Effets des statines sur l’angiogenèse et la vasculogenèse | Revista Española de Cardiología

Fig. 2. Représentation schématique de l’angiogenèse et de la vasculogenèse. (A) La vasculogenèse est l’agrégation d’angioblastes ou de cellules progénitrices endothéliales pour former des vaisseaux sanguins. Les angioblastes coalescent in situ ou migrent pour former des vaisseaux sanguins dans des sites distants. (B) L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants par la prolifération et la migration de cellules endothéliales différenciées. (C) L’angiogenèse et la vasculogenèse peuvent également se produire simultanément. (Tiré de Cleaver et al.29)

On pensait initialement que le processus vasculogène était limité au développement embryonnaire, alors que l’angiogenèse (qui se produit également dans l’embryon) était le seul processus impliqué dans la néovascularisation chez l’adulte. Cependant, le paradigme de la néovascularisation postnatale a été revu récemment et on a découvert que les cellules progénitrices endothéliales circulant dans le sang périphérique33 sont incorporées par les foyers de néovascularisation chez les animaux adultes34, qu’elles augmentent en nombre en réponse à l’ischémie tissulaire35 et qu’elles favorisent le développement de vaisseaux sanguins collatéraux après leur expansion in vitro et leur transplantation ultérieure36. Ces études ont établi que l’angiogenèse et la vasculogenèse sont toutes deux responsables de la néovascularisation chez l’adulte.

Un troisième mécanisme qui contribue probablement au développement des vaisseaux collatéraux est l’augmentation de la taille et du calibre des connexions collatérales artériolaires préexistantes, un processus appelé artériogenèse.37 La présence et le nombre de ces vaisseaux collatéraux natifs varient considérablement entre les individus et les espèces. Lorsqu’un vaisseau est occlus, il y a une augmentation de la vitesse du flux sanguin à travers les vaisseaux collatéraux préexistants et une augmentation de la contrainte de cisaillement luminal, facteurs qui contribuent à la maturation des vaisseaux collatéraux, en particulier ceux de taille intermédiaire.

Méthodes d’étude in vitro

Le développement de techniques de culture de cellules endothéliales a permis de comprendre les processus impliqués dans l’angiogenèse38. Les cellules endothéliales en culture conservent la capacité de répondre aux facteurs qui stimulent ou inhibent l’angiogenèse ainsi que la capacité de former des tubes endothéliaux in vitro. Les tests de prolifération cellulaire permettent d’analyser l’effet d’une certaine substance sur la prolifération des cellules endothéliales. La migration des cellules endothéliales vers une solution contenant une certaine substance, séparées par une membrane perméable, peut être examinée dans une chambre de Boyden. Les mécanismes de formation de l’endothélium tubulaire et l’effet d’une certaine substance sur les tubules peuvent être étudiés à l’aide d’essais bidimensionnels ou tridimensionnels. Avec ces techniques, on analyse les processus de formation de la lumière endothéliale et l’influence de la matrice extracellulaire sur le développement des capillaires.38 Enfin, les cultures de cellules endothéliales permettent d’étudier les voies moléculaires impliquées dans les processus d’angiogenèse.

Récemment, en utilisant des techniques de sélection cellulaire et des milieux de culture spéciaux, les techniques développées pour étudier les cellules endothéliales différenciées ont été utilisées pour étudier les cellules progénitrices endothéliales.33-36

Méthodes d’étude in vivo

Bien que les techniques in vitro permettent d’effectuer une analyse préliminaire de l’angiogenèse et de la vasculogenèse, de nombreux facteurs pouvant influencer ou moduler ces processus in vivo38. Afin d’étudier les mécanismes de formation des vaisseaux sanguins in vivo, différents systèmes biologiques ont été développés pour quantifier ou démontrer l’effet d’une certaine substance : modèles de cornée de souris, membrane chorioalantoïde d’embryon de poulet, ou implants spongieux.38 Ces systèmes nécessitent le sacrifice de l’animal, ils ne capturent donc l’effet qu’à un moment précis. Afin d’étudier l’évolution temporelle des événements dans un seul tissu, des techniques de microscopie intravitale ont été développées pour la peau du dos ou du crâne de la souris39. Enfin, le développement des techniques de génie génétique a permis d’étudier l’effet de la suppression (knock-out) ou de l’addition (knock-in) d’un gène sur les processus de vasculogenèse et d’angiogenèse.

L’étude de la vasculogenèse postnatale et de l’effet de certaines substances sur les processus de vasculogenèse a été possible grâce à l’utilisation de techniques de cytométrie en flux, de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), de techniques spéciales de culture de cellules progénitrices endothéliales (EPC) à partir du sang périphérique et de modèles de transplantation de moelle osseuse murine33-36. Le FACS est utilisé pour détecter et quantifier les EPC dans le sang périphérique en utilisant des anticorps contre les antigènes de surface de ces cellules. L’influence des médicaments ou des facteurs de croissance sur le nombre de ces cellules dans le sang périphérique peut être analysée de cette manière. Les techniques spéciales de sélection et de culture des cellules développées par notre groupe ont également permis de détecter et de quantifier les EPC. Dans le modèle murin de transplantation de moelle osseuse, les cellules de moelle osseuse d’une souris donneuse sont transplantées sur une souris réceptrice d’un gène codant pour l’élaboration d’une substance qui permet de la détecter ultérieurement (figure 3). Dans notre cas, le gène codait pour l’élaboration de la bêta-galactosidase par les cellules endothéliales. L’expression sélective est obtenue car ce gène est régulé par un promoteur spécifique des cellules endothéliales, Tie-2, chez la souris donneuse. Par conséquent, seules les cellules endothéliales de la moelle osseuse du donneur animal exprimeront la bêta-galactosidase qui peut être détectée dans le récepteur animal. Si les expériences biologiques décrites ci-dessus sont réalisées après la transplantation de moelle osseuse dans le récepteur animal, nous pouvons analyser l’influence d’une certaine substance sur la vasculogenèse en quantifiant le nombre de cellules progénitrices endothéliales dérivées de la moelle osseuse.

Fig. 3. Modèle murin de transplantation de moelle osseuse pour l’étude de la vasculogenèse. Les donneurs de moelle osseuse utilisés sont des souris transgéniques qui expriment de façon constitutive le gène LacZ (qui code la bêta-galactosidase) régulé par un promoteur endothélial spécifique, Tie-2. La moelle osseuse est extraite et transplantée sur une souris réceptrice dont la moelle osseuse a été irradiée par voie sublétale. Après une période de 4 semaines pour obtenir la reconstitution de la moelle osseuse transplantée, une ou plusieurs interventions sont effectuées sur le récepteur murin (le cas présenté est un modèle cornéen) pour stimuler la néovascularisation. Après ces interventions, les animaux sont sacrifiés et une étude histologique est réalisée pour détecter l’expression de la bêta-galactosidase. Avec la coloration X-GAL, les cellules qui expriment la bêta-galactosidase acquièrent une couleur bleutée. L’utilisation d’un promoteur spécifique des cellules endothéliales permet d’identifier les cellules bleues qui ont été incorporées dans les foyers de néovascularisation comme des cellules de lignée endothéliale.

EFFET DES STATINS SUR L’INDUCTION DE L’ANGIOGENESE ET DE LA VASCULOGENESE

Les investigations faites dans notre laboratoire et ailleurs ont démontré que les statines stimulent la voie de signalisation intracellulaire de la protéine kinase Akt/PKB,25-27 qui favorise à la fois l’angiogenèse25 et la vasculogenèse26. En outre, Vasa et al ont également pu démontrer chez l’homme les effets des statines sur la cinétique des EPC.28

Effets in vitro des statines

Les statines activent rapidement la protéine kinase Akt/PKB dans les cellules endothéliales25 et les EPC,26,27 augmentant ainsi la phosphorylation de l’eNOS et la production subséquente de NO. L’activation d’Akt par les statines favorise la prolifération, la migration et la survie cellulaire des cellules endothéliales et des EPC, ainsi que la formation de la structure vasculaire. En outre, l’inhibition d’Akt par l’utilisation d’adénovirus qui codent pour des formes négatives dominantes d’Akt entraîne une inhibition des effets induits par les statines. Le potentiel des statines dans les processus de régénération tissulaire a été démontré précédemment dans les ostéoblastes. Dans ces cellules, les statines ont augmenté la prolifération et le niveau d’activité, augmentant ainsi la formation osseuse.40

Bien que les mécanismes d’activation d’Akt par les statines ne soient pas connus avec précision, il est probable que la signalisation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) soit impliquée car ce processus est bloqué par la wortmanine et le LY294002, deux inhibiteurs de l’enzyme (Figure 1). En outre, l’inhibition de l’HMG-CoA réductase est nécessaire, car l’activation d’Akt par la simvastatine a été inhibée par l’ajout de mévalonate à l’incubation (Figure 1). Le mévalonate est nécessaire, non seulement pour la biosynthèse du cholestérol, mais aussi pour la production d’ubiquinone, de dolichols et d’isoprénoïdes, qui sont essentiels dans plusieurs processus cellulaires. Bien que les statines stabilisent l’ARN messager (ARNm) de la eNOS en modifiant la synthèse des isoprénoïdes41, nous n’avons pas observé de changements dans les valeurs de la protéine synthase eNOS. En ce sens, il est important de souligner que l’augmentation de la concentration d’ARNm a été plus tardive (24 h) que l’activation de la phosphorylation de la eNOS par Akt (15 min). Ce temps d’activation plus court est cohérent avec les changements induits par les statines dans la production de NO et dans la vasodilatation observée dans les annuli aortiques ex vivo42.

Effets in vivo des statines

Les statines et l’activation de la signalisation Akt intracellulaire favorisent l’angiogenèse dans des modèles d’ischémie périphérique développés chez des lapins normocholestérolémiques.25 Chez les animaux ayant reçu des statines, des pressions de perfusion plus élevées, un plus grand nombre de vaisseaux collatéraux et une plus grande densité capillaire ont été observés (Figure 4). D’autre part, les statines augmentent le nombre de cellules progénitrices endothéliales dans le sang périphérique chez les souris26,27 et les humains.28 De plus, les statines augmentent la néovascularisation cornéenne chez les souris normocholestérolémiques, en partie grâce à la vasculogenèse à partir de CPE obtenues à partir de la moelle osseuse (Figures 3 et 5).26 En utilisant le modèle murin de transplantation de moelle osseuse, il a été possible de démontrer un plus grand nombre de CPE provenant de la moelle osseuse dans les cornées des souris traitées avec des statines. Par conséquent, les statines ont un effet important sur la cinétique des EPC, comme cela avait été démontré précédemment avec le VEGF ou le facteur stimulant les colonies de granulocytes et de monocytes (GM-CSF),35 et la mobilisation de ces cellules induite par les statines pourrait augmenter la néovascularisation postnatale.

Fig. 4. Augmentation de la néovascularisation induite par les statines dans la jambe d’un lapin en réponse à une résection unilatérale de l’artère fémorale. a) L’artère fémorale et ses branches sont disséquées. Le transfert génétique à l’endothélium est effectué par infusion d’adénovirus codant pour la bêta-galactosidase (Ad-βgal) ou Akt (Ad-myrAkt) dans l’artère fémorale distale et incubation pendant 15 min tout en clampant temporairement la veine fémorale. b) Le troisième jour, le muscle gastrocnémien est extrait et la coloration X-GAL est réalisée pour déterminer la distribution transgénique dans des préparations histologiques colorées à l’hématoxyline-éosine. c) Une angiographie par l’iliaque interne est réalisée pour analyser la formation de vaisseaux collatéraux dans les différents groupes de traitement. Dans les angiographies réalisées à 40 jours, une augmentation de la formation des vaisseaux collatéraux est visible chez les animaux qui ont reçu 0,1 mg/kg de simvastatine par injection intrapéritonéale par rapport aux animaux qui sont intervenus mais qui ont seulement reçu une injection de solution saline. Une analyse quantitative des vaisseaux collatéraux a été réalisée dans le groupe témoin, le groupe traité à la simvastatine et le groupe d’animaux ayant reçu une injection intramusculaire de Ad-VEGF. Le score angiographique a été analysé dans les groupes expérimentaux ayant reçu une perfusion de solution saline, d’Ad-βgal et d’Ad-myrAkt 31 jours après la chirurgie. d) La coloration de la phosphatase alcaline dans le muscle adducteur de la jambe ischémique a révélé une plus grande densité capillaire dans le groupe d’animaux traités par la simvastatine par rapport au groupe témoin 40 jours après la chirurgie. Les données de chaque expérience sont présentées en moyenne±SD (n=6 lapins dans chacun des groupes de traitement, *P25)

Fig. 5. Augmentation de la néovascularisation cornéenne par la vasculogenèse induite par les statines. a) Photographies représentatives montrant la néovascularisation cornéenne (à gauche, véhicule ; à droite, simvastatine). b) Coloration X-gal de cornées entières. Les points bleutés sont des cellules qui expriment la bêta-galactosidase (à gauche, véhicule ; à droite, simvastatine). c) Microphotographies représentatives de l’étude histochimique de la fluorescence dans des cornées incluses en paraffine provenant de souris Tie2/LacZ/BMT (à gauche, véhicule ; à droite, simvastatine). La présence de cellules doublement positives est la preuve que des cellules progénitrices endothéliales (EPC) obtenues à partir de la moelle osseuse ont été incorporées par les foyers de néovascularisation (vasculogenèse). La couleur rouge indique dans ce cas la bêta-galactosidase et la couleur verte le marqueur endothélial spécifique, l’isolectine B4. Les cellules doublement positives (couleur jaune) sont des EPC obtenues à partir de la moelle osseuse qui ont été incorporées par les nouveaux vaisseaux. d) Microphotographies représentatives de l’étude histochimique de la fluorescence dans des cornées entières de souris Tie2/LacZ/BMT (à gauche, véhicule ; à droite, simvastatine). La couleur rouge indique la bêta-galactosidase et la couleur verte la lectine BS-1, marqueur endothélial spécifique. e) Quantification des EPC issus de la transplantation incorporés dans la néovasculature. Exprimé comme le rapport entre le nombre d’EPC et le nombre total de cellules endothéliales formant les nouveaux vaisseaux. *P26)

CONCLUSIONS

Les statines favorisent la prolifération, la migration et la survie cellulaire des cellules endothéliales et des EPC obtenues à partir de la moelle osseuse par des mécanismes liés à l’activation de la protéine kinase sérine/thréonine Akt ou PKB. D’une manière similaire au VEGF, les statines favorisent l’angiogenèse et la vasculogenèse. Par conséquent, l’activation d’Akt peut être responsable de certains des effets bénéfiques des statines, notamment la néovascularisation postnatale.