Frontières en pharmacologie

Introduction

Les peptides biologiquement actifs sont le terme général pour différents peptides qui constituent différentes compositions et arrangements d’acides aminés naturels. Ils sont connus pour posséder une variété de fonctions biologiques telles que des activités antioxydantes, de promotion immunitaire, de modulation hormonale, antibactériennes, antithrombotiques, antivirales et antihypertensives en raison de composés multifonctionnels dérivés de protéines animales ou végétales (Wang et al., 2017). En outre, ils présentent une grande sécurité alimentaire et une biodisponibilité élevée qui en font des candidats potentiels pour le développement de médicaments peptidiques fonctionnels et d’additifs alimentaires fonctionnels (Sarmadia et Ismaila, 2010).

Selon l’estimation de l’Organisation mondiale de la santé, les MCV sont responsables de la mortalité de plus de 17,5 millions de personnes chaque année. Parmi les caractéristiques importantes des MCV, l’hypertension est une cible essentielle pour la prévention et le traitement des MCV (Celermajer et al., 2012). Les médicaments hypotenseurs actuellement utilisés, tels que le captopril et l’énalapril, sont limités dans leur utilisation en raison d’effets indésirables tels que la toux, les éruptions cutanées et les maux de tête (Yu et al., 2018). Cependant, les incidences toujours croissantes des MCV nécessitent quelques alternatives nouvelles et sûres telles que les peptides actifs d’origine alimentaire. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés dans l’identification et le dépistage des composants alimentaires qui ont un effet positif sur la santé cardiovasculaire (Martinez-Maqueda et al., 2012 ; Liu et al., 2018). Parmi ces composés, les peptides ont suscité une attention particulière en raison de leur effet antihypertenseur. Auparavant, l’activité hypotensive in vitro des peptides a été principalement déterminée en mesurant l’activité inhibitrice de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA) qui est une dipeptidyl carboxypeptidase située sur la membrane cellulaire et qui peut causer des dommages élevés en perturbant l’équilibre entre les deux systèmes hormonaux qui régulent la pression artérielle et l’équilibre des fluides (Clayton et al., 2015 ; Gebre et al., 2018). En outre, il a été confirmé que les peptides anti-hypertenseurs d’origine alimentaire exercent un effet hypotenseur sur les patients hypertendus sans aucune toxicité ni effet secondaire (Martinez-Maqueda et al., 2012). La séparation et la purification des peptides anti-hypertenseurs à partir des protéines alimentaires fourniraient une nouvelle direction pour le développement de médicaments anti-hypertenseurs naturels.

Les ressources en graines de Ginkgo biloba ont été largement étudiées à travers le monde en raison de leur remarquable activité biologique et de leur action pharmacologique. La graine de Ginkgo, en tant que médecine traditionnelle chinoise, a une histoire de plus de 600 ans, mais on sait peu de choses sur ses principaux composants actifs. Seules quelques études ont rapporté les effets antioxydants, anti-fatigue et bactériostatiques de l’isolat de protéines de graines de G. biloba (Lena et Philip, 2002 ; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) ont hydrolysé le peptide de Ginkgo avec de l’alcalase et de la pepsine pour obtenir deux peptides antioxydants capables de piéger les radicaux libres et d’inhiber la peroxydation lipidique. Cependant, les peptides hypotenseurs de Ginkgo doivent être explorés davantage pour dévoiler leurs mécanismes sous-jacents pour une action plus élevée.

Dans le présent document, nous avons utilisé quatre types de protéases pour hydrolyser le GPI, afin de choisir l’un des hydrolysats avec une forte activité inhibitrice de l’ECA et d’effectuer une ultra-filtration pour obtenir des composants avec différents MWs. Les effets des MWs sur l’activité inhibitrice de l’ECA des GPHs ont été étudiés. De plus, la relation entre la composition en acides aminés et l’activité peptidique a été établie. Les peptides inhibiteurs de l’ECA nouvellement extraits ont été purifiés, identifiés et synthétisés ; leurs valeurs d’IC50 ont été testées et les modèles d’inhibition des peptides par les tracés de Lineweaver-Burk ont été explorés. Nous avons également élucidé le mécanisme d’inhibition de l’ECA en utilisant une analyse de docking moléculaire.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Les graines de G. biloba L. ont été achetées dans la ville de Linyi de la province de Shandong, en Chine. Les graines ont été égrenées, décortiquées et utilisées pour la suite de l’expérimentation. L’enzyme de conversion de l’angiotensine I et l’hippuryl-l-histidyl-L-leucine (HHL), l’acide hippurique ont été achetés respectivement chez Sigma (St. Louis, MO, Etats-Unis) et Yuanye Bio-Technology (Shanghai, Chine). Le captopril a été obtenu auprès de MedChem Express (NJ, États-Unis).

Préparation du GPI

Les graines de G. biloba L. ont été séchées à 45°C, puis broyées en poudre et tamisées à travers une maille de 80. La poudre a été lyophilisée après un traitement de déphénolisation et de dégraissage. La poudre de graines de G. biloba ainsi obtenue a été dissoute dans de l’eau distillée (1:20, p/v ; pH 10,0). La suspension ci-dessus a été agitée et extraite pendant 12 heures, puis centrifugée à 10 000 g pendant 30 minutes. Le surnageant obtenu a été réglé au point isoélectrique de la protéine ginkgo à pH 4,62 et incubé pendant 60 minutes, puis centrifugé à 10 000 g pendant 30 minutes. Le précipité obtenu a été remis en suspension à l’aide d’eau distillée, et la solution a été ajustée à pH 7. Par la suite, les GPI obtenues ont été lyophilisées jusqu’à leur prochaine utilisation.

Préparation d’hydrolysats de protéines de ginkgo (GPHs)

Pour cela, une solution de GPI à 4% a été préparée et hydrolysée séparément avec quatre protéases dans leurs conditions optimales d’hydrolyse pendant 5 heures. Les doses d’enzymes étaient de 2 000 U. Après l’hydrolyse, les enzymes ont été inactivées à 90°C pendant 10 min et la solution a été centrifugée à 3 000 g pendant 30 min pour obtenir les surnageants individuels obtenus à partir de quatre enzymes.

Degré d’hydrolyse

Le degré d’hydrolyse (DH) a été calculé en se référant à la méthode de Kimatu et al. (2017) comme suit :

où, B représentait la quantité (mL) de NaOH ajoutée pour maintenir le pH constant pendant le processus d’hydrolyse ; Nb était la concentration molaire de la solution de NaOH ; MP était la masse (g) de la protéine ; α désignait le degré moyen de dissociation dans les substrats protéiques pendant l’hydrolyse ; htot était le nombre total de liaisons peptidiques dans la protéine.

Isolation et purification du peptide inhibiteur de l’ECA

L’ultrafiltration de l’échantillon a été réalisée en utilisant un ultrafiltre de type coupe MSC300 (MoSu, Shanghai, Chine). L’échantillon a été ajouté à partir du port d’alimentation et la bouteille d’azote a été connectée au raccord du tuyau de la coupe d’ultrafiltration. Ensuite, la coupelle d’ultrafiltration a été placée et emballée sur l’agitateur magnétique relié à la bouteille d’azote gazeux avec une pression ne dépassant pas 0,22 MPa. Les échantillons ont été séquentiellement passés à travers des membranes d’ultrafiltration de 1, 3, 5 et 10 kDa et quatre composants ont été obtenus (<1, 1-3, 3-5, et 5-10 kDa). Les quatre fractions ont été recueillies, lyophilisées, puis utilisées pour tester l’activité inhibitrice de l’ECA. Les composants ayant une activité ECA plus élevée ont été sélectionnés pour une purification supplémentaire selon la procédure donnée par Zheng et al. (2017). L’hydrolysat lyophilisé (200 mg) obtenu après ultrafiltration a été remis en suspension dans de l’eau purifiée pour obtenir une concentration finale de 50 mg/mL et soumis à une purification supplémentaire à l’aide d’une colonne de filtration sur gel Sephadex G-15 (1,5 cm × 60 cm). Les échantillons ont été filtrés avec une membrane de microfiltration et l’élution a été effectuée avec de l’eau distillée à un débit de 1 mL/min. L’échantillon a été contrôlé et séparé à une longueur d’onde de 220 nm en utilisant la CLHP semi-préparative P270 (Aixin, Guangzhou, Chine). Les fractions (7,5 mL chacune) ont été recueillies et lyophilisées.

Détermination de l’activité inhibitrice de l’ECA

Ce test a été réalisé selon les descriptions sont données par le rapport précédent de O’Loughlin et al. (2014) avec quelques modifications. Brièvement, le substrat hippuryl-histidyl-leucine (HHL, 5 mM) et les échantillons ont été mélangés dans du Na2 0,1 M (pH 8,3) avec du chlorure de sodium 0,3 M. Puis après, 50 μL d’échantillon et 150 μL du substrat ont été ajoutés dans un tube à centrifuger, mélangés et laissés dans l’eau à 37°C pendant 5 min. Ensuite, la solution d’ACE (50 mU/mL) a été ajoutée et incubée à 37°C pendant 45 min. La réaction a été interrompue par l’ajout de 250 μL de HCl 1M et la solution a été filtrée à travers un filtre à seringue en nylon de 0,45 μM avant d’être analysée par RP-HPLC (Waters, Milford, MA, États-Unis) sur un Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, taille de particule de 5 μm). La phase mobile était composée d’eau distillée : acétonitrile = 75:25 (V/V, avec 0,1 % de TFA) avec un débit de 0,5 ml/min et une détection à 228 nm. Le captopril a été utilisé comme témoin et l’activité inhibitrice (%) a été déterminée comme suit :

où A est la surface du pic de l’acide hippurique avec l’échantillon, B est sans l’échantillon.

Analyse par CL-MS/MS et identification des séquences peptidiques purifiées

Les échantillons purifiés ont été analysés par Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, États-Unis) en utilisant un Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, États-Unis). L’échantillon a été dessalé et lyophilisé, reconstitué dans une solution de FA à 0,1% et stocké à -20°C jusqu’à sa prochaine utilisation. Les deux phases mobiles étaient les suivantes : la phase mobile A constituait une solution aqueuse d’acide formique à 0,1%, et la phase mobile B était une solution aqueuse d’acide formique à 0,1% d’acétonitrile (acétonitrile à 84%). Après équilibrage de la colonne avec 95 % de la solution A, l’échantillon a été chargé de l’échantillonneur automatique à la colonne Trap. Le rapport masse/charge des fragments de peptides a été collecté comme suit : 20 motifs de fragments au total ont été acquis après chaque balayage complet. Le fichier brut du test de spectrométrie de masse a été recherché à l’aide du logiciel Mascot 2.2 pour la base de données correspondante.

Synthèse des peptides

Les peptides inhibiteurs potentiels de l’ECA identifiés par LC-MS/MS ont été synthétisés chez GL Biochem (Shanghai, Chine). La pureté des peptides synthétiques a ensuite été confirmée par HPLC, qui était supérieure à 95%.

Cinétique de l’inhibition de l’ECA

Le modèle d’inhibition cinétique du peptide G. biloba a été testé en utilisant la méthode de Lin et al. (2017). Brièvement, on a laissé différentes concentrations de substrat HHL (0,5, 1, 2 et 5 mM) réagir avec l’ECA. Le tracé de Lineweaver-Burk était basé sur l’inverse de la vitesse de réaction (1/v) et de la concentration du substrat (1/). Les intercepts sur les axes X et Y représentaient les réciproques du Km et du Vmax, respectivement.

Analyse de docking

Pour cela, le fichier de structure tridimensionnelle de la protéine ACE (PDB ID : 1O8A) de la banque de données sur les protéines RCSB (PDB1) a été téléchargé. La structure tridimensionnelle des peptides de G. biloba a été dessinée à l’aide du logiciel de simulation moléculaire Discovery Studio 3.5. L’hydrotraitement a été effectué et l’énergie a été minimisée par le programme CHARMM. En outre, Zn2+ a été retenu dans le modèle ACE. Le logiciel DS 3.5 a noté le résultat de l’amarrage selon sa propre fonction de notation, basée sur les scores et l’énergie libre combinée de chaque résultat. Parmi tous les résultats, un meilleur résultat d’arrimage a été sélectionné.

Analyse statistique

Analyse de variance à une voie, suivie de tests à plages multiples de Duncan en utilisant SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, États-Unis) a été utilisée pour l’analyse des données avec une différence de signification (P ≤ 0,05).

Résultats

DH et activité inhibitrice de l’ECA des GPH

Comme on peut le voir sur la figure 1A, la DH a été prolongée avec le temps pendant tout le processus d’hydrolyse. DH a augmenté rapidement avant l’intervalle de 2 h, puis après, le taux d’augmentation a progressivement ralenti avec le temps. En général, le taux d’hydrolyse était élevé pendant la première heure, puis il a diminué ou est devenu constant par la suite. Parmi les quatre protéases, l’alcalase avait la DH la plus élevée, qui atteignait 14,7 % après 5 h, suivie par la trypsine (8,91 %) et la dispase (6,91 %). La DH la plus faible a été observée pour le flavourzyme, qui n’était que de 3,23% à 5 h. Ces résultats impliquent que la GPI a été clivée par les protéases à différents sites, ce qui a entraîné des hydrolysats de protéines avec des compositions peptidiques différentes.

Concernant l’activité inhibitrice de l’ECA des quatre hydrolysats de protéase, l’activité a augmenté avec la DH au cours de la période de temps. Comme le montre la figure 1B, les activités inhibitrices de l’alcalase, de la trypsine, de la dispase et du flavzyme à 5 h étaient respectivement de 62,70, 39,81, 48,39 et 25,95 %. En raison de leurs différents sites de clivage, différents peptides présentant diverses activités inhibitrices de l’ECA ont été obtenus. Parmi eux, l’activité de l’hydrolysat alcalin était relativement plus forte, ce qui indique que la protéase alcaline peut produire efficacement un hydrolysat avec un effet inhibiteur de l’ECA plus élevé.

Activité inhibitrice de l’ECA des GPH et de la fraction membranaire

L’activité inhibitrice de l’ECA des GPH et des fractions résultantes dépendait significativement du MW, comme le montrent les figures 1C,D. À des concentrations d’échantillon de 1 mg/mL, l’activité inhibitrice de l’ECA a progressivement augmenté à mesure que le MW des composants diminuait. L’activité d’inhibition à 3-5 et 5-10 kDa était de 44,94 % (IC50 = 1,257 mg/mL), 44,04 % (IC50 = 1,765 mg/mL), respectivement. Par la suite, l’activité a progressivement augmenté avec le MW inférieur et a atteint le niveau le plus élevé (69,86% ; IC50 = 0,224 mg/mL) à <1 kDa.

Purification de peptides de Ginkgo

L’alcalase est souvent utilisée pour la préparation de peptides actifs en raison de sa large spécificité et de sa forte capacité à dégrader les protéines. A partir du traitement par ultrafiltration, il a été révélé que l’activité inhibitrice de l’ECA s’améliore avec la diminution du MW du polypeptide. Par conséquent, le peptide de la fraction <1 kDa a été purifié davantage en utilisant la colonne Sephadex G-15. Comme on peut le voir sur la figure 2A, la colonne Sephadex G-15 a été divisée en trois composants (A1, A2 et A3). Les trois composants ont été recueillis et lyophilisés, et leurs activités inhibitrices de l’ECA ont été mesurées. Les résultats sont présentés dans la figure 2B. Les activités inhibitrices de l’ECA des trois composants (1 mg/mL) étaient de 64,08, 58,55 et 74,96 %, respectivement. Par conséquent, le composant A3 le plus actif a été sélectionné pour l’identification structurelle de l’étape suivante.

Identification des peptides de Ginkgo et synthèse des peptides

Afin d’identifier le potentiel peptide inhibiteur de l’ECA, le composant A3 le plus actif a été analysé par LC-MS/MS (tableau supplémentaire S1). Sur cette base, trois peptides ont été sélectionnés à partir du composant A3 et leurs séquences d’acides aminés étaient Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY), et Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (Figure 3). Les séquences identifiées de ces peptides étaient composées de 5 à 7 résidus d’acides aminés. Pour identifier l’activité inhibitrice de l’ECA de ces trois fractions peptidiques, les peptides ont été synthétisés chimiquement. Les peptides synthétisés obtenus ont été identifiés par spectrométrie de masse (Figures 4A-C). Les résultats ont montré que les valeurs IC50 de TNLDWY, RADFY et RVFDGAV étaient de 1,932, 1,35 et 1,006 mM, respectivement (Figure 4D).

Mécanisme d’inhibition des peptides de Ginkgo

Le mode d’inhibition du peptide de G. biloba a été analysé selon le tracé de Lineweaver-Burk. Comme on peut le voir sur la figure 5, lorsque le peptide de Ginkgo TNLDWY a été ajouté, le Vmax et le Km ont été modifiés, le Vmax a augmenté avec l’augmentation de la concentration du peptide ; alors que le Km n’a pas changé de manière significative avec la concentration du peptide, ce qui indique que son mode d’inhibition peut être un mode d’inhibition non compétitif. Pour RADFY et RVFDGAV, le Vmax n’a pas changé significativement avec la concentration ; alors que le Km a augmenté avec la concentration croissante du peptide, ce qui indique que les deux peptides sont des inhibiteurs compétitifs, qui peuvent se lier aux sites actifs de l’ECA, bloquant ainsi la liaison de l’ECA au substrat et inhibant l’activité de l’ECA.

Simulation de docking moléculaire entre les peptides et l’ECA

Dans cette étude, l’interaction de trois peptides avec l’ECA a été évaluée. Les résultats ont montré que tous les peptides pouvaient bien se lier à l’ACE et former un complexe stable, indiquant leur utilisation comme inhibiteur potentiel de l’ACE. Le score de l’énergie d’interaction – Cdocker est présenté dans le tableau 1. Les scores des fractions TNLDWY, RADFY, et RVFDGAV étaient respectivement de 102,995, 105,335, et 117,706. Les résultats de l’amarrage moléculaire sont présentés dans la figure 6 et le tableau 2. La position optimale de docking de TNLDWY peut former six liaisons hydrogène, parmi lesquelles il a formé des liaisons hydrogène avec Ala 354, Tyr523 dans la poche active S1, His353, His513 dans la poche active S2, et des résidus Zn2+ et il a été trouvé lié de manière stable avec tous ces résidus. Cela peut être lié à la forte activité inhibitrice de l’ECA du peptide. Il a été observé sur la Figure 6B que RADFY peut former sept liaisons hydrogène avec des résidus d’acides aminés, et des liaisons hydrogène intermoléculaires avec les résidus Gln281, His353, His513, et Tyr520 dans la poche active S2. La formation de ces liaisons hydrogène a grandement stabilisé le complexe enzyme-peptide. De plus, RADFY a formé une liaison ionique avec Zn2+, des forces conjuguées avec Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511, et Tyr523 ainsi qu’une force de van der Waals avec le résidu d’acide aminé Trp356. Ces interactions peuvent entraîner la déformation du ligand Zn2+ et l’inactivation de l’ACE. Par rapport à TNLDWY et RADFY, RVFDGAV peut former quatre liaisons hydrogène avec des résidus d’acides aminés, ce qui était connecté de manière stable à ALA354, TYR523 dans la poche active S1, et Glu162 dans la poche active S1′. Cependant, RVFDGAV pouvait former des liaisons ioniques avec Zn2+, ce qui conduisait directement à la désactivation des molécules ACE. En outre, il a formé un conjugué avec les résidus d’acides aminés tels que Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457, et Phe527 (Figure 6C).

Discussion

Ces dernières années, les peptides inhibiteurs de l’ECA d’origine alimentaire issus de protéines végétales ont attiré de plus en plus d’attention en raison de leurs effets secondaires moindres. Dans cette étude, l’alcalase, la dispase, la trypsine et le flavzyme ont été utilisés pour hydrolyser la protéine de Ginkgo. La DH et l’activité inhibitrice de l’ECA de l’hydrolysat de protéines de Ginkgo obtenu par hydrolyse de l’alcalase ont été rapportées comme étant les plus élevées. Le processus d’hydrolyse s’est déroulé rapidement pendant la phase initiale, ce qui a entraîné l’hydrolyse de nombreuses liaisons peptidiques, puis après, le taux d’hydrolyse a été ralenti en raison de la réduction progressive de la disponibilité des substrats pour l’hydrolyse (Ketnawa et al., 2017 ; Hu et al., 2018 ; Wei et al., 2018). Ces résultats étaient cohérents avec le rapport précédent des hydrolysats de protéines de colza avec une action inhibitrice efficace de l’ECA lorsqu’ils sont hydrolysés avec l’alcalase (He et al., 2013).

L’enzyme de conversion de l’angiotensine est une dipeptidase extracellulaire multifonctionnelle présente dans différents tissus. L’activité inhibitrice de l’ECA diminue la pression artérielle en réduisant la production d’angiotensine II et en réduisant la destruction des kinines (Zheng et al., 2017). L’activité inhibitrice de l’ECA de l’hydrolysat était liée à la distribution du poids moléculaire. L’ultrafiltration a été utilisée pour séparer l’hydrolysat de Ginkgo en cinq composants. Au poids moléculaire <1 kDa, l’activité inhibitrice de l’ECA de l’hydrolysat de Ginkgo était la plus élevée. Cette observation était conforme aux études précédentes rapportant l’activité ECA plus élevée des polypeptides de faible MW (Wang et al., 2015 ; Ola et al., 2017). En outre, Silvestre et al. (2012) ont confirmé que le traitement par ultrafiltration peut retenir les peptides (AAA) en position C-terminale pour favoriser l’activité inhibitrice de l’ECA.

Afin de purifier davantage le peptide inhibiteur de l’ECA hautement actif, le composant Ginkgo (<1 kDa) a été séparé par chromatographie par filtration sur gel, et la séquence d’acides aminés a été identifiée par LC-MS/MS. Ainsi, trois nouveaux peptides inhibiteurs de l’ECA ont été obtenus : TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM), et RVFDGAV (1,006 mM) qui ont montré une forte activité inhibitrice de l’ECA. Selon le rapport de Hernández-Ledesma et al. (2011), la plupart des peptides inhibiteurs de l’ECA étaient de courtes séquences composées de 2 à 12 acides aminés. En outre, l’activité du peptide inhibiteur de l’ECA était fortement liée à la présence de son acide aminé C-terminal, de son acide aminé aromatique et de son acide aminé hydrophobe. Par exemple, la présence de l’acide aminé aromatique (Tyr, Phe, et Trp) augmente significativement l’activité du peptide inhibiteur de l’ECA. En outre, l’Arg est également connu pour jouer un rôle important dans le peptide inhibiteur. Toopcham et al. (2017) ont montré que l’activité inhibitrice du polypeptide était significativement réduite après l’élimination de l’Arg. En outre, Liu et al. (2018) ont prouvé que l’acide aminé tel que Leu dans le peptide affectait significativement l’activité inhibitrice de l’ACE, quelle que soit sa position à l’extrémité C-terminale ou N-terminale. Des résultats similaires ont également été rapportés par Lee et Hur (2017). Ces études ont rapporté que les peptides KPLL, VLAQYK et DLP provenant de différents matériaux protéiques présentaient une activité inhibitrice de l’ECA appréciable en présence d’un acide aminé hydrophobe (Leu). Dans notre étude, le Tyr était situé à l’extrémité C-terminale de TNLDWY et RADFY. En outre, les deux peptides de RADFY et RVFDGAV contenaient Arg à l’extrémité N-terminale, et la teneur en acides aminés hydrophobes dans les trois peptides était plus élevée. Surtout, les fragments peptidiques correspondaient aux caractéristiques structurelles des peptides inhibiteurs de l’ECA.

Le mode d’inhibition des peptides inhibiteurs de l’ECA a été observé généralement non compétitif, compétitif et mixte. Pour les peptides courts (2-12 acides aminés), la plupart d’entre eux étaient des inhibiteurs compétitifs et ils se fixaient à l’enzyme ACE afin d’empêcher la liaison du substrat HHL. Une étude similaire de Lin et al. (2017) a prouvé que les peptides KYIPIQ et LPLPLL de la caséine Qula présentaient un mode d’inhibition compétitif. Cependant, pour les inhibiteurs non compétitifs, ils se lient à des sites autres que le site de liaison du substrat de l’enzyme et affectent finalement la liaison du substrat à l’enzyme. Des schémas similaires ont été observés dans le cas de peptides inhibiteurs d’origine alimentaire tels que le PFPGPIPN de la caséine Qula, et le peptide YLVR de la noisette (Lin et al., 2017 ; Liu et al., 2018). Dans ce mode compétitif, l’ECA, le substrat et le peptide ont formé un complexe enzyme-substrat-inhibiteur, qui a empêché la poursuite de la libération du produit et a entraîné une diminution du Vmax (Barbana et Boye, 2011).

L’étude du mécanisme d’interaction moléculaire entre l’ECA et les peptides inhibiteurs est utile pour le criblage et la conception de nouveaux peptides inhibiteurs de l’ECA. Cependant, les informations disponibles sur les interactions moléculaires des peptides inhibiteurs sont insuffisantes. Le docking moléculaire est basé sur le « principe de la serrure et de la clé » des ligands et des récepteurs, simulant l’interaction entre les ligands de petites molécules et les biomacromolécules réceptrices. Le mode de liaison et l’affinité entre eux permettent le criblage virtuel de médicaments. L’ECA est une enzyme carboxydipeptidique dépendante du Zn2+, dans laquelle le Zn2+ est une partie importante du centre actif de l’ECA (Pina et Roque, 2009). Selon les données précédemment rapportées (Pan et al., 2012), les principaux résidus d’interaction sur le site actif de l’ECA ont été divisés en trois poches actives (S1, S2 et S1′). S1 (Ala354, Glu384 et Tyr523) ; S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 et Tyr520) ; et S1′ (résidu Glu162). Au niveau du site actif de l’ECA, deux histidines (His383 et His387) ainsi que Glu 411 constituaient un ligand Zn2+. Il a été signalé que l’inhibition de l’activité de l’ECA induite par les peptides peut être obtenue par la combinaison de complexes enzyme-peptide stables aux liaisons hydrogène (Fu et al., 2017). En outre, la formation de forces de van der Waals avec des résidus d’acides aminés tels que His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 et Pro519, l’interaction conjuguée avec Tyr360 et les interactions non covalentes avec Glu384, Arg522 peuvent également contribuer à la stabilité des complexes enzyme-peptide. La présence de ces forces rendra la structure du complexe enzyme-peptide plus stable, plus propice à l’inhibition de l’activité de l’ECA, ce qui peut être la raison de la forte activité inhibitrice de l’ECA de TNLDWY, RADFY, et RVFDGAV.

Conclusion

Dans cette étude, les graines de G. biloba ont été utilisées pour préparer des peptides potentiels inhibiteurs de l’ECA. Les GPH préparés à partir de différentes protéases ont présenté une activité inhibitrice de l’ECA diversifiée in vitro. La plus forte DH et les activités inhibitrices de l’ECA in vitro ont été observées dans les GPH préparés à partir de l’alcalase. Les composants obtenus par ultra-filtration avec l’alcalase ont montré que les peptides de plus petit MW conféraient la plus forte activité inhibitrice de l’ECA. Trois peptides inhibiteurs potentiels de l’ECA (TNLDWY, RADFY, et RVFDGAV) ont été obtenus à partir de la fraction peptidique (<1 kDa) par LC-MS/MS. RVFDGAV a montré la plus grande activité inhibitrice de l’ECA avec une valeur IC50 de 1,006 mM et est apparu comme un inhibiteur compétitif. Les résultats du docking moléculaire ont indiqué que les peptides pouvaient se lier fermement à l’ECA et interagir ensuite avec les résidus d’acides aminés du site actif de l’ECA. Nos résultats ont indiqué que les peptides obtenus par hydrolyse enzymatique de l’alcalase présentaient une activité inhibitrice efficace de l’ECA in vitro, ce qui en fait des candidats potentiels pour le développement d’aliments fonctionnels ou de médicaments antihypertenseurs dans le futur.

Contributions des auteurs

F-FM, HW, C-KW et KT ont participé à la conception du projet, ont réalisé la plupart des expériences et ont rédigé le manuscrit. Z-JW et LJ ont contribué à la conception du projet expérimental, à la rédaction du manuscrit et à sa soumission. Tous les auteurs ont participé à la rédaction du manuscrit et/ou l’ont révisé de manière critique pour le contenu intellectuel important.

Financement

Cette étude a été soutenue par les grands projets de science et de technologie de la province d’Anhui (17030701024, 17030701058, et 17030701028) et le projet clé de recherche et de développement de la province d’Anhui (1704g07020110 et 1804b06020347).

Déclaration de conflit d’intérêts

HW était employé par Anhui Habopharmqnceutical Co…, Ltd. Z-JW était employé par Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd.

Les autres auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Matériel supplémentaire

Le matériel supplémentaire pour cet article peut être trouvé en ligne à : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Notes de bas de page

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

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