiques. Les résultats ont montré que le SLPCD réduit de manière dose-dépendante les niveaux d’IL-13 et d’IL-10, mais augmente également le niveau d’IFN-γ dans le LBA des souris asthmatiques (Figure 6). L’action inhibitrice du traitement par SLPCD sur la production de cytokines Th2 était cohérente avec son effet sur les niveaux d’IgE totales dans le sérum.

Il a été rapporté que l’IL-5 joue un rôle important dans la prolifération, la différenciation, la maturation et la migration vers les sites tissulaires des éosinophiles . Les niveaux d’expression de l’ARNm de l’IL-5 dans les biopsies bronchiques des asthmatiques étaient régulés à la hausse par rapport aux contrôles non asthmatiques. Les niveaux d’expression de l’ARNm de l’IL-5 étaient corrélés à la sévérité clinique de l’asthme. La provocation allergénique cumulative a augmenté l’expression de l’ARNm de l’IL-4 dans les cellules de la FML et les cellules T CD4+ et CD8+ périphériques. Il a également été indiqué que l’IL-10 participe à l’asthme. L’augmentation de la transcription de l’IL-13 dans les cellules du LBA de patients souffrant d’asthme léger après une provocation allergénique à faible dose est cohérente avec le niveau d’expression plus élevé de l’ARNm de l’IL-13 dans la muqueuse bronchique. Les effets du traitement par SLPCD sur le niveau d’expression de l’ARNm des cytokines dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques ont été déterminés par qRT-PCR. Le traitement par SLPCD a considérablement diminué les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13) et augmenté ceux des cytokines Th1 (IL-2 et IFN-γ) dans les poumons des souris asthmatiques. Ces résultats ont confirmé les effets régulateurs du traitement par SLPCD sur les réponses des cytokines Th1 et Th2 dans les tissus pulmonaires des souris asthmatiques.

En conclusion, SLPCD pourrait inhiber de manière significative l’inflammation des voies aériennes, réduire les cellules inflammatoires dans le LBA, diminuer les niveaux d’IgE totaux dans le sérum, et moduler les contenus des cytokines dans le LBA et l’expression de l’ARNm des cytokines dans les poumons des souris asthmatiques. Ces résultats suggèrent que le SLPCD pourrait atténuer l’inflammation des voies respiratoires et atténuer la pathogenèse dans un modèle murin d’asthme par l’induction d’une réponse Th1/Th2 équilibrée et valider son utilisation clinique comme un médicament efficace dans le traitement de l’asthme.

Disclosure

L’adresse actuelle de Binnian Zhu est ACON Biotech (Hangzhou) Co, Ltd, Hangzhou 310030, Chine.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Contributions des auteurs

Binnian Zhu et Jun Dong ont contribué de manière égale à ce travail de recherche.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du projet de science et de technologie de Shaoxing (n° 2014B700722).