EMBL – European Molecular Biology Laboratory
Des informations sur la forme et la conformation d’une protéine ainsi que sur l’interaction entre les macromolécules peuvent être obtenues à partir des coefficients de sédimentation et de diffusion obtenus lors d’une expérience de vitesse de sédimentation. Les coefficients de sédimentation sont particulièrement utiles pour suivre les changements de conformation d’une protéine. Le modèle résultant pour la forme globale de la protéine ou du complexe protéique peut être comparé aux images obtenues par microscopie électronique pour évaluer dans quelle mesure ces images sont applicables au comportement de ces particules en solution.
Association
À la différence des autres méthodes d’étude des processus de liaison, la méthode de l’équilibre de sédimentation est particulièrement sensée pour l’étude des associations relativement faibles avec des constantes d’association (Ka) de l’ordre de 10-100 M-1. Cependant, il est également possible d’étudier des processus de liaison avec des valeurs Ka significativement supérieures à 107 M-1.
L’instrument
L’ultracentrifugeuse analytique dont nous disposons à l’EMBL est une Beckman Optima XL-A. L’instrument fait tourner l’échantillon de protéines sous vide à une vitesse et à une température contrôlées tout en enregistrant à des temps fixes la distribution de la concentration. Selon le rotor, la vitesse peut atteindre 60 000 tr/min (ce qui équivaut à 250 000 x g). Pour les mesures, on utilise des cellules spéciales qui résistent au champ gravitationnel élevé et qui permettent le passage de la lumière à travers l’échantillon. L’échantillon réel est placé dans une cavité en forme de secteur prise en sandwich entre deux fenêtres en quartz (voir figure 1). Cette cavité est située dans une pièce centrale en alliage d’aluminium ou en époxy renforcé. Des cellules à double secteur sont également utilisées pour pouvoir corriger l’absorbance du solvant de l’échantillon. Ces cellules permettent également de mesurer les différences de coefficient de sédimentation et les coefficients de diffusion. Les pièces centrales ont une longueur de trajet de 3 à 12 mm qui, combinée à des longueurs d’onde sélectionnables, permet d’examiner une large gamme de concentrations d’échantillons. Pour savoir comment assembler une cellule, veuillez consulter le protocole d’assemblage.