Les cinq principales méthodes de marquage des anticorps primaires

Dans toute application qui utilise des anticorps pour la détection de signaux (par exemple, le Western blotting, l’ELISA, l’immunohistochimie ou le FACS), il existe deux approches de marquage des anticorps : le marquage direct et le marquage indirect. Le Western blotting standard utilise le marquage indirect car vous utilisez un anticorps primaire pour détecter l’antigène cible, suivi d’un anticorps secondaire auquel une molécule de détection est attachée.

Dans certaines situations, il peut être préférable de sauter l’anticorps secondaire et toutes les étapes associées et de marquer directement votre anticorps primaire. Les cas qui crient pour un marquage direct de l’anticorps primaire comprennent :

• Il y a une liaison non spécifique de l’anticorps secondaire
• Vous utilisez des anticorps primaires d’organismes nonanticorps primaires d’organismes non standard – dans ce cas, il peut être difficile de trouver de bons anticorps secondaires
• Lors d’un multiplexage avec des anticorps qui proviennent de la même espèce
• Lorsque vous devez raccourcir le temps expérimental en éliminant l’incubation des anticorps secondaires et les étapes de lavage associées

Paramètres d’anticorps

Vous pouvez marquer votre anticorps choisi non seulement avec des colorants fluorescents mais aussi avec des protéines fluorescentes, des enzymes, et des particules colorées. Tous ces éléments sont généralement fixés via un groupe lysine terminal, vous devez donc éviter les tampons contenant des amines (par exemple, Tris) et les molécules pendant toutes les étapes. Sinon, vous allez surtout marquer vos molécules de tampon ! Vous devez également éviter l’azide de sodium, conservateur commun des tampons, car il interfère avec la réaction de marquage.

L’anticorps pour le marquage doit être à une concentration non inférieure à 0,5 mg/ml et >90% pur. Moins vous avez de protéines interférentes et de molécules contenant des groupes amino dans votre préparation d’anticorps, plus la réaction de marquage sera efficace. Mais même si votre anticorps nage dans la glycine et la BSA, vous pouvez toujours éliminer les substances interférentes par dialyse. Vous pouvez également améliorer la pureté de votre anticorps en le faisant passer dans une colonne de protéine A ou vous pouvez même préparer votre propre colonne de purification par affinité avec un antigène approprié.

Principales méthodes de marquage d’anticorps en interne

Méthode de l’ester NHS (succinimidyl)

Cette méthode est utile pour la conjugaison d’anticorps avec des colorants fluorescents largement disponibles tels que les dérivés de la rhodamine. Elle est généralement réalisée dans un tampon phosphate avec une séparation ultérieure sur colonne du colorant non marqué. Le principal inconvénient est que les esters sont instables car ils sont sensibles à l’humidité. L’anticorps marqué doit être utilisé immédiatement après la fin de la réaction.

Méthode de l’isothiocyanate

Vous avez peut-être utilisé cette méthode pour fabriquer de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), qui est très populaire dans la préparation de protéines et d’anticorps fluorescents. Si vous avez travaillé avec la microscopie fluorescente, vous avez eu affaire au FITC. Des analogues isothiocyanates de différents colorants standards sont également disponibles.

L’isothiocyanate est plus stable que le NHS mais il est plus difficile à fabriquer et votre réaction de marquage sera probablement moins efficace avec cette méthode. Comme avec le NHS, l’excès de colorant doit être éliminé après la réaction par chromatographie.

Méthode des carbodiimides

Les composés dérivés des carbodiimides convertissent les groupes carboxyles des protéines en intermédiaires réactifs qui peuvent réagir avec les lysines. La grande réactivité des carbodiimides signifie qu’ils peuvent être utilisés pour marquer des anticorps avec des matériaux relativement inertes tels que des particules magnétiques ou d’or. Le carbodiimide le plus couramment utilisé est l’EDC. Le NHS est parfois ajouté à la réaction pour faciliter la formation d’intermédiaires relativement stables.

La méthode est simple, mais comme le NHS, l’EDC est hygroscopique, vous devrez donc utiliser votre anticorps immédiatement après le marquage.

Méthode à deux marqueurs

Ici, vous marquez votre anticorps avec une autre protéine qui sert de catalyseur, par exemple la HRP ou la phosphatase alcaline. Comme ces deux molécules contiennent de nombreux groupes amino, une réticulation directe (comme avec la méthode NHS) conduirait à des polymères de la même molécule. Par conséquent, vous effectuerez la liaison en deux étapes distinctes. Vous réticulez l’anticorps à la molécule X et le catalyseur à la molécule Y. Vous devez choisir X et Y avec soin car ils doivent interagir pour former le conjugué. Par exemple, vous pourriez choisir un maléimide comme X et un thiol comme Y.

Bien que le conjugué résultant soit plus stable que ce que vous obtenez avec la méthode NHS, cette méthode nécessitera trois fois plus de travail ; des étapes de marquage et de purification séparées pour l’anticorps, le catalyseur et la réaction de conjugaison. La bonne nouvelle est que vous pouvez acheter une molécule catalytique pré-marquée et ensuite marquer votre anticorps en conséquence.

Méthode du périodate

Cette méthode est utile pour la génération de conjugués HRP-anticorps spécifiques. Le périodate active le HRP en créant des molécules d’aldéhyde qui interagissent avec les résidus de lysine. Le HRP lui-même ne possède que quelques résidus de lysine, la polymérisation enzymatique n’est donc pas un problème important. Les liaisons entre le HRP et l’anticorps sont réversibles à moins d’être stabilisées par l’ajout de cyanohydrure de sodium.

C’était ma descente des meilleures méthodes de marquage d’anticorps faites maison. Il y a beaucoup de kits commerciaux sur le marché avec une chimie sous-jacente similaire qui peut vous rendre la vie beaucoup plus facile. Si votre laboratoire a les moyens.

Vous avez une autre méthode de marquage d’anticorps que vous aimeriez partager avec nous ? Entrez en contact en écrivant dans la section des commentaires.

Littérature:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. La chimie du clic et la radiochimie : Les 10 premières années. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi : 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.

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