Effets cytotoxiques et génotoxiques de l’acéphate sur le sperme humain

Abstract

L’utilisation intensive de pesticides organophosphorés (OP) pourrait altérer la qualité du sperme et l’ADN des spermatozoïdes à différents stades de la spermatogenèse. L’acéphate est un OP très toxique utilisé de manière extensive et, par conséquent, nous avons cherché à évaluer les effets de l’acéphate sur la qualité du sperme humain et l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes. Des spermatozoïdes prélevés chez des hommes sains ont été exposés à 0, 50, 100 et 200 μg/mL d’acéphate et incubés pendant 1 h, 2 h et 3 h. Ensuite, la motilité, la vitalité, l’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique, la capacitation des spermatozoïdes et les dommages à l’ADN ont été examinés. Le résultat a montré un déclin significatif de la motilité à 100 μg/mL après 3 h et avec 200 μg/mL après 1 h, 2 h et 3 h. La viabilité a été significativement réduite à 200 μg/mL après 2 h et 3 h. L’intégrité fonctionnelle a été significativement affectée à 100 μg/mL après 3 h et à la dose de 200 μg/mL après 2 h et 3 h. De même, la capacitation des spermatozoïdes a été significativement affectée à la dose de 200 μg/mL après 1 h, 2 h et 3 h et à la dose de 100 μg/mL après 3 h. Les dommages à l’ADN ont été significativement augmentés uniquement à la dose de 200 μg/mL après 3 h. Cette étude suggère que l’exposition à l’acéphate peut entraîner des altérations de la structure et de la fonction des spermatozoïdes contribuant ainsi à la détérioration de la qualité du sperme humain déclenchant l’infertilité.

1. Introduction

Au cours des dernières décennies, plusieurs études ont montré une fonction reproductive destructrice chez les animaux et chez les humains en raison des produits chimiques fabriqués par l’homme et d’autres substances toxiques . Malheureusement, relativement peu d’études ont abordé systématiquement l’impact de l’exposition environnementale sur la santé reproductive humaine. Selon des études récentes, les couples souffrant d’infertilité (incapacité à concevoir après 12 mois de rapports sexuels réguliers non protégés) représentent chaque année environ 60 à 80 millions de personnes dans le monde. Quatre-vingt-dix-huit pour cent des cas de subfertilité masculine peuvent être attribués principalement à une qualité déficiente des spermatozoïdes . Cependant, la subfertilité peut être considérée comme idiopathique et pourrait être le résultat de facteurs de risque tels que les perturbateurs endocriniens environnementaux, y compris les pesticides.

Les pesticides organophosphorés sont des esters d’acides phosphoriques et thiophosphoriques et leur toxicité a été liée à leur capacité à inhiber l’action de l’acétylcholinestérase conduisant à l’accumulation d’acétylcholine aux jonctions nerveuses . De nombreuses études épidémiologiques ont reconnu l’association entre l’exposition aux pesticides organophosphorés (OP) et les troubles de la reproduction tels que l’infertilité, les anomalies congénitales, les issues défavorables de la grossesse et les décès périnataux. Les pesticides organophosphorés sont soupçonnés d’altérer la fonction de reproduction en réduisant l’activité de l’acétylcholinestérase dans le cerveau, ce qui affecte la gonadotrophine hypophysaire et provoque l’infertilité. Les effets sur la qualité du sperme peuvent être évalués par des paramètres tels que la concentration de spermatozoïdes, le pourcentage de spermatozoïdes mobiles et le pourcentage de spermatozoïdes de morphologie normale, ainsi que les paramètres de mouvement des spermatozoïdes. Plusieurs études ont révélé que les hommes exposés aux OP présentaient un risque élevé de développer des paramètres anormaux dans le sperme, notamment une diminution de la concentration et de la motilité des spermatozoïdes, une diminution du nombre de spermatozoïdes et une aneuploïdie plus élevée des chromosomes sexuels dans le sperme. Une étude menée en Chine avec différents OP a montré une relation claire entre la présence de métabolites urinaires d’insecticides et la concentration et la motilité des spermatozoïdes chez des hommes récemment mariés. Des études in vitro réalisées à l’aide d’OP ont fourni des preuves que ces pesticides pourraient endommager l’ADN dans le sperme humain, provoquant ainsi des effets génotoxiques .

Parmi les OP largement utilisés et toxiques au Sri Lanka, l’acéphate (O,S-diméthyl acétylphosphoramidothioate) est un insecticide, utilisé dans l’agriculture et à des fins domestiques en raison de sa propriété insecticide à large spectre. L’acéphate est un insecticide systémique qui agit par contact et par voie digestive. Le mécanisme de toxicité de l’acéphate est attribué non seulement à l’inhibition de l’acétylcholinestérase (AchE) mais aussi à son action en tant qu’agent neurotoxique retardé. Sing et Jiang ont signalé que l’acéphate est un puissant composé neurotoxique, mutagène, cancérigène et cytotoxique. De même, Farag et al. ont révélé que des doses d’acéphate de 14 et 28 mg/kg/jour diminuaient la motilité et le nombre de spermatozoïdes chez les souris mâles adultes. Deux autres études ont confirmé que l’acéphate diminue significativement la fertilité, la dynamique des spermatozoïdes, le poids des organes sexuels et les hormones sexuelles chez les rats albinos mâles. Par conséquent, comme pour les autres OP, il existe un risque potentiel de ce composé sur la santé reproductive des humains.

L’acéphate est largement utilisé par les agriculteurs du Sri Lanka, qui sont dans leur âge reproductif maximal. Au cours des deux ou trois dernières décennies, il est devenu évident que l’exposition professionnelle aux pesticides pouvait affecter la fertilité des hommes, indiquant ainsi des risques d’exposition élevés pour ces jeunes cultivateurs. La réglementation des pesticides est principalement basée sur des modèles animaux et les données sur l’exposition humaine et la qualité du sperme restent rares et limitées. Par conséquent, la présente étude a été menée pour étudier les effets de l’acéphate sur la fertilité masculine humaine et l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes in vitro.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Matériel d’essai

Acéphate non formulé (nom commercial : Surrender ; formule moléculaire : C4H10NO3PS ; poids moléculaire : 183,16 g/mol ; pureté : 99,0% ; dosage sur le terrain recommandé par le fabricant : 1 g d’acéphate dans 1 L d’eau) a été obtenu auprès de Hayleys Agriculture Ltd. à Colombo, Sri Lanka. L’acéphate étant facilement soluble dans le Biggers Whitten Whittingham (BWW), il a été utilisé comme témoin.

2.2. Collecte et préparation du sperme

Des échantillons de sperme ont été recueillis auprès de donneurs masculins en bonne santé (âgés de 20 à 30 ans) de l’Université de Sri Jayewardenepura, au Sri Lanka, dans un flacon d’échantillon stérile. Avant la collecte de sperme, les donneurs ont reçu une fiche d’information et un formulaire de consentement leur demandant de participer à l’étude. Il a été demandé à tous les sujets participants de s’abstenir de toute activité sexuelle pendant 3 à 5 jours avant le prélèvement du sperme. Des hommes (âge moyen de ) présentant une concentration, une motilité, une morphologie, une viscosité, un temps de liquéfaction et un pH normaux des spermatozoïdes et l’absence de formes immatures et de leucocytes ont été sélectionnés pour l’étude. Les paramètres des spermatozoïdes (motilité, vitalité, test de gonflement hypoosmotique et morphologie) ont été évalués conformément aux directives de l’Organisation mondiale de la santé. Comme les effets de l’acéphate pourraient s’amplifier avec des spermatozoïdes anormaux, il est important de sélectionner des donneurs ayant une qualité de sperme acceptable pour l’étude.

L’approbation éthique (numéro de référence de l’autorisation éthique : 712/13) a été obtenue par le Comité d’examen éthique, Faculté des sciences médicales, Université de Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Détermination des niveaux de dose

Pour déterminer les niveaux de dose, la valeur LD50 de l’acéphate pour la motilité des spermatozoïdes a été réalisée. Par conséquent, un échantillon avec 1 mg d’acéphate dans 1 mL d’eau de boisson, qui est équivalent à la dose recommandée sur le terrain (1 g d’acéphate dans 1 L d’eau) d’acéphate, a été préparé. Les échantillons préparés ont ensuite été dilués avec de l’eau potable pour obtenir différentes concentrations d’acéphate. Des suspensions de spermatozoïdes (fixées à 50 × 106 spermatozoïdes/mL) ont été placées dans des tubes Eppendorf et le volume désiré de BWW ou de solution d’essai a été ajouté (le volume final du tube est égal à 1 mL). Les échantillons ont été soigneusement mélangés, puis ont été incubés pendant 1 h dans un incubateur humidifié (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japon) à 37°C avec 5% de CO2. Après incubation, le pourcentage de motilité des spermatozoïdes a été déterminé à chaque concentration par deux observateurs indépendants sous microscope Olympus avec optique à contraste de phase (X 400 ; Olympus Corporation, Japon). Sur la base de cette enquête pilote visant à déterminer les indications de doses toxiques pour les échantillons de sperme, il a été révélé que la valeur de la DL50 de l’acéphate est de 200 μg/mL. Par conséquent, des concentrations sublétales inférieures à la DL50, y compris la valeur LD50, ont été utilisées dans la présente étude.

Donné ci-dessous est les niveaux de dose sélectionnés pour la présente étude : Dose élevée : 200 μg/mL (équivalent à la valeur LD50). Dose moyenne : 100 μg/mL. Dose faible : 50 μg/mL.De plus, nous avons décidé d’étendre les points de temps de 1 h à 2 h et 3 h pour déterminer les effets prolongés de l’exposition à l’acéphate.

2.4. Incubation des pesticides

Les échantillons de sperme frais () ont été dilués avec du BWW pour obtenir une concentration finale de 40 × 106 spermatozoïdes/mL. Par la suite, les échantillons ont été incubés soit avec le pesticide à des concentrations de 50, 100 et 200 μg/mL, soit avec BWW. Les incubations ont été réalisées dans 1 mL de volume final pendant 1, 2 et 3 h à 37°C dans un incubateur (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japon) dans une atmosphère à 5 % de CO2 et 95 % d’O2.

2.5. Détermination de la motilité des spermatozoïdes

Les spermatozoïdes mobiles totaux ont été estimés (environ 100 cellules) par deux observateurs indépendants sous optique à contraste de phase (X 400 ; Olympus Corporation, Japon). Le pourcentage de motilité vers l’avant a été calculé.

2.6. Essai de cytotoxicité

La viabilité des spermatozoïdes a été évaluée par la technique de coloration à l’éosine Y et les spermatozoïdes morts et vivants ont été calculés. Pourcentage de viabilité = (nombre total de cellules – nombre coloré/nombre total de cellules) × 100. Nombre total de cellules = 100.

2.7. Détermination de l’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique des spermatozoïdes

L’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique des spermatozoïdes a été évaluée à l’aide du test de gonflement hypoosmotique (HOS) décrit par Jeyendran et al . Au moins 100 spermatozoïdes ont été comptés par préparation.

2.8. Détermination de la capacitation

Une aliquote de 150 μL de milieu BWW a été placée dans une boîte de culture préchauffée (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) et recouverte d’une lamelle couvre-objet préchauffée de 22 × 22 mm. Une aliquote de 20 μL d’échantillon de sperme a été ajoutée dans un coin du couvre-objet. La boîte de culture a été placée dans un microscope inversé (Diaphot, Nikon, Londres, Royaume-Uni) équipé d’une armoire chauffée par air thermostaté (Nikon, Londres, Royaume-Uni) équilibrée à 37°C. L’état de capacitation des spermatozoïdes a été évalué en fonction de l’hyperactivation par la méthode photographique objective à l’aide d’un microscope à contraste de phase Olympus IX71. Puisque l’hyperactivation est un phénomène de flagelle, il est possible d’évaluer visuellement l’hyperactivation sur la base de la motilité des spermatozoïdes ; les schémas de mouvement des flagelles ont été évalués pour l’énumération des spermatozoïdes non hyperactivés et hyperactivés. Les expériences ont été réalisées en double et répétées indépendamment quatre fois.

2.9. Détermination des dommages à l’ADN des spermatozoïdes

Des frottis de sperme ont été préparés sur des lames microscopiques nettoyées et le pourcentage de spermatozoïdes à ADN normal a été déterminé en comptant 500 spermatozoïdes sous microscope à fluorescence (BH-2, Olympus Ltd, Japon) avec une excitation de 490 nm. La durée d’observation pour un seul champ était inférieure à 40-50 secondes. Les spermatozoïdes présentant une couleur jaune à rouge ont été notés comme ADN dénaturé et les spermatozoïdes présentant une couleur verte ont été notés comme ADN normal .

2.10. Analyse statistique

Les numérations de spermatozoïdes des mâles adultes étaient normalement distribuées et ont été comparées entre les groupes avec une analyse de variance (ANOVA) à deux voies en utilisant le progiciel Minitab (Minitab Co., USA) pour l’effet principal des pesticides. Lorsqu’un effet significatif du traitement a été trouvé, les différences entre les moyennes des groupes individuels ont été testées par « Tukey 95% ». Les données sont exprimées en tant que moyenne ± Erreur standard moyenne (SEM). valeur a été fixée à .

3. Résultats

3.1. Motilité des spermatozoïdes

Par rapport au contrôle, le pourcentage de motilité a été significativement () diminué (tableau 1) à la dose moyenne (100 μg/mL) de 16% après 3 h d’incubation. En revanche, une réduction hautement significative () a été enregistrée à 200 μg/mL après 1 h, 2 h et 3 h d’incubation par rapport aux contrôles. De plus, la réduction de la motilité est claire dans chaque dosage avec l’augmentation du temps d’incubation.

3.2. Cytotoxicité

Le pourcentage de viabilité a diminué (tableau 1) dans tous les groupes de traitement avec le temps, mais une réduction significative (de 20 % ; ) a été enregistrée à 200 μg/mL (forte dose) après 2 h d’incubation par rapport aux témoins. Une réduction hautement significative () a été enregistrée dans la dose élevée après 3 h d’incubation et elle a été diminuée de 31 % par rapport au contrôle.

3.3. Intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique des spermatozoïdes

Le tableau 1 présente les résultats de l’intégrité fonctionnelle des spermatozoïdes après 1 h, 2 h et 3 h d’incubation. Des réductions significatives () de l’intégrité fonctionnelle ont été enregistrées dans la dose moyenne de 13.5 % après 3 h et également à haute dose de 26 % après 2 h d’incubation par rapport à leurs contrôles. Une réduction hautement significative () a été enregistrée dans le dosage élevé (de 35%) après 3 h d’incubation.

3.4. Capacitation des spermatozoïdes

Une réduction des spermatozoïdes capacités a été observée dans tous les groupes de traitement (tableau 1). Le pourcentage de spermatozoïdes capacités était significativement réduit () à la dose de 100 μg/mL de 18 % après 3 h d’incubation et à la dose élevée de 32 %, 36 % et 38 %, respectivement, après 1 h, 2 h et 3 h d’incubation.

3.5. Dommages à l’ADN dans les spermatozoïdes

Le pourcentage du nombre de spermatozoïdes endommagés par l’ADN a augmenté avec l’augmentation du dosage et du temps d’incubation. Mais une augmentation significative () des dommages à l’ADN n’a été enregistrée qu’à un dosage élevé (de 33%) après 3 h d’incubation. Les résultats sont résumés dans le tableau 1.

4. Discussion

Les insecticides OP sont largement utilisés au Sri Lanka avec peu ou pas de protection par les utilisateurs et les individus sont donc à haut risque d’exposition. De plus, ces agriculteurs en âge de procréer sont inévitablement exposés sur une longue période de temps. La présente étude a été conçue pour démontrer l’association entre l’acéphate, un OP avec la qualité du sperme, et les dommages à l’ADN dans le sperme sur différents points de temps d’incubation. Les résultats obtenus dans le cadre de la présente étude indiquent que l’acéphate nuit à la motilité des spermatozoïdes, à leur viabilité, à l’intégrité de la membrane et à la capacitation des spermatozoïdes et induit des dommages à l’ADN in vitro. Des résultats similaires ont été obtenus avec des hydrocarbures chlorés , des organophosphates , et des métabolites du benzène .

La réduction significative de la motilité des spermatozoïdes observée à des doses moyennes (100 μg/mL) et élevées (200 μg/mL) d’acéphate pourrait entraîner une altération de la capacité de fécondation des spermatozoïdes . Après 3 h d’exposition à la plus forte dose, le pourcentage de motilité des spermatozoïdes était réduit en dessous des valeurs recommandées par l’OMS. La motilité des spermatozoïdes est considérée comme l’un des détecteurs les plus sensibles des effets cytotoxiques et de la réduction de la capacité de fécondation des spermatozoïdes. Les modifications du potentiel de la membrane mitochondriale par différents pesticides pourraient entraîner une réduction de la motilité des spermatozoïdes. La motilité des spermatozoïdes dépend également de l’intensité de la transformation et de la dépense d’énergie produites par les voies oxydatives de la mitochondrie, et les pesticides pourraient interférer avec les voies oxydatives, entraînant un retard de la motilité des spermatozoïdes et, finalement, la mort cellulaire. En outre, les métabolites des pesticides pourraient interférer avec les réactions oxydatives mitochondriales, entraînant la production d’un excès d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), ce qui diminuerait la production d’ATP et entraînerait des troubles de la motilité. Le stress oxydatif serait le principal mécanisme de toxicité des organophosphorés, y compris de l’acéphate. La perte d’intégrité peut entraîner une augmentation de la perméabilité membranaire et une perte de la capacité à réguler les concentrations intracellulaires d’ions impliqués dans le contrôle du mouvement des spermatozoïdes. L’effet global des dommages membranaires pourrait être responsable de la diminution continue de la motilité et de la viabilité des spermatozoïdes après l’éjaculation .

La viabilité est la proportion de spermatozoïdes vivants déterminée par l’évaluation de l’intégrité cellulaire et ou membranaire . Le test de coloration à l’éosine a fourni des informations sur l’intégrité structurelle de la membrane du sperme, tandis que le test HOS a fourni des informations sur l’intégrité fonctionnelle de la membrane du sperme . La viabilité des spermatozoïdes est associée à des membranes plasmatiques intactes, fonctionnelles et semi-perméables. Les pesticides peuvent provoquer une élévation des ions calcium et endommager les membranes des spermatozoïdes, affectant ainsi leur viabilité bien avant qu’ils n’atteignent l’ovocyte. Les changements dans la membrane plasmique observés dans la présente étude pourraient entraîner une réduction de la motilité, de la viabilité et de l’intégrité de la membrane des spermatozoïdes .

L’hyperactivation est dans une indication de l’achèvement de la capacitation des spermatozoïdes et est essentielle pour la pénétration à travers la masse cumulus et la zone pellucide . Dans la présente étude, il a été montré que les spermatozoïdes hyperactivés diminuaient en concentration élevée et diminuaient avec l’augmentation du temps d’incubation, indiquant une capacitation altérée des spermatozoïdes. La membrane et les mitochondries des spermatozoïdes sont essentielles à l’hyperactivation et tout dommage à la membrane et aux mitochondries des spermatozoïdes peut entraîner une réduction de la capacitation des spermatozoïdes. On sait que l’OP nuit à la capacitation par l’inhibition de l’AchE lorsqu’il est incubé avec des spermatozoïdes in vitro. Néanmoins, lors de l’ajout de quantités suffisantes d’AchE ou d’enzymes mimétiques de l’AchE dans le milieu, l’effet a été inversé , indiquant ainsi l’importance de l’activité de l’AchE de la membrane du sperme pour initier la capacitation.

La présente étude révèle un dommage significatif à l’ADN double brin à la dose la plus élevée (200 μg/mL) après 3 h d’incubation. L’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes est vitale pour transmettre l’information génétique pendant la reproduction et tout dommage à l’ADN pourrait entraîner l’infertilité . Les bases de l’ADN et les squelettes phosphodiesters sont particulièrement sensibles aux dommages induits par le stress oxydatif car leurs membranes plasmatiques contiennent de grandes quantités d’acides gras polyinsaturés et leur cytoplasme contient de faibles concentrations d’enzymes de piégeage. Par conséquent, des niveaux élevés de ROS pourraient entraîner des ruptures d’ADN double brin couramment observées dans les spermatozoïdes des hommes infertiles. On a constaté que l’acéphate augmente considérablement les espèces réactives de l’oxygène (ERO) cellulaires, ce qui entraîne des modifications de l’ADN en formant des erreurs de paires de bases et des cassures de brins. Les spermatozoïdes dont l’ADN est fragmenté sont moins mobiles et moins sensibles au gonflement hypoosmotique, ce qui indique une moindre intégrité fonctionnelle de la membrane des spermatozoïdes et entraîne donc une réduction de la fonction spermatique avec l’augmentation des dommages à l’ADN. Les pesticides induisant des dommages à l’ADN dans les leucocytes pourraient également conduire à des dommages à l’ADN dans les spermatozoïdes .

5. Conclusions

La présente étude est suggestive d’une possible altération de la fonction spermatique avec l’exposition à l’acéphate. La forte concentration d’acéphate (200 μg/mL, ce qui équivaut à la DL50) testée dans cette étude a altéré la motilité, la viabilité, l’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique et la capacitation des spermatozoïdes humains et a induit des dommages à l’ADN in vitro. Après avoir considéré les résultats et les réponses biologiques humaines naturelles telles que la dégradation et la clairance des produits chimiques, il pourrait être recommandé que le dosage plus élevé testé (200 μg/mL) et plus peut causer un risque pour la santé humaine.

Abréviations

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Solution hypoosmotique
NaCl :	Chlorure de sodium
OP:	Pesticide organophosphaté
ROS:	Espèces réactives de l’oxygène.

Approbation éthique

L’approbation éthique a été obtenue du comité d’examen éthique, Faculté des sciences médicales, Université de Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. Le numéro d’autorisation éthique est 712/13.

Conflits d’intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

L’aide précieuse apportée par le professeur Neelika Malavige, Département de microbiologie, Faculté de médecine, Université de Sri Jayewardenepura, pour fournir un incubateur de dioxyde de carbone et le Département de zoologie, Faculté des sciences, Université de Colombo, pour fournir des produits chimiques pour le projet est fortement appréciée.