Inhibiteur des protéines de l’apoptose : Traduire les connaissances de base en pratique clinique

La famille des protéines inhibitrices de l’apoptose des inhibiteurs de caspase

Les IAPs sont une famille d’inhibiteurs de caspase qui inhibent spécifiquement les caspases 3, 7 et 9 et empêchent ainsi l’apoptose. Crook et al. (17) ont identifié le premier membre de la famille IAP de manière fortuite lors de l’étude de l’apoptose induite par le vAcAnh dans les cellules de baculovirus SF21. Au cours d’une recherche de gènes de baculovirus qui imitaient les actions de p35 et inhibaient l’apoptose induite par le vAcAnh, ils ont identifié un nouveau gène de 1,6 kb codant pour une protéine antiapoptotique de 31 kDa avec un motif de type doigt de zinc (17). Des études ultérieures ont identifié des IAPs dans une gamme diverse d’espèces et ont discerné que les IAPs inhibent l’apoptose en bloquant les caspases (revue dans la réf. 18).

La famille des protéines inhibitrices de l’apoptose

À ce jour, huit membres de la famille IAP humaine ont été identifiés (Fig. 2)⇓, et des homologues IAP ont également été décrits chez les insectes et les levures. Les protéines IAP sont regroupées dans cette famille en fonction de la présence d’un à trois domaines répétés IAP (BIR) de baculovirus, une région de liaison au zinc de ∼70 acides aminés. Bien que le domaine BIR soit requis pour l’appartenance à la famille IAP, toutes les protéines contenant le BIR ne semblent pas avoir de fonctions antiapoptotiques (19, 20, 21, 22), de sorte que la présence d’un domaine BIR est nécessaire mais pas suffisante pour l’inclusion dans cette famille de protéines. Les protéines IAP peuvent également contenir un domaine RING ou un domaine CARD (Caspase Activation Recruitment) (voir réf. 18). Les protéines IAP ont été divisées en trois classes (classes 1, 2 et 3) selon la présence ou l’absence d’un doigt RING et l’homologie de leurs domaines BIR (23).

Classe 1 des protéines inhibitrices de l’apoptose.

Les IAP de classe 1 contiennent des domaines BIR homologues et un motif de doigt RING. La PAI liée à l’X possède trois domaines BIR et un doigt RING. Elle a été la première IAP de cette classe à être identifiée et reste la mieux caractérisée. Duckett et al. (24) ont identifié XIAP en 1996 lors d’une recherche de gènes de mammifères homologues à l’IAP du baculovirus. Il se lie et inhibe les caspases 3, 7 et 9 avec une affinité nanomolaire, mais il ne se lie pas et n’inhibe pas la caspase 8 (25, 26). cIAP1 (également connu sous le nom de MIHB, hiap2 et BIRC2) et cIAP2 (également connu sous le nom de MIHC, hiap2 et BIRC3) sont structurellement apparentés à XIAP avec trois domaines BIR et un doigt RING. Ces IAPs ont été identifiées par la purification biochimique de protéines associées au récepteur de mort TNF-R2, mais leur rôle au niveau de ce récepteur reste peu clair (27). cIAP1 et cIAP2 sont exprimées dans la plupart des tissus humains, mais l’expression de cIAP1 est la plus élevée dans le thymus, les testicules et les ovaires, et l’expression de cIAP2 est la plus élevée dans la rate et le thymus (27). cIAP1 et cIAP2 se lient et inhibent les caspases 3 et 7, bien que moins fortement que XIAP (25). Elles n’inhibent pas les caspases 1, 6 et 8. ML-IAP (également connue sous le nom de livine, KIAP, et BIRC7) et ILP-2 ont un doigt RING et un seul domaine BIR, mais leur domaine BIR est le plus homologue au domaine BIR3 de XIAP, cIAP1, et cIAP2 (d’où leur inclusion dans cette classe). La ML-IAP est exprimée dans le foie et le rein du fœtus normal, dans le testicule et le thymus de l’adulte ainsi que dans des lignées cellulaires de mélanome et de lymphome. ML-IAP inhibe les caspases 3 et 9 avec une affinité similaire à celle de cIAP1 mais ne se lie pas aux caspases 1, 2, 6 ou 8 et ne les inhibe pas (28). L’expression d’ILP-2 est normalement limitée au testicule adulte mais a également été documentée dans une lignée cellulaire lymphoblastoïde. L’ILP-2 inhibe la caspase 9, mais pas les caspases 3, 7 ou 8 (29). Il reste à déterminer si les variations d’affinité pour les caspases parmi les différentes IAPs sont liées à leurs fonctions intracellulaires endogènes.

Protéines inhibitrices de l’apoptose de classe 2.

Le membre de la famille des IAPs de classe 2, NAIP, possède trois domaines BIR mais aucun motif en doigt de RING. Ses domaines BIR sont plus éloignés des domaines BIR des IAP de classe 1. NAIP a été identifié en 1995 par Roy et al. (30), alors qu’ils recherchaient le gène sur 5q13 responsable des atrophies musculaires spinales de l’enfant. NAIP est exprimé dans le foie adulte, le placenta et le système nerveux central. Il inhibe les caspases 3 et 7, mais pas les caspases 1, 4, 5 ou 8 (31).

Protéines inhibitrices de l’apoptose de classe 3.

Les membres IAP de classe 3, comme la survivine, ne contiennent qu’un seul domaine BIR et aucun doigt RING. La survivine est exprimée dans le foie, le rein, le poumon et le tractus gastro-intestinal du fœtus, mais elle n’est pas exprimée dans la plupart des tissus adultes normaux (32). L’expression préférentielle de la survivine dans les tissus fœtaux suggère qu’elle joue un rôle dans le développement. La survivine est fréquemment surexprimée dans une variété de malignités, y compris les adénocarcinomes du poumon, du pancréas, du côlon, du sein et de la prostate (32, 33, 34, 35, 36).

L’expression différentielle entre les cellules normales et malignes peut être exploitée à des fins thérapeutiques. Par exemple, le promoteur survivin pourrait être utilisé comme un promoteur spécifique de la tumeur dans lequel un gène d’intérêt est activé dans les cellules malignes, mais pas dans les cellules normales. Ce ciblage transcriptionnel peut être utile dans la thérapie génique du cancer (37). Alternativement, l’expression de la survivine pourrait être utilisée comme un marqueur tumoral pour l’identification précoce de la malignité, comme discuté en détail ci-dessous.

Les protéines inhibitrices de l’apoptose inhibent les caspases actives

L’inhibition des caspases est le mécanisme le mieux compris par lequel les PAI empêchent l’apoptose. Dans les réactions enzymatiques, la XIAP recombinante inhibe les caspases 3, 7 et 9, mais pas la caspase 8. In vitro, la surexpression de XIAP dans les cellules 293T empêche le clivage de la procaspase 3 et l’apoptose induits par BAX et FAS (38). L’effet de XIAP sur l’activation des caspases a été cartographié à ses domaines BIR, le domaine BIR2 inhibant les caspases 3 et 7, et le domaine RING BIR3 inhibant la caspase 9.

Base structurelle de l’inhibition des caspases par la protéine X-Linked Inhibitor of Apoptosis.

Au vu des données cellulaires et enzymatiques indiquant que les IAPs inhibent les caspases, des efforts ont été entrepris pour explorer les interactions physiques entre les IAPs et les caspases. La plupart des études se sont concentrées sur XIAP car elle peut être produite sous forme recombinante et cristallisée. XIAP inhibe les caspases 3 et 7 et la caspase 9 par des domaines distincts. Son domaine BIR2 (acides aminés 163-240) avec son extension NH2-terminale (acides aminés 124-162) inhibe les caspases 3 et 7, tandis que son domaine BIR3 (acides aminés 241-356) inhibe la caspase 9 (39). Ces études ont servi de base au développement d’inhibiteurs de la XIAP qui ciblent les poches de liaison à la caspase de la molécule.

Le domaine BIR2 inhibe la protéine X-Linked Inhibitor of Apoptosis.

Un modèle  » hook, line, and sinker  » a été proposé pour expliquer comment la XIAP inhibe la caspase 3 (figure 3)⇓. Le « crochet » (résidus 138-146 de l’extrémité NH2) inhibe la caspase 3 en se situant en travers du site actif de la caspase, bloquant ainsi la poche de liaison au substrat de la caspase 3 active. La « ligne » représente deux liaisons peptidiques sur Val147 qui relient le crochet au plongeur. Le « sinker » (résidus 148-150) stabilise l’interaction entre XIAP et la caspase 3 (40). Dans ce modèle, XIAP inhibe la caspase 3 par encombrement stérique. En tant que tel, il inhibe les caspases 3 et 7 par un mécanisme distinct des inhibiteurs peptidiques de la caspase tels que la benzyloxycarbonyl-VAD-fluorométhyl cétone qui entre en compétition avec le substrat de la caspase pour la poche de liaison.

Le domaine BIR3 inhibe la protéine X-Linked Inhibitor of Apoptosis.

Des études anciennes ont déterminé que le domaine BIR3 de XIAP pouvait inhiber la caspase 9 (26, 41), mais ce n’est que récemment que le mécanisme a été élucidé. Le domaine BIR3 de XIAP forme un hétérodimère avec la caspase 9 monomérique, empêchant ainsi la dimérisation et l’activation de la caspase 9. En plus de piéger la caspase 9 sous une forme monomérique, il maintient également le site actif de la caspase 9 dans une conformation inactive (42). Ainsi, il est intéressant de noter que XIAP inhibe la caspase 9 sans toucher physiquement le site actif.

Dans une extension des études structurales, les effets des mutations des domaines BIR sur les effets antiapoptotiques de XIAP ont été examinés. Les mutations affectant l’extension NH2-terminale de BIR2 (par exemple, D148A) abolissent le rôle protecteur de XIAP dans la prévention de l’apoptose induite par le ligand Fas (un stimulus de la voie extrinsèque d’activation des caspases) ou par Bax (un stimulus de la voie intrinsèque d’activation des caspases). En revanche, les mutations affectant le domaine BIR3 (par exemple, W310A) réduisent l’inhibition de l’apoptose induite par BAX, mais pas par CD95, médiée par XIAP (43). Ainsi, ces mutations soutiennent les études structurales démontrant que le domaine BIR2 est requis pour l’inhibition de la caspase 3 et que le domaine BIR3 inhibe la caspase 9.

Survivin.

Alors que XIAP inhibe les caspases 3, 7 et 9 par des interactions directes, le mécanisme par lequel la survivine inhibe les caspases est moins clair. Selon certaines études (44, 45), la survivine se lie et inhibe les caspases actives 3 et 7, mais pas la caspase 8. En revanche, d’autres (46) ne détectent pas d’interaction de la survivine avec la caspase 3. Une étude de Marusawa et al. (47) rapporte que la survivine n’inhibe pas les caspases recombinantes 3, 7 ou 9 dans des réactions enzymatiques ou dans des extraits cytosoliques préalablement stimulés avec du cytochrome c et du dATP. Cependant, lorsque la survivine est ajoutée aux extraits cytosoliques avant l’activation de la caspase 9 par l’ajout de cytochrome c et de dATP, elle empêche l’activation de la caspase 3/7. Ainsi, ces résultats suggèrent que la survivine inhibe la caspase 9 active, mais pas les caspases 3 et 7 actives, et que l’inhibition de la caspase 9 nécessite un cofacteur. Pour identifier un tel cofacteur, Marusawa et al. (47) ont utilisé un crible à deux hybrides pour identifier les protéines se liant à la survivine et ont identifié HBXIP. Dans les réactions enzymatiques, la survivine et HBXIP en combinaison (mais aucune des deux protéines seules) ont inhibé l’activité de la caspase 9. Des études supplémentaires seront nécessaires pour résoudre ces études discordantes et déchiffrer le mécanisme par lequel la survivine inhibe les caspases. En outre, pour généraliser l’importance de HBXIP comme cofacteur nécessaire à la survivine, il faudra l’évaluer dans d’autres systèmes cellulaires. Un tel travail sera une étape importante vers le développement d’inhibiteurs chimiques de la survivine.

Beyond Caspase Inhibition

La plupart de l’attention s’est concentrée sur les PAI en tant qu’inhibiteurs de caspases, mais de multiples lignes de preuves indiquent que les PAI peuvent inhiber l’apoptose par des effets sur la progression du cycle cellulaire, la division cellulaire et la transduction du signal.

Les protéines inhibitrices de l’apoptose régulent la division cellulaire.

Les protéines IAP jouent probablement un rôle dans la division cellulaire. Par exemple, les levures sont dépourvues de caspases mais possèdent des homologues IAP qui contiennent un domaine BIR. La délétion de l’IAP de la levure entraîne une formation inefficace des spores, ce qui indique que, au moins chez la levure, l’IAP joue un rôle dans la méiose (20, 21, 22). Dans les cellules de mammifères, la survivine se colocalise avec l’appareil mitotique, notamment la tubuline B, les microtubules, les centrosomes et les kinétochores (48, 49, 50). L’inhibition de la survivine avec un anticorps anti-survivine entraîne un retard de la métaphase et produit des cellules mitotiques avec des fuseaux mitotiques plus courts et moins denses (48, 50).

Les protéines inhibitrices de l’apoptose régulent la progression du cycle cellulaire.

Des preuves impliquent également les IAP comme régulateurs du cycle cellulaire. Par exemple, la surexpression de XIAP arrête les cellules dans la phase G0-G1 du cycle cellulaire, et cet arrêt de croissance est associé à une régulation négative de la cycline A et D1 et à l’induction des inhibiteurs de la kinase cycline-dépendante p21 et p27 (51). En outre, XIAP se lie aux régulateurs du cycle cellulaire MAGE-D1 et NRAGE, mais la signification de cette interaction n’est pas claire (52). La survivine a également été impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. Dans les cellules HeLa, la survivine est pratiquement indétectable dans les cellules G1 et augmente de ∼5- et 40 fois dans les cellules en phase S et G2-M, respectivement (50). Les changements dans les niveaux d’ARNm de la survivine sont également corrélés à des augmentations de la protéine et de l’activité du promoteur de la survivine.

Les protéines inhibitrices de l’apoptose régulent la signalisation cellulaire.

La famille des protéines IAP joue également un rôle dans la signalisation cellulaire en activant le facteur nucléaire (NF)-κB. XIAP et NAIP, par exemple, forment un complexe avec la kinase TAK1 et son cofacteur, TAB1, qui conduit à l’activation de la c-Jun-NH2-terminal kinase 1 (53). La c-Jun-NH2-terminal kinase 1 activée active ensuite NF-κB par la cascade de phosphorylation de la protéine kinase activée par des agents mitogènes (54). De plus, XIAP favorise la translocation de la sous-unité p65 du NF-κB vers le noyau, ce qui est une condition préalable à l’activité du NF-κB (55). Enfin, XIAP favorise la dégradation de l’inhibiteur du NF-κB Iκβ (51).

Alors que le rôle des IAP dans la régulation de la division cellulaire, du cycle cellulaire et de la transduction du signal est clarifié, il sera important d’identifier les domaines des IAP responsables de ces activités. S’il devient possible d’identifier des domaines distincts des protéines qui inhibent les caspases, le cycle cellulaire et la transduction des signaux, on pourra alors fabriquer des IAP mutantes qui dissocient ces fonctions. Ce travail pourrait conduire au développement d’inhibiteurs d’IAP qui bloquent spécifiquement l’inhibition des caspases par les IAP alors que les IAP conservent leur rôle de régulateurs du cycle cellulaire et de la transduction du signal.

Régulation de la fonction de la protéine inhibitrice de l’apoptose par les protéines inhibitrices endogènes

Les membres de la famille IAP sont régulés au niveau du gène, du message et de la protéine, mais les détails de cette régulation dépassent le cadre de cette revue. Cette revue se concentrera plutôt sur la régulation des IAP par les protéines inhibitrices endogènes car elles servent de prototypes pour les inhibiteurs chimiques thérapeutiques des IAP.

Les protéines régulatrices de liaison IAP ont été identifiées pour la première fois chez la drosophile. Il a été démontré que les protéines Reaper, Hid, Grim (56) et Sickle (57) se lient et inhibent l’IAP de la drosophile, DIAP1. Plus tard, des versions humaines de Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) et Sickle (Skl) ont été identifiées et nommées SMAC/DIABLO et HTRA2. Ces inhibiteurs des PEI partagent une séquence homologue dans leur extrémité NH2 qui est responsable de la liaison et de l’inhibition des PEI (Fig. 4)⇓.

SMAC et HTRA2.

Les SMAC et HTRA2 humaines sont des protéines mitochondriales qui sont libérées avec le cytochrome c lors de la rupture des mitochondries. Lors de leur libération, elles sont clivées en une forme active. Dans leur état actif, SMAC et HTRA2 se lient aux IAP, empêchant ainsi leur association avec les caspases (58, 59, 60, 61). Les fonctions inhibitrices des IAP de la famille des protéines SMAC sont codées dans leur extrémité NH2. Les peptides correspondant aux sept acides aminés NH2-terminaux sont capables de lier XIAP (62). La mutation de l’alanine NH2-terminale en glycine abolit la capacité du peptide SMAC à se lier aux IAPs et à exercer sa fonction proapoptotique (63). Lorsqu’ils sont internalisés dans les cellules, les peptides correspondant aux sept acides aminés NH2-terminaux de SMAC sont capables de sensibiliser les cellules cancéreuses pulmonaires H460 au cisplatine et au Taxol (64) et les cellules de neuroblastome au ligand inducteur d’apoptose lié au facteur de nécrose tumorale. Des résultats similaires ont été observés avec HTRA2 et les inhibiteurs de l’IAP chez la drosophile. Les propriétés antitumorales des peptides SMAC ont été étendues aux xénogreffes, où des versions perméables aux cellules de ces peptides réduisent les tumeurs lorsqu’elles sont associées au cisplatine (64) ou à TRAIL (65) dans des xénogreffes de carcinome pulmonaire et de gliome, respectivement. Ainsi, ces peptides SMAC servent de prototypes pour de petites molécules qui imitent les actions de SMAC et inhibent les IAPs et seraient utiles sur le plan thérapeutique pour une variété de malignités.

Etudes structurales.

Vu l’utilité clinique potentielle des molécules SMAC-like, des efforts ont été faits pour comprendre les interactions physiques entre SMAC et IAPs. Des études structurales ont démontré que SMAC se lie à XIAP à deux sites distincts. L’extrémité NH2 du SMAC actif (résidus 56-59) se lie à la poche BIR3 de XIAP et empêche de manière compétitive le domaine BIR3 de se lier à la caspase 9. Les mutations du domaine BIR3 qui empêchent la liaison à la caspase 9 (par exemple, W310) empêchent également le domaine BIR3 de lier SMAC, ce qui suggère que les sites de liaison de SMAC et de la caspase 9 se chevauchent. Cependant, les sites de liaison ne sont pas identiques car certaines mutations de BIR3 (par exemple, H343A) abolissent la liaison de BIR3 à la caspase 9 mais pas à SMAC (63, 66).

La protéine complète de SMAC et les peptides NH2-terminaux lient également le domaine BIR2 de XIAP, mais avec une affinité ∼5- à 10 fois inférieure à celle de BIR3. Le mécanisme par lequel SMAC perturbe l’association de BIR2 de la caspase 3 n’est pas clair, mais il pourrait être lié davantage à un encombrement stérique qu’à une liaison compétitive (63).

HTRA2 se lie au domaine BIR3 de XIAP, mais avec une affinité plus faible que SMAC (67). Dans son état actif, HTRA2 existe sous forme de trimère, et les mutations qui empêchent la formation du trimère rendent HTRA2 inactif. En plus d’inhiber les IAP par la liaison à la poche BIR3, HTRA2 peut également cliver et inactiver plusieurs IAP, y compris XIAP, cIAP1 et cIAP2, mais pas la survivine (68).

SMAC β.

SMAC et HTRA2 peuvent également exercer leur activité proapoptotique par des effets indépendants de la liaison aux IAP. Une étude de Roberts et al. (69) a décrit une forme d’épissage alternatif naturel de SMAC, appelée SMAC β, qui n’avait pas la séquence ciblant les mitochondries. SMAC β n’a pas interagi avec XIAP, cIAP1 ou cIAP2, probablement en raison de la perte de son extrémité NH2. Bien qu’il soit incapable de se lier aux IAP, SMAC β a renforcé l’apoptose médiée par TRAIL et VP-16 dans les cellules 293. De même, les versions mutantes de HTRA2 (67) qui sont incapables de se lier aux protéines IAP sont toujours capables d’induire l’apoptose lorsqu’elles sont surexprimées dans les cellules de cancer du sein MCF7. Cette étude ne permet pas de comprendre comment ces formes d’épissage alternées peuvent encore induire l’apoptose. Peut-être conservent-elles leur capacité à ubiquitiner les IAP, favorisant ainsi leur destruction. Alternativement, SMAC et HTRA2 peuvent avoir des partenaires de liaison supplémentaires non liés aux IAPs par lesquels ils exercent une influence proapoptotique. Dans le cas de HTRA2, il a une activité protéase indépendante de son rôle dans la liaison des IAPs, et cette activité protéase peut réguler l’apoptose dans certains systèmes (68).

XAF1.

XAF1 est un autre inhibiteur des IAPs. XAF1 est une protéine nucléaire qui se lie et séquestre XIAP dans le noyau. Dans les réactions biochimiques, XAF1 se lie et inhibe XIAP. Dans les cellules, la surexpression de XAF1 bloque l’inhibition de l’apoptose médiée par XIAP. Il n’est cependant pas clair si la séquestration de XIAP dans le noyau sépare simplement XIAP des caspases cytosoliques ou s’il existe des effets supplémentaires de XIAP situé dans le noyau (70). Les molécules qui miment XAF1 fonctionneraient probablement différemment de SMAC et constitueraient une stratégie alternative au développement d’un inhibiteur de XIAP.