L’apocynine, un traitement oral à faible poids moléculaire pour les maladies neurodégénératives

Abstract

Des preuves accumulées suggèrent que les médiateurs inflammatoires sécrétés par les cellules immunitaires innées résidentes ou infiltrées activées ont un impact significatif sur la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Cela pourrait impliquer que les patients affectés par une maladie neurodégénérative puissent bénéficier d’un traitement par des inhibiteurs sélectifs de l’activité immunitaire innée. Nous examinons ici le potentiel thérapeutique de l’apocynine, un composé phénolique essentiellement non toxique isolé de la plante médicinale Jatropha multifida. L’apocynine est un inhibiteur sélectif de la NADPH oxydase Nox2 des phagocytes qui peut être appliqué par voie orale et est remarquablement efficace à faible dose.

1. Introduction

Les sociétés vieillissantes sont confrontées à une prévalence croissante des maladies neurodégénératives. Quelques exemples relativement prévalents sont les maladies d’Alzheimer et de Parkinson et moins prévalents sont la maladie de Huntington et la maladie de Lou Gehrig (sclérose latérale amyotrophique ; SLA). Toutes les maladies neurodégénératives ont en commun qu’il n’existe aucun traitement efficace permettant d’arrêter la détérioration progressive des fonctions neurologiques. Il est à noter qu’aucun des agents neuroprotecteurs testés en clinique n’a une efficacité qui va au-delà du contrôle des symptômes.

Ces dernières années, on a de plus en plus compris que les réactions inflammatoires des cellules immunitaires innées résidentes ou infiltrées pouvaient avoir un impact significatif sur la pathogenèse des troubles neurodégénératifs . Un acteur central reconnu est la microglie, une cellule gliale qui appartient à la lignée myéloïde et qui est souvent désignée comme le macrophage du SNC. Cette nouvelle idée intrigante pourrait impliquer que des médicaments dont l’efficacité a été prouvée dans la protection des organes périphériques contre la fonction cytotoxique des cellules immunitaires innées, telles que les phagocytes mononucléaires ou polymorphonucléaires (respectivement, MNC et PMN), pourraient également être utiles pour le traitement de la composante neuroinflammatoire des maladies neurodégénératives. Un obstacle majeur que les médicaments doivent franchir est de traverser la barrière hémato-encéphalique et de pénétrer dans le parenchyme du SNC où se déroule le processus neurodégénératif. Dans cette revue, nous discuterons des études précliniques mettant en évidence le potentiel de l’apocynine, un petit antioxydant phénolique, comme traitement des maladies neurodégénératives.

2. L’apocynine, un phénol végétal pharmacologiquement actif

L’apocynine (4′-hydroxy-3′-méthoxyacétophénone ou acétovanillone) a été identifiée comme la substance biologiquement active dans les racines de Picrorhiza kurroa Royle ex Benth, une plante pérenne poussant dans l’Himalaya alpin. Les extraits des racines sont utilisés dans la tradition médicale ayurvédique de l’Inde et du Sri Lanka pour la préparation de médicaments ethniques pour le traitement des affections du foie, du cœur, des articulations et des poumons. Nous avons préparé un extrait de racine éthanolique à 95 % dans des conditions contrôlées en laboratoire et avons soumis la préparation à une purification guidée par l’activité en utilisant l’éclatement oxydatif des granulocytes polymorphonucléaires/neutrophiles (PMN) humains comme test expérimental de l’inflammation aiguë.

Le test de lecture que nous avons utilisé était basé sur la génération de chimioluminescence renforcée par le luminol par les PMN humains stimulés avec du zymosan opsonisé dans du sérum humain. L’essence de ce test est que les particules de levure opsonisées dans le sérum stimulent les PMN par l’intermédiaire de récepteurs d’immunoglobulines ou de facteurs de complément exposés à la surface. Les signaux d’activation relayés par ces récepteurs entraînent la vidange des granules cytoplasmiques (dégranulation) et l’assemblage de la NADPH oxydase Nox2 du phagocyte. Le complexe enzymatique Nox2 est assemblé à partir de sous-unités membranaires (, ) et cytoplasmiques (, , , et Rac2). Le processus d’assemblage implique la phosphorylation des sous-unités par des kinases spécifiques et la formation de ponts thiol. Le complexe assemblé capte les électrons du NADPH et les transfère à l’oxygène moléculaire libre, ce qui entraîne la formation de l’anion superoxyde (réduction d’un électron) et du peroxyde d’hydrogène (H2O2 ; réduction de deux électrons). Ces deux oxydants ont une activité cytotoxique, comme on a pu le montrer en utilisant des globules rouges de différentes espèces. L’explosion oxydative des PMN comprend une cascade d’espèces oxygénées fortement réactives, collectivement désignées par ROS (Figure 1). Par réaction avec l’oxyde nitrique, le peroxynitrite fortement cytotoxique est formé. En présence d’ions Fe2+, H2O2 est converti en radicaux hydroxyle (OH-) hautement réactifs qui, par la peroxydation des lipides membranaires, affectent la fluidité des membranes cellulaires. La myéloperoxydase libérée par la dégranulation des PMN catalyse la réaction de H2O2 avec des molécules d’halogénure (Cl2, Br2 et J2) pour former des hypohalogénures hautement toxiques (OCl-, OBr- et OJ-). Les ROS sont des composants essentiels de la destruction intracellulaire des microbes phagocytés, mais lorsqu’ils sont libérés dans le milieu extracellulaire, ils sont des médiateurs importants de l’activité destructrice des tissus des PMNs activés .

Figure 1

Espèces réactives de l’oxygène produites dans le burst oxydatif des phagocytes. MPO : myéloperoxydase ; NOS : oxyde nitrique (NO) synthase.

On peut envisager que les composants des extraits végétaux chimiquement complexes peuvent interférer avec le test de lecture à plusieurs niveaux et peuvent également exercer des effets non spécifiques tels que la mort des PMN ou le piégeage des oxyradicalaires. Cela implique que la purification guidée par l’activité doit être bien ciblée et soigneusement contrôlée pour éviter les effets non spécifiques et les résultats faussement positifs. En dépit de ces obstacles, nous avons pu démontrer une activité hautement spécifique de l’apocynine dans le test. L’apocynine s’est avérée être métaboliquement activée dans une réaction catalysée par la MPO avec H2O2, formant un dimère symétrique, la diapocynine (Figure 2). L’observation que l’intermédiaire réactionnel pouvait être piégé avec le GSH nous a conduit à émettre l’hypothèse que l’apocynine métaboliquement activée pourrait bloquer la formation de ponts thiol entre les composants membranaires et cytosoliques qui assemblent la Nox2 fonctionnelle. Il a toutefois été découvert par la suite que la diapocynine inhibe directement la production de superoxyde par Nox2 et que cette activité est indépendante de la MPO . Une découverte importante concernant l’apocynine est qu’elle inhibe l’explosion oxydative des PMN, sans empêcher la destruction intracellulaire des bactéries. Cela implique que le traitement avec l’apocynine peut prévenir les dommages collatéraux aux tissus infiltrés par les PMN activés sans entraver leur fonction bactéricide.

Figure 2

Inhibition de la microglie Nox2 par l’apocynine métaboliquement activée. L’activation médiée par les récepteurs des cellules de la microglie induit la production d’espèces réactives de l’oxygène et la libération de la myéloperoxydase (MPO). La réaction de l’apocynine avec H2O2, catalysée par la MPO, conduit à la production d’un intermédiaire réactif qui se stabilise en se liant à des groupes thiol libres, par exemple le GSH, ou par dimérisation. L’apocynine dimérique (diapocynine) inhibe l’activité de Nox2.

3. Efficacité de l’apocynine dans les modèles animaux AIMID

La maladie cible initiale dans laquelle nous avons testé l’effet clinique de l’apocynine était le modèle de rat WAG/Rij (RT-) de l’arthrite induite par le collagène (CIA), qui est un modèle préclinique accepté de la maladie inflammatoire auto-immune (AIMID) arthrite rhumatoïde (RA). Dans ce modèle, les PMN jouent un rôle pathogène évident, reflétant la situation des patients atteints de PR. Dans l’étude sur les rats, nous avons choisi d’administrer l’apocynine à une dose comprise entre 0,3 et 200 μg/mL d’eau potable, qui était fournie ad libitum. Il a été observé que déjà à la plus faible dose de 0,3 μg/mL, correspondant à une dose orale quotidienne de 6 μg, l’arthrite était presque complètement supprimée . Aucun effet de l’apocynine sur les taux sériques d’autoanticorps anti-collagène ou d’IL-6, une cytokine pathogène importante dans la CIA et la RA, n’a été observé, ce qui suggère une grande sélectivité pour la composante inflammatoire de la maladie. Indépendamment de nous, Hougee et al. ont démontré dans un modèle de CIA chez la souris que l’apocynine administrée par voie orale restaure la production bloquée de protéoglycane de cartilage dans l’articulation arthritique. Un effet secondaire intriguant du traitement, illustrant le puissant effet anti-inflammatoire de l’apocynine, a été la suppression spectaculaire des lésions cutanées nécrosantes aux sites où la formulation antigène immunisant/CFA a été injectée .

Depuis son identification initiale en tant qu’agent anti-inflammatoire puissant en 1990, l’apocynine est devenue un inhibiteur établi du burst oxydatif dans les neutrophiles, comme cela a été démontré dans un large éventail de modèles in vivo de troubles inflammatoires à médiation immunitaire affectant les organes périphériques et centraux. Les effets cliniques prometteurs observés dans des modèles de maladies neurodégénératives, notamment la SLA, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson, sont particulièrement importants pour cette revue. Dans ces modèles, l’activité antioxydante de l’apocynine n’est pas ciblée sur le neutrophile mais sur le « macrophage du cerveau », c’est-à-dire la microglie.

4. Microglie

Le cerveau contient différents types de cellules ayant la capacité d’exercer des fonctions immunitaires, notamment les astrocytes, les cellules de la microglie et les macrophages situés dans les méninges et les espaces périvasculaires des artères et des capillaires cérébraux . Pour leurs tâches immunitaires, ces cellules sont équipées de récepteurs conservés pour les motifs moléculaires associés aux agents pathogènes ou aux dommages, qui relaient des signaux d’activation aux cellules pour induire des mécanismes effecteurs inflammatoires.

La microglie est une cellule immunitaire innée distribuée de manière ubiquitaire dans le système nerveux central où elle est engagée dans des interactions étroites avec les neurones, les oligodendrocytes et les astrocytes. Cependant, seule la microglie libère de la MPO après stimulation, étant une condition requise pour l’activation métabolique de l’apocynine.

La microglie dans le SNC sain a un phénotype de repos ramifié. Contrairement aux concepts antérieurs, les microglies dans le cerveau sain ne sont pas au repos mais sont des cellules hautement dynamiques qui effectuent une surveillance homéostatique de l’environnement extracellulaire par l’extension et la rétraction de leurs protubérances et la phagocytose des débris tissulaires, qui pourraient autrement provoquer une inflammation . On trouve des microglies activées dans les tissus malades du SNC, par exemple dans les lésions de la substance grise corticale démyélinisée dans le cerveau de la sclérose en plaques, autour des plaques amyloïdes dans le cerveau d’Alzheimer et dans la substantia nigra dégénérative dans la maladie de Parkinson. Bien que les divers profils d’expression de la microglie semblent refléter un large spectre continu d’états d’activation, on peut reconnaître deux états d’activation aux deux extrémités du spectre, correspondant aux états M1 et M2 désignés pour les macrophages.  » Classiquement activée « , la microglie M1, par exemple induite par le LPS ou l’IFNγ, a des fonctions pro-inflammatoires qui s’exercent par la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-12 et de substances toxiques telles que les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote. La microglie M2 « alternativement activée », telle qu’induite dans un milieu contenant des niveaux élevés d’IL-4 ou d’IL-13, a des activités anti-inflammatoires et de régénération tissulaire, qui sont médiées par des cytokines telles que IL-4, IL-10 ou TGF-β et des facteurs de réparation tels que le facteur de croissance analogue à l’insuline, l’arginase-1 ou la chitinase-like-1. Non seulement le milieu des cytokines, mais aussi l’état redox du microenvironnement, qui est directement lié à l’activité de la NADPH oxydase, détermine la différenciation fonctionnelle de la microglie vers un phénotype M1 ou M2 .

5. L’apocynine comme traitement potentiel des maladies neurodégénératives

Les cellules de la microglie M1 sont la principale ressource de Nox2 dans le cerveau. L’expression par la microglie M1 de Nox2 activée produisant des ROS est une composante essentielle de la neurotoxicité médiée par la microglie. La notion largement acceptée que les ROS dérivés de la microglie sont des médiateurs importants des lésions cérébrales neurodégénératives soulève la question de savoir si le profil pharmacologique favorable et la faible toxicité de l’apocynine peuvent être utilisés pour un traitement neuroprotecteur. Les cellules de la microglie non seulement expriment Nox2 mais sécrètent également de la MPO après activation et pourraient donc potentiellement exercer une activation métabolique de l’apocynine. Plusieurs auteurs ont rapporté l’effet bénéfique de l’apocynine sur des (modèles de) troubles neurologiques aigus, tels que l’ischémie, l’hémorragie intracérébrale et l’accident vasculaire cérébral (revue dans ). Quelles sont les perspectives pour l’apocynine dans les troubles neurodégénératifs chroniques ?

Des études in vitro utilisant des microglies en culture ont impliqué les ROS dérivés de Nox2 dans la prolifération et la polarisation fonctionnelle des microglies . Une découverte cruciale a été que l’inhibition de Nox2 favorise l’activation alternative et anti-inflammatoire de la microglie pendant la neuroinflammation . Cela implique que la suppression de Nox2 par l’apocynine pourrait rétablir un équilibre sain entre un phénotype M1 pro-inflammatoire et un phénotype M2 anti-inflammatoire/progénératif de la microglie. D’autres ont montré que l’apocynine réduit la production d’IL-1β, de TNF-α et d’oxyde nitrique par la microglie, interrompant ainsi un cycle auto-perpétué d’activité nuisible. Bien que le mécanisme neurotoxique exact de la microglie activée dans les maladies neurodégénératives soit encore incertain, il est également très intéressant de constater que la libération de l’excitotoxine glutamate nécessite l’activité de Nox2 et que celle-ci peut être inhibée par l’apocynine. Prises ensemble, ces données suggèrent un rôle potentiellement bénéfique de l’apocynine dans les maladies neurodégénératives. En effet, des effets prometteurs de l’apocynine ont été observés dans des modèles murins de certaines maladies neurodégénératives majeures.

Sclérose latérale amyotrophique (SLA, maladie de Lou Gehrig). La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative commune à l’âge adulte qui affecte les motoneurones. La maladie entraîne une déficience motrice à progression rapide et la mort, généralement dans les cinq ans. Si la cause de la maladie est inconnue chez la majorité des patients, dans un sous-ensemble de cas, la maladie a une cause génétique, à savoir des mutations dans le gène de la superoxyde dismutase-1 (SOD1). La mutation augmente le stress oxydatif par une production dérégulée de l’anion superoxyde en raison d’une dismutation réduite en H2O2. Les astrocytes mutants exprimant SOD1 sont liés à la pathologie de la SLA en raison de leur capacité réduite à absorber le glutamate et/ou de leur libération de facteurs neurotoxiques. L’extinction sélective de la SOD1 mutante ou le remplacement de la microglie mutante par la microglie sauvage dans le modèle de souris SOD1 mutante indiquent clairement un rôle pathogène central de la microglie. Harraz et al. ont utilisé l’apocynine par voie orale pour contrôler la progression de la neurodégénérescence dans un modèle de souris mutante SOD1 et ont observé des effets prometteurs ; il a été observé que l’administration d’apocynine dans l’eau de boisson prolongeait significativement la survie et retardait l’apparition de défauts moteurs. Cette étude montre que l’apocynine administrée par voie orale peut atteindre une concentration suffisamment élevée dans le parenchyme du SNC pour atténuer les niveaux neurotoxiques de production de ROS. Cependant, ces données prometteuses n’ont pas pu être reproduites dans une autre étude utilisant la même souche de souris mutante .

Maladie d’Alzheimer (MA). La maladie d’Alzheimer est un trouble neurologique progressif associé au vieillissement et conduisant à une démence irréversible. Les caractéristiques neuropathologiques de la MA sont des plaques séniles d’agrégats amyloïdes-β mal repliés et fibrillaires et des enchevêtrements intraneuronaux de protéine tau dans le cortex cérébral . Des cellules microgliales activées ont été trouvées regroupées autour des plaques séniles et produisent des agents neurotoxiques comme les ROS, le NO et le TNF-α. L’activation de la microglie Nox2 par l’amyloïde-β oligomérique et/ou fibrillaire et l’expression de Nox2 activée dans le cerveau Alzheimer ont été rapportées.

Lull et al. ont testé l’apocynine à une dose orale quotidienne de 10 mg/kg via l’eau potable dans un modèle de souris transgénique hAPP de la MA . Ils ont observé chez les souris traitées par l’apocynine une réduction significative de la taille des plaques dans le cortex et l’hippocampe et une réduction du nombre de microglies dans le cortex, mais pas dans l’hippocampe. Cependant, une caractéristique comportementale de la MA observée dans ce modèle de souris, à savoir la performance dans le test de natation du labyrinthe aquatique de Morris, qui teste la mémoire spatiale organisée dans l’hippocampe, n’a pas été nettement améliorée par le traitement. L’effet clinique limité de l’apocynine dans ce modèle pourrait être dû à l’absence de neuroinflammation manifeste, alors que celle-ci est plus importante chez les patients atteints de MA, et au fait que la formation de plaques ne prédit pas nécessairement un déclin cognitif.

Maladie de Parkinson (MP). La caractéristique pathologique de la MP est une dégénérescence progressive des neurones producteurs de dopamine dans la substantia nigra (SN), une structure pigmentée située dans la partie inférieure du mésencéphale. Par la libération de dopamine, la SN joue un rôle central dans la coordination de diverses fonctions neurologiques, notamment la récompense, la dépendance et le mouvement. Cette dernière fonction est particulièrement perturbée dans la MP. Pour compenser la perte de dopamine, on administre un précurseur métaboliquement stable de la dopamine (L-DOPA), ce qui provoque chez un nombre important de patients des mouvements involontaires typiques connus sous le nom de syndrome hyperkinétique. Alors que la grande majorité des patients atteints de la MP (sporadique) ne connaissent pas la cause de la maladie, une cause génétique a été trouvée chez une petite fraction d’entre eux, à savoir des mutations dans plusieurs gènes, dont l’alpha-synucléine, la parkine, la kinase 2 à répétition riche en leucine, la kinase putative 1 induite par PTEN et l’ATP13A2 . L’observation du développement des symptômes de la maladie de Parkinson chez les consommateurs d’héroïne contaminée par le MPTP a permis de créer un modèle animal de maladie de Parkinson cliniquement pertinent. Après conversion du MPTP en MPP+ par la monoamine oxydase B dans les astrocytes, le MPP+ se concentre dans les cellules dopaminergiques par absorption via le transporteur spécifique de la dopamine, où il bloque le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. Le stress redox qui s’ensuit entraîne, entre autres, une dérégulation du Ca2+ cellulaire qui conduit à la mort cellulaire. Tout comme dans la SLA et la MA, la neurodégénérescence dans la MP est associée à l’activation de la Nox2 de la microglie, qui contribuerait de manière significative au processus pathogène.

Utilisant un système in vitro, Gao et al. ont démontré que les ROS générés par la Nox2 de la microglie augmentent la sensibilité des neurones dopaminergiques au MPP+. Un effet bénéfique de l’apocynine sur les effets neurotoxiques médiés par la microglie a été montré dans un modèle de souris de la MP .

6. L’effet de l’apocynine dans un modèle de primate non humain de la maladie de Parkinson

L’injection répétitive d’une faible dose de MPTP chez les ouistitis communs, un primate néotropical au petit corps, provoque une maladie neurologique qui, au niveau de la présentation clinique et neuropathologique, se rapproche étroitement de la MP . Nous avons utilisé ce modèle MPTP chez 5 jumeaux ouistitis pour vérifier si l’apocynine orale est également efficace chez une espèce supérieure. Pour l’administration orale, l’apocynine a été dissoute dans de la gomme arabique ; un frère ou une sœur de chaque jumeau a reçu de la gomme contenant de l’apocynine et l’autre n’a reçu que la gomme. Le traitement à l’apocynine (100 mg/kg, TID) a commencé une semaine avant l’induction de la MP par le MPTP (1 mg/kg, par injection sous-cutanée pendant 8 jours). L’apocynine a limité la perte de poids corporel typique associée au syndrome parkinsonien. La fonction motrice des singes traités par l’apocynine a également été améliorée, ce qui indique une efficacité antiparkinsonienne de l’apocynine. En outre, le nombre de neurones dopaminergiques survivants a été augmenté par l’apocynine, ce qui indique une efficacité neuroprotectrice. Il est remarquable que l’apocynine ait une structure moléculaire similaire à celle de l’acide homovanillique (HVA), un métabolite de la dopamine. Une explication de l’efficacité protectrice de l’apocynine dans la MP pourrait également être liée à la compensation du niveau réduit de l’HVA o-méthoxycatéchol naturellement disponible.

7. Perspective pour le traitement des patients humains

L’apocynine est un promédicament oral potentiellement attractif en raison de sa faible toxicité générale et du fait que son action antioxydante spécifique est déclenchée après activation métabolique par les cellules phagocytaires libérant de la MPO. Les données sur l’innocuité de l’apocynine sont rares, mais celles qui sont disponibles montrent une faible toxicité et une grande stabilité (partiellement revues dans ). La DL50 après administration orale chez la souris a été estimée à 9 g/kg. Chez le rat, environ 80 % de l’apocynine injectée par voie intrapéritonéale à 120 mg/kg a été retrouvée sous forme inchangée dans un échantillon d’urine prélevé 20 heures plus tard. Une dose intraveineuse de 420 mg/kg d’apocynine chez la souris a provoqué des signes minimes de toxicité .

À notre connaissance, l’apocynine n’a pas été testée chez des patients humains atteints de maladies neurodégénératives. Cependant, Peters et al. ont évalué le potentiel thérapeutique de l’apocynine inhalée sur l’hyperréactivité bronchique à la méthacholine induite par l’ozone chez des patients asthmatiques comme modèle de maladie pulmonaire inflammatoire. Les auteurs ont pu exclure le piégeage de l’ozone par l’apocynine et ont conclu que l’effet était d’atténuer la production de ROS par les PMN et les éosinophiles qui avaient infiltré le poumon lors de l’exposition à l’ozone.

Les études sur la souris discutées dans cette revue montrent que de faibles doses d’apocynine administrées par voie orale atteignent le parenchyme du SNC à une concentration suffisante pour inhiber le burst oxydatif de la microglie et inhiber la neurodégénération. En tenant compte de la très faible toxicité systémique et du mode d’action très spécifique de l’apocynine, ce serait une perspective intéressante pour tester la valeur thérapeutique dans les maladies neurodégénératives humaines.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier M. Henk van Westbroek (BPRC) pour la préparation de la maquette.