Isolation, caractérisation et potentiel toxicologique des mycotoxines d’Alternaria (TeA, AOH et AME) dans différentes espèces d’Alternaria de diverses régions de l’Inde

Collection et isolement des espèces d’Alternaria

Les parties infectées telles que les feuilles, les fruits et les tiges des plantes malades de différentes régions de l’Inde, ont été collectées et apportées au laboratoire. Les échantillons de feuilles ont été stérilisés en surface avec une solution d’hypochlorite de sodium à 0,5%, lavés soigneusement avec de l’eau distillée stérile (SDW) à plusieurs reprises et ont été placés sur un milieu de culture dextrose de pomme de terre (PDA) dans des boîtes de Pétri pendant 3-4 jours. Les plaques PDA contenant les morceaux de feuilles infectées ont été incubées à 28 °C avec une photopériode de 12 h lumière/obscurité pendant 6-10 jours57. Pour éviter toute contamination bactérienne, de la streptomycine a été ajoutée au milieu. Les conidies ont été produites en monosporulation pour obtenir des colonies pures, qui ont été placées sur du papier filtre stérilisé.

Test de pathogénicité

Pour déterminer les formae spéciales, une analyse de virulence des isolats a été effectuée sur des cultivars de tomates sensibles à Alternaria. Un total de 60 isolats d’Alternaria ont été testés pour leur pathogénicité. Les graines de tomates ont été scarifiées dans de l’hypochlorite de sodium, rincées dans de l’eau du robinet, puis séchées à l’air libre. Les plantes ont été cultivées séparément dans des pots. Les conditions physiologiques telles que la température et l’humidité pour la croissance des plantes ont été maintenues à 28 °C à 32 °C et 40 à 60 % d’humidité relative, respectivement. La concentration optimale des inoculums a été maintenue (2 × 106 spores/ml) et pulvérisée sur la surface des feuilles. Les plantes expérimentées ont été maintenues dans des chambres de rosée pendant 8 h à 25 °C. Ces plantes ont été régulièrement surveillées pendant 2-3 jours pour la sévérité de l’infection et le développement de la maladie par rapport à la feuille témoin qui n’a pas été inoculée. Les symptômes ont commencé à être visibles 1 jour après la pulvérisation des inoculations de spores. La sévérité de la maladie a été évaluée à partir du premier jour de l’inoculation jusqu’à 6 jours. Les données ont été analysées statistiquement en utilisant l’analyse de variance (ANOVA) et le test de Duncan (P ≤ 0,05).

Extraction d’ADN et identification de l’agent pathogène

L’agent pathogène a été initialement identifié sur la base des caractéristiques morphologiques, y compris la taille et la forme, et la structure des conidies, puis confirmée par amplification ITS à l’aide d’amorces universelles ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) et ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) amplifiant les régions ITS et les gènes 5.8S codant pour les espèces fongiques. L’extraction de l’ADN a été effectuée selon la méthode suggérée par Doyle et Doyle58. Un tapis mycellaire lyophilisé de 0,5 g a été broyé dans un mortier et un pilon avec 10 ml de tampon d’extraction CTAB, puis incubé à 65 °C au bain-marie pendant 30 min. L’échantillon a ensuite été mélangé à un volume égal de chloroforme/alcool isoamylique refroidi et mélangé doucement, puis centrifugé à 10 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant ainsi obtenu a été mélangé à un volume égal d’isopropanol et laissé pendant 2 heures à 4 °C. L’échantillon a été de nouveau centrifugé à 10000 rpm pendant 10 min à 4 °C. Le culot a ensuite été rincé avec de l’éthanol à 70% et séché à l’air pendant 4 h afin d’éliminer les traces d’alcool. La réaction d’amplification ITS rDNA a été réalisée dans 25 μl de mélange réactionnel contenant 2,5 μl de tampon de réaction 10X, 5 μl de chaque désoxyribonucléotide triphosphate (dNTP), et 1,0 μl de chaque amorce avant universelle ITS et région 5,8 S (ITS1) et amorce inverse (ITS4), 0,3 μl d’ADN-polymérase Taq, 10-100 ng d’ADN, et 2,5 μl de MgCl2. Le profil thermique optimisé de la PCR était la dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, la dénaturation à 95 °C pendant 30 sec, l’annelage à 70 °C pendant 30 sec et l’extension finale à 72 °C pendant 1 min avec 40 cycles supplémentaires. L’amplification a été confirmée sur des gels d’agarose à 1% dans un tampon TBE 0,5X, exécutés parallèlement au marqueur de poids moléculaire standard de l’ADN et visualisés sous un transilluminateur UV.

Analyse de la séquence ITS

Les régions ITS rDNA obtenues des isolats sélectionnés ont été encore coupées et purifiées en utilisant le kit de purification QIAquick PCR (QIAGEN, Allemagne), selon les instructions du fabricant. Les produits purifiés ont finalement été envoyés à SciGenome Cochin, Kerala, Inde pour le séquençage. Les séquences ont été comparées à celles de la GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) en utilisant NCBI BLAST. L’analyse BLAST a été effectuée avec des séquences ITS complètes comme requêtes pour révéler les relations avec les séquences publiées. L’homologie la plus élevée et le score total ont été notés pour une analyse plus approfondie. Les séquences obtenues dans la présente étude ont été soumises à GenBank. Les séquences ITS des souches d’Alternaria d’autres formae speciale ont été téléchargées de la base de données GenBank du NCBI et ont été utilisées dans les analyses phylogénétiques comme séquences de référence. Toutes les séquences d’ADN ont été alignées avec le programme Clustal W inclus dans l’éditeur d’alignement de séquences BioEdit59, 60. Le fichier d’alignement multiple résultant a été utilisé pour les analyses phylogénétiques qui ont été effectuées en utilisant MEGA 5.0 avec la méthode Neighbor-Joining permettant 500 répliques bootstrap61.

Extraction des toxines des espèces Alternaria

Les extractions des métabolites toxiques ont été effectuées selon la méthode d’Andersen et al.62 avec quelques modifications. Les extractions de ces phytotoxines ont été réalisées sur milieu Potato Dextrose Broth (PDB) en utilisant des cultures âgées de 20 jours. Trois bouchons de gélose (3 mm) ont été coupés au centre de chaque colonie d’Alternaria et inoculés dans 200 ml de milieu PDB. Les colonies de l’agent pathogène ont été coupées à l’aide d’un foret à bouchon (5 mm), puis les colonies ont été inoculées dans le milieu PDB. Les cultures de 20 jours ont été filtrées à travers un papier filtre par la machine à filtre sous vide. On a ajouté un volume égal de méthanol aux filtrats de culture, on a mélangé correctement et on a maintenu à 4 °C pendant 24 h. Ensuite, le filtrat a été précipité et le méthanol a été évaporé jusqu’à siccité dans un concentrateur rotatif sous vide (IKA® RV 10) à 43 °C. Un volume égal d’acétate d’éthyle a été ajouté au filtrat extrait, mélangé correctement dans une ampoule à décanter. Deux phases ont été obtenues, l’une étant la phase organique et l’autre la phase aqueuse. La couche aqueuse a été séparée et extraite avec de l’acétate d’éthyle. L’extrait d’acétate d’éthyle a été concentré à 44 °C dans un évaporateur sous vide et dissous dans du méthanol.

Purification et séparation de la phytotoxine d’Alternaria par chromatographie sur colonne

La purification et la séparation des composés ont été effectuées en utilisant la méthodologie de Devi et al.63 avec de légères modifications. La chromatographie sur colonne (CC) a été entreprise dans une colonne en verre (700 mm × 30 mm) et le gel de silice (100-120 mesh Merk) a été choisi comme phase stationnaire. La phase mobile était constituée d’un solvant pur ou de différents solvants en fonction des conditions requises. La colonne a été chargée avec un complexe brut extrait d’isolats de l’espèce Alternaria. Pour la séparation des métabolites toxiques, une phase mobile composée de chloroforme : méthanol (80:20 et 95:05), benzène : acétone : acide acétique (60:35:05) a été utilisée pour séparer les composés et une élution en gradient a été suivie. Différentes fractions éluées de la CC ont été séparées par chromatographie en couche mince (CCM) et confirmées par l’analyse HPLC.

Analyse par chromatographie en couche mince (CCM) des phytotoxines

La chromatographie en couche mince (CCM) a été utilisée pour identifier les différentes phytotoxines produites par les grandes ainsi que les petites spores des espèces d’Alternaria identifiées. La CCM a été réalisée en utilisant la méthode d’Andersen et al.64. Dans cette méthode, 4,5 g de gel de silice G254 (13% CaSO4 ½ H2O comme liant) ont été ajoutés à 25 ml d’eau bidistillée et agités par une tige de verre jusqu’à ce qu’une suspension de gel de silice soit formée. Après quoi, la suspension a été appliquée sur une plaque de verre avec précaution et placée dans un endroit sûr pour le séchage à l’air. Différentes phases mobiles ont été utilisées pour la séparation de diverses phytotoxines dans les proportions suivantes : chloroforme : méthanol (80:20 ; v/v), benzène : acétone : acide acétique (60:35:5 ; v/v), chloroforme : méthanol (95:5 ; v/v), acétate d’éthyle : benzène (95:5 ; v/v). Ces mélanges de solvants ont ensuite été placés dans des dessiccateurs et ont été laissés pendant 30 min pour saturer le milieu à l’intérieur. Avant de réaliser la CCM, les plaques de verre recouvertes de gel de silice ont été chargées en les plaçant dans un four à 60 °C pendant 10 minutes. Après le chargement, 5 µl d’échantillons ont été déposés en différents points à 2 cm de la base. Après avoir déposé les échantillons, les plaques CCM ont été séchées dans un dessiccateur pendant quelques minutes. Les taches résultantes ont été développées en exposant les plaques CCM à du chlorure ferrique éthanolique à 0,2% et/ou en les visualisant sous une lumière UV à 365 nm. Les plaques CCM ont ensuite été séchées à l’air pendant une nuit, après quoi les valeurs Rf ont été calculées. Les taches de différents métabolites dont les valeurs Rf ont été trouvées similaires aux valeurs Rf des standards ont été grattées, dissoutes dans du méthanol de qualité HPLC et utilisées pour l’analyse HPLC.

Analyse HPLC-UV

Préparation du standard

TeA (cat No : T1952), AOH (cat No : A4675) et AME (cat No : A4678) ont été achetés chez Biogenuix (LKT laboratories, Inc, New Delhi, Inde) et utilisés sous forme cristallisée pour préparer l’étalon. La solution mère (1000 µg ml-1) et une solution de travail séparée de (10 µg ml-1) de toxines ont été préparées dans du méthanol de qualité HPLC et conservées à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Ces toxines ont été utilisées comme standards pour la calibration HPLC et pour d’autres expériences supplémentaires en diluant les solutions de travail préparées.

Conditions d’analyse HPLC-UV

Pour l’analyse HPLC, les échantillons ont été séparés par chromatographie en utilisant une base désactivée (250 mm de long × 4.6 mm, taille de particule de 5,0 µm) C18 Waters Spherisorb, colonne ODS2 (produit n° : PSS831915, USA) qui a été connectée à la colonne de garde, au système série Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) ayant un détecteur UV-VIS (2998 PDA) et un contrôleur de système Waters 600E. Le détecteur 2998 PDA est réglé à 254 nm comme longueur d’onde d’intégration. Les échantillons ont été injectés à l’aide d’une boucle de 10 μl de l’échantillonneur automatique Waters 717plus (Waters Corporation, Milford, USA). La colonne et la colonne de garde étaient contrôlées thermostatiquement à 28 °C. Le débit était de 0,70 ml/min et la phase mobile était constituée de 75 % de méthanol de qualité HPLC (solvant A), 25 % d’une solution aqueuse (solvant B) de tampon phosphate 0,1 M ajouté 900 ml DW pour 1 litre et de pH 5,8 maintenu par de l’acide phosphorique. L’instrument a été utilisé en mode isocratique linéaire et la détection a été contrôlée dans la plage de 200 à 400 nm. La fiabilité de la méthode HPLC pour l’analyse de l’AME, du TeA et de l’AOH a été validée par la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ).

Analyse LC-MS/MS

Pour confirmer davantage les toxines d’Alternaria (AME, AOH et TeA), une méthode de chromatographie – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) a été réalisée avec de légères modifications de Tölgyesi et al.65. La méthode implique une extraction solide-liquide avec du méthanol et une dérivation ultérieure pour la TeA, AOH et AME. Ensuite, les échantillons ont été purifiés par extraction en phase solide sur des cartouches à base de polymères, et enfin, les toxines ont été séparées par LC-MS/MS. Pour l’analyse par LC-MS/MS, les échantillons ont été préparés par étapes.

Réactifs, solvants et préparation de l’étalon

Les calibrants analytiques séchés de l’AME, de l’AOH et du TeA ont été achetés auprès de Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Inde). Les étalons ont été reconstitués avec 1,0 ml de méthanol pour obtenir des solutions mères de 0,1 mg ml-1. Toutes les solutions mères ont été conservées à 4 °C. La 2,4-dinitrophénylhydrazine (DNPH) et l’undécanal ont été achetés à Sigma-Aldrich. Le réactif de dérivatisation (DNPH à 0,58% dans une solution de HCl) a été préparé comme décrit par Siegel et al.7. Le réactif d’arrêt était de l’undécanal à 5% (v/v) dans du méthanol. Les solutions standard dérivées de TeA, AOH et AME (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml et 2,71 μg/ml de méthanol, respectivement) ont été préparées en mélangeant 1 ml des solutions méthanoliques de TeA, AOH et AME à 10 μg/ml avec 1 ml de solution de DNPH. Le mélange a été laissé pendant la nuit et traité comme indiqué dans les sections d’extraction des échantillons et de nettoyage de la SPE. Le volume final a été ajusté à 10 ml avec du méthanol. Ces solutions ont été utilisées pour optimiser les conditions LC-MS/MS pour l’analyse. Un tampon de formiate d’ammonium 50 mM a été préparé dans de l’eau et son pH a été ajusté à 3,0 avec de l’acide formique. Le méthanol et l’acétonitrile étaient de qualité LC-MS obtenus auprès de Sigma-Aldrich. L’acétate d’éthyle, le n-hexane, le dichlorométhane, l’acide formique et le formiate d’ammonium étaient de qualité CLHP et ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne). La colonne Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), les cartouches SPE Strata (6 ml, 200 mg) et les filtres à seringue en cellulose régénérée (RC) (15 mm, 0,45 μm) ont été obtenus auprès de Phenomenex (Utrecht, Pays-Bas). Les colonnes HPLC Supelco Ascentis Express C-18, cyano (ES-CN) et phényl-hexyle (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) ont été achetées chez Sigma- Aldrich. Les échantillons de toxines standards, utilisés pour le développement de la méthode, ont été achetés auprès de Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Inde). Les échantillons ont été conservés à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient soumis à l’analyse.

Extraction des échantillons

Les échantillons d’extraction des métabolites bruts ont été purifiés par une méthode de chromatographie sur colonne et la fraction a été éluée et dissoute dans du méthanol. 50 ml d’échantillon de chaque fraction ont été mélangés dans des tubes à centrifuger de 50 ml en polypropylène (PP) qui ont ensuite été scellés. Les échantillons ont été mélangés par vortex pendant 5 secondes et secoués horizontalement sur un agitateur CAT S50 à une vitesse de 600 min-1 pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, les tubes ont été centrifugés à 5 000 rpm pendant 10 min à 20 °C et la couche supérieure a été recueillie dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml en PP. 100 μl de réactif de dérivatisation (0,596 % de DNPH dans 2 mol/lit HCl) ont été ajoutés à l’échantillon et mélangés au vortex pendant 5 sec. L’échantillon a été laissé à la dérivatisation pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, 500 μl de réactif d’arrêt 5% (v/v) d’undécanal dans du méthanol ont été ajoutés et mélangés au vortex pendant 5 sec. L’échantillon a été laissé au repos pendant 30 min, puis dilué dans le tube PP jusqu’à 35 ml avec un tampon de formiate d’ammonium 50 mM (pH 4, ajusté avec de l’acide formique). L’échantillon est centrifugé à 5 000 rpm pendant 10 min à 20 °C et soumis à un nettoyage par extraction en phase solide.

Nettoyage par extraction en phase solide (SPE)

Les cartouches Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) ont été conditionnées avec 6 ml de méthanol suivis de 6 ml d’eau et de 6 ml de tampon formate 50 mM. Des réservoirs de 75 ml ont été connectés sur les cartouches et les échantillons ont été chargés dans les réservoirs. Ensuite, les échantillons sont passés au goutte à goutte. Ensuite, les colonnes SPE sont lavées avec 6 ml de méthanol-eau (15/85, v/v) et ensuite avec 6 ml de n-hexane. Les cartouches ont été séchées sous vide pendant 5 minutes avant d’éluer les échantillons dans des tubes en verre avec 5 ml de méthanol. Les échantillons ont été évaporés jusqu’à siccité à 45 °C sous un léger courant d’azote et ils ont été redissous dans 250 μl de méthanol en les mélangeant au vortex pendant 20 sec. Comme étape finale, les échantillons ont été filtrés à travers des filtres de cellulose régénérée dans des flacons HPLC.

Instrumentation et équipement

Le développement de la méthode a été effectué à l’aide d’un Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm (système Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, détecteur Waters acuity PDA, Waters Corporation, Milford, MA, USA) couplé à un détecteur MS triple quadripôle MassLynx (Waters, Milford, MA, USA). L’acquisition et l’évaluation des données ont été effectuées avec MassLynx version 4.0. La méthode finale a également été transférée dans un système LC-MS/MS Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) comprenant une pompe binaire Waters acquity QSM (SN- L10QSM943A), un passeur automatique Waters acquity fin (SN-M10SDI443M), un thermostat de colonne et un détecteur MS triple quadripôle TQD Quantum Ultra. La température cible de la colonne et la température cible de l’échantillon étaient de 30 °C et 10 °C, respectivement. L’acquisition et l’évaluation des données ont été effectuées à l’aide du logiciel Xcalibur 2.0.7. SP1. Les deux systèmes étaient équipés d’une interface électrospray (ESI) dans laquelle seule l’ionisation négative était utilisée pendant l’acquisition. L’azote a été utilisé comme gaz de séchage et de collision. Les paramètres de la source d’ions sont résumés dans le tableau supplémentaire S2. De plus, la transférabilité de la méthode a été étudiée avec un système LC-MS/MS qui consistait en une HPLC Agilent 1100 couplée à un MS triple quadripôle AB Sciex 4000 (Framingham, MA, USA).

Conditions de l’instrument

Les toxines d’Alternaria sont séparées sur une colonne UPLC Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) équipée d’une pré-colonne C-18 de 2,1 mm en utilisant une élution à gradient linéaire. Quatre solvants (solvants A, B, C et D) ont été mélangés par la pompe binaire. Le solvant A contenait : acétonitrile (ACN) + eau (5:95), le solvant B contenait : ACN : 5 % d’alcool isopropylique (IPA), le solvant C contenait : 100 % de méthanol et le solvant D contenait : acétate d’ammonium pur. Le débit était de 0,5 ml/min. La phase mobile des solvants au temps initial était de 0,0 % A, 30 % B, 30 % C et 40 % D. Au temps final (5 min), les solvants étaient de 0,0 % A, 30 % B, 30 % C et 40 % D. Une étape de lavage suffisante dans le programme de gradient était nécessaire pour éliminer les solutés lipophiles accumulés dans la matrice. La durée totale de l’analyse était de 5 minutes. Le thermostat de la colonne a maintenu la température à 30 °C, le volume d’injection étant de 1,0 μl. Le passeur automatique a fonctionné à 20 °C.

Le système UPLC LG 500 nm a été couplé à un détecteur MS/MS (Micromass Quattro Ultima PT) via une interface électrospray (ESI) qui fonctionne en mode négatif. Les réglages ESI optimisés étaient les suivants : température de la source 120 °C, température de désolvatation 350 °C, débit de gaz de séchage 650 L/Hr, débit de gaz de cône 30 L/Hr et tension capillaire 3,50 kV. L’azote est utilisé comme gaz de séchage et de collision (2,67 × 10-6 bar). Le mode MRM (Multiply monitoring reaction) a été appliqué dans le MS pendant la détection et deux transitions ioniques ont été balayées pour chaque toxine cible. Le mode MRM a été appliqué dans le détecteur MS/MS et deux transitions ioniques (quantificateur et qualificateur) ont été enregistrées pour chaque composé cible. Les transitions ioniques sélectionnées avec les tensions optimisées (lentille conique ou tube), les énergies de collision (CE) et les temps de séjour sont résumés dans le tableau (tableau supplémentaire S2).

Évaluation du potentiel toxicologique de différentes mycotoxines d’Alternaria (TeA, AOH et AME)

La mesure de l’étendue de la mort cellulaire telle qu’induite par différentes mycotoxines a été déterminée par la méthode d’inoculation de feuilles détachées. Pour cela, des échantillons de feuilles fraîches ont été détachés des plantes cultivées en serre et correctement lavés pendant 3-4 minutes dans l’eau courante du robinet, stérilisés dans de l’hypochlorite de sodium à 1,0 % (0,01 g/ml) pendant environ 1 minute, puis essuyés en surface avec de l’éthanol à 70 %, et enfin rincés de manière aseptique avec de l’eau distillée stérile. Enfin, les feuilles ont été placées sur du papier filtre humidifié et ponctionnées par une aiguille stérile sur la surface inférieure. Les toxines ont été dissoutes dans de l’eau déionisée stérile à une concentration de 100 μg/ml. Des gouttelettes (100 µl) de chacune des trois toxines ont été injectées dans les feuilles blessées avec une aiguille fine (Dispovan, 1 ml). Un échantillon témoin a été ajusté en injectant de l’eau distillée stérile. Les échantillons de feuilles traitées ont été maintenus à l’intérieur d’une chambre humide (température de 27 ± 0,5 °C et humidité relative de 60 %) dans des conditions de serre (cycle de 14 h de lumière et 10 h d’obscurité à 27 °C). Une observation régulière (toutes les 24 h pendant 6 jours) a été effectuée afin de détecter tout changement lié aux effets toxicologiques développés dans les échantillons injectés par rapport aux échantillons témoins. Le montage expérimental a été maintenu en trois répétitions et le pourcentage de surface foliaire affectée par la mort cellulaire induite par la toxicité a été mesuré par (Systronic leaf area meter 211) et calculé par la formule suivante.

Détermination de la mort cellulaire par le test d’absorption du bleu Evans

La perte de viabilité cellulaire (mort cellulaire) a été évaluée par la méthode de coloration au bleu Evans (Baker et Mock, 1994). Les feuilles de tomates ont été traitées avec la même concentration (250 μg/ml) des trois toxines. Les feuilles traitées ont été colorées avec une solution aqueuse de bleu Evans à 0,25 % (v/v) pendant 15 min. Après un lavage à l’eau distillée pendant 30 min, les feuilles ont été excisées et trempées dans 500 µl de N, N-diméthylformamide pendant 1 h à température ambiante. La densité optique du bleu Evans libéré a été mesurée par spectrophotométrie à 600 nm.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le logiciel IBM SPSS Statistics ver. 20 via l’analyse de la variance (ANOVA à sens unique) suivie du test des plages multiples de Duncan au niveau de signification P ≤ 0,05. Les données ont été exprimées en tant que moyenne ± écart-type (ET) d’au moins trois réplicats de chaque métabolite. Les analyses de données statistiques ont été analysées dans 48 isolats sélectionnés d’espèces d’Alternaria qui étaient de nature pathogène.