PLOS ONE
Discussion
La majorité des médicaments chimiothérapeutiques sont spécifiquement conçus pour interférer avec la synthèse de l’ADN, le métabolisme cellulaire et la division cellulaire. En raison de ce mode d’action, ces médicaments sont susceptibles de provoquer plusieurs types de mutations . La mutagénicité des médicaments chimiothérapeutiques pour les cellules normales est l’un des problèmes les plus graves de la chimiothérapie en raison de la possibilité d’induire des malignités secondaires et des résultats reproductifs anormaux tels que les syndromes de Down, Klinefelter et Turner. Il est donc impératif de déterminer l’effet mutagène des médicaments chimiothérapeutiques sur les cellules normales. Le test du micronoyau a été largement utilisé pour mesurer les dommages non réparés au génome, et une fréquence accrue de MN permet de prédire le risque de cancer chez l’homme. Comme le MN peut résulter d’une rupture chromosomique (clastogénicité) ou de chromosomes retardés (aneugénicité), la détection du MN a le potentiel d’être utilisée comme un écran pour l’induction d’aberrations chromosomiques numériques si les tests qui permettent l’identification de chromosomes entiers à l’intérieur du MN, comme le test FISH, sont inclus.
L’activité clastogène de l’épirubicine pendant la mitose in vivo a été rapportée par le test MN de la moelle osseuse . À l’heure actuelle, l’origine de la MN induite par l’épirubicine n’a pas encore été déterminée. Par conséquent, l’étude actuelle a été conçue pour examiner la capacité de l’épirubicine à induire l’aneuploïdie dans les cellules somatiques et germinales de souris mâles. Pour déterminer l’efficacité de la méthode, deux mutagènes modèles, la colchicine et la mitomycine C, connus pour avoir des actions aneugéniques et clastogènes, respectivement, ont été utilisés comme témoins positifs. Les résultats observés de la MNPCE et la distribution des signaux par MN dans le contrôle et les deux mutagènes positifs dans l’étude actuelle correspondent bien aux données publiées, . Ces données ont confirmé la sensibilité du protocole expérimental suivi pour la détection des effets génotoxiques.
Les résultats du test MN ont montré que l’épirubicine produit une augmentation dose-dépendante de la formation de MN dans la moelle osseuse de souris in vivo (Fig. 1) et une augmentation des MN colorés centromériques négatifs et centromériques positifs, indiquant l’induction à la fois de la clastogénicité et de l’aneugénicité (Fig. 2). Le potentiel clastogène et aneugène de l’épirubicine dans les cellules somatiques peut donner lieu au développement de tumeurs secondaires. Les résultats de la clastogénicité confirment les conclusions d’études in vivo antérieures, dans lesquelles on a observé une augmentation de la formation de NM et des aberrations chromosomiques structurelles dans les cellules somatiques de la souris pour une gamme de doses similaire après un traitement par l’épirubicine . Les résultats de ces études concordent également avec l’induction de micronoyaux par l’épirubicine dans des cellules cancéreuses murines in vitro, dans les érythrocytes d’œufs de poule incubés et dans la lignée cellulaire lymphoblastoïde humaine TK6. En outre, l’induction d’aberrations chromosomiques structurelles et numériques a également été signalée précédemment chez des patients cancéreux recevant une chimiothérapie contenant de l’épirubicine. Des études antérieures ont également montré que l’épirubicine induit des aberrations chromosomiques structurelles dans des cellules HeLa en culture, des aberrations chromosomiques à la fois structurelles et numériques et des échanges de chromatides sœurs dans une lignée cellulaire de hamster chinois, ainsi que des aberrations chromosomiques dans des cultures de lymphocytes du sang périphérique de femmes atteintes d’un cancer du sein et traitées par un régime contenant de l’épirubicine in vitro .
Des études menées chez l’homme ont montré que certains régimes de chimiothérapie augmentent la fréquence de l’aneuploïdie dans les cellules germinales , , ce qui suggère que ces patients peuvent présenter un risque plus élevé de résultats anormaux en matière de reproduction, en particulier aux âges de la reproduction. Par conséquent, il est d’intérêt général de diminuer le risque de production d’aneuploïdie, de détecter les aneugènes des cellules germinales et de comprendre les mécanismes de causalité. Dans l’étude actuelle, l’aneuploïdie a été déterminée dans les cellules germinales par le test sperm-FISH avec des sondes d’ADN spécifiques des chromosomes 8, X et Y de la souris, chacune étant marquée d’une couleur différente. Pour déterminer la fiabilité des méthodes, la colchicine, connue pour être principalement aneugène, a été utilisée comme substance de contrôle positif, et les résultats du contrôle positif et négatif se situaient dans la même fourchette que ceux des études précédentes, -. Ces données ont confirmé la sensibilité du protocole expérimental dans la détection des effets aneuploïdogènes des composés testés.
L’épirubicine est la plus active dans les phases S et G2 du cycle cellulaire ; cependant, elle a une certaine activité détectable dans toutes les phases du cycle cellulaire . Il a souvent été signalé que les produits chimiques ayant des propriétés aneugéniques peuvent modifier la progression de la division cellulaire dans les cellules méiotiques et mitotiques . Dans la présente étude, le temps de développement des divisions méiotiques dans les spermatocytes jusqu’aux spermatozoïdes épididymaires a été évalué par le test d’incorporation de BrdU. Les résultats indiquent clairement que l’épirubicine a prolongé la durée des divisions méiotiques dans les spermatocytes de souris pendant 48 h (Fig. 3). Ces observations confirment donc les résultats précédents selon lesquels l’inhibition de la fonction de la topoisomérase II induite par l’épirubicine au cours de différentes phases du cycle cellulaire ralentit la progression du cycle cellulaire et provoque l’arrêt des cellules à la phase G2/M . Cet arrêt en G2/M peut être dû à l’induction de la machinerie du point de contrôle G2, qui permet à l’ADN endommagé d’être réparé avant que les cellules ne passent au stade suivant du cycle cellulaire .
Les informations in vivo sur les effets de l’épirubicine sur la non-disjonction pendant la méiose sont limitées, mais certaines autres anthracyclines, comme la doxorubicine et son dérivé l’idarubicine, empêchent la ségrégation chromosomique et induisent des augmentations significatives des fréquences de spermatozoïdes disomiques et diploïdes . De plus, une étude in vitro a montré que le traitement de cultures de hamster chinois avec de l’épirubicine induit des aberrations numériques sous forme d’hypodiploïdie et d’hyperdiploïdie . En outre, l’analyse cytométrique en flux et histologique de la spermatogenèse de la souris a montré une augmentation du coefficient de variation dans l’histogramme de l’ADN comme mesure de l’aneuploïdie, et une augmentation des spermatides diploïdes après le traitement avec l’épirubicine . En accord avec les rapports cités ci-dessus, la présente expérience a montré que l’exposition à l’épirubicine provoquait des augmentations significatives, proportionnelles à la dose, des fréquences de spermatozoïdes disomiques et diploïdes et que l’induction de l’aneuploïdie était linéairement proportionnelle à la dose entre 0 et 12 mg/kg d’épirubicine (Fig. 4). Ces observations in vivo sont également conformes à un rapport antérieur in vitro sur des lymphocytes humains cultivés à partir d’individus sains et de patients cancéreux chez qui l’exposition à la doxorubicine a provoqué une augmentation des trisomies des chromosomes 7 et 17. En outre, Ganapathi et al. ont signalé que les cellules de leucémie humaine HL-60 qui portent la monosomie 8 comme seule modification caryotypique ont acquis des marqueurs 7q21 après exposition à la doxorubicine. De plus, les résultats cytogénétiques ont montré une trisomie 8 chez des patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie systémique à base d’anthracycline. Une monosomie 7, une 7q- et une translocation déséquilibrée incluant le chromosome 7 ont été observées chez les patients ayant reçu une chimiothérapie contenant de l’anthracycline . En outre, des aberrations chromosomiques structurelles des chromosomes 1, 9 et 16 ont été liées aux médicaments chimiothérapeutiques contenant de l’anthracycline .
Parmi les autres classes d’inhibiteurs de la topoisomérase II, l’étoposide a été étudié précédemment dans les spermatocytes de souris , . Les résultats de ces études indiquent que l’étoposide agit comme un agent génotoxique et induit des aneuploïdies dans les cellules germinales principalement méiotiques après traitement des cellules pachytènes. D’autre part, Kallio et Lähdetie ont constaté que la sensibilité à l’étoposide chez les souris était maximale pendant la diplotène-diakinèse des spermatocytes primaires, réduite pendant la fin du pachytène et faible pendant les stades préleptotènes ; un schéma très différent de celui des produits chimiques alkylants de l’ADN. Ces auteurs ont suggéré que l’étoposide provoquait un échec de la résolution des bras chromosomiques recombinés, probablement associé à un arrêt du cycle cellulaire et au déclenchement de la voie apoptotique. Dans leurs études cytogénétiques détaillées, Marchetti et al. ont signalé que le pachytène était le stade le plus sensible de la spermatogenèse pour l’induction d’aberrations chromosomiques structurelles et d’aneuploïdie. Comme les données de Schmid et al. et celles de Kallio et Lähdetie ont pu démontrer que l’étoposide prolongeait le cycle cellulaire méiotique, il semble possible que les effets observés dans les premières divisions de clivage par Marchetti et al. dans le groupe de 24,5 jours d’accouplement aient en fait été induits à un stade ultérieur, c’est-à-dire Au cours de l’étude actuelle, nous avons planifié une étude de sperme-FISH pour déterminer si un traitement subaigu avec de faibles doses d’épirubicine, un inhibiteur de la topoisomérase II, aurait un effet parce que des stades de prophase plus précoces seraient inclus dans le traitement à l’épirubicine. Des doses individuelles de 0,25, 0,5 et 1 mg/kg d’épirubicine ont été injectées pendant 12 jours consécutifs, et les spermatozoïdes ont été prélevés 23 jours après le dernier traitement à l’épirubicine. Une dose totale de 12 mg/kg d’épirubicine appliquée à l’ensemble de la prophase de la méiose a augmenté de manière significative la fréquence des spermatozoïdes disomiques et diploïdes, tandis qu’une dose totale de 3 et 6 mg/kg de doxorubicine a été négative (Fig. 5). En revanche, une dose unique de 6 mg/kg d’épirubicine appliquée aux spermatocytes pendant la MMI/MMII a donné un résultat positif (Fig. 4). Ces données suggèrent que les stades de prophase plus précoces contribuent relativement moins à l’aneuploïdie induite par l’épirubicine dans les cellules germinales mâles.
Dans la présente étude, il a été constaté que l’épirubicine provoquait une augmentation notable des spermatozoïdes autodiploïdes (XX88 et YY88). Après le traitement avec l’épirubicine, les spermatozoïdes autodiploïdes résultant de l’arrêt de la MMII étaient plus fréquents que les spermatozoïdes diploïdes résultant de l’arrêt pendant la MMI (XY88). Ainsi, la deuxième division méiotique était plus sensible au traitement à l’épirubicine que la première division méiotique. La conclusion selon laquelle les secondes divisions méiotiques étaient plus sensibles au traitement à l’épirubicine que les premières divisions méiotiques est également soutenue par les fréquences observées de chromosomes sexuels disomiques. Les spermatozoïdes présentant des signaux XX8 ou YY8 étaient plus fréquents que les spermatozoïdes présentant des signaux XY8. Ces observations confirment que l’essai de sperme-FISH pour la disomie ou la diploïdie est capable de détecter les effets induits pendant les deux divisions méiotiques et de comparer la sensibilité des deux divisions méiotiques, comme indiqué précédemment , .
Dans le présent essai de sperme FISH, il a été constaté que la dose positive la plus faible pour provoquer des spermatozoïdes disomiques ou diploïdes était de 6 mg/kg d’épirubicine. Cependant, les études sur la MN dans la moelle osseuse des souris ont montré que l’exposition à 3 mg/kg d’épirubicine entraînait une augmentation significative de la MNPCE. Cette observation suggère que les MN dans la moelle osseuse sont induites à des doses plus faibles que les disomies ou diploïdies dans le sperme. Par conséquent, la moelle osseuse est le tissu le plus sensible. Cependant, les essais mesurent des points finaux différents. La perte et la rupture des chromosomes sont mesurées dans le test MN, tandis que la non-disjonction est détectée dans le test FISH du sperme. Par conséquent, les données actuelles confirment le paradigme général de l’évaluation des risques, selon lequel un résultat positif du test MN sur la moelle osseuse est un indicateur du potentiel génotoxique d’un composé dans les cellules germinales. Cependant, la quantification de l’aneuploïdie dans les cellules germinales est importante pour l’évaluation des risques.
Les inhibiteurs de la topoisomérase de l’ADN ont une nette tendance à provoquer des cassures de l’ADN double brin, qui se traduisent principalement par la formation de MN négatifs pour le centromère . De même, la démonstration que l’épirubicine est un inhibiteur efficace de la topoisomérase II suggère que l’épirubicine obtient ses effets clastogènes par ce mécanisme. Les métabolites de l’épirubicine peuvent également activer les cellules pour augmenter la production intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène, dont les formes stables et diffusibles peuvent endommager l’ADN nucléaire. Si les mécanismes de réparation cellulaire sont surchargés, les lésions primaires de l’ADN peuvent conduire à une aberration chromosomique structurelle ou numérique et finalement provoquer des tumeurs . Cette suggestion est étayée par le fait que les individus qui ont développé un second néoplasme malin après avoir été traités pour un premier néoplasme malin avaient une plus faible capacité à réparer les cassures double-brin de l’ADN que ceux qui n’ont pas développé de second néoplasme malin, comme le montre l’intensité γH2AX. L’induction de MN positifs pour les centromères par l’épirubicine indique qu’il peut exister un autre mécanisme par lequel l’épirubicine induit son effet génotoxique. Cette observation souligne l’importance d’utiliser la modification FISH du test MN pour déterminer l’origine des MN induits. Le mécanisme potentiel par lequel l’épirubicine peut exercer son effet aneugénique est l’inhibition de la topoisomérase II, qui peut entraîner une mauvaise ségrégation des chromosomes pendant la division cellulaire. Ceci est dû au fait que l’ADN topoisomérase II est nécessaire à la séparation correcte des chromatides sœurs au cours des divisions cellulaires, la non-disjonction et la cassure se produisant en son absence. Ainsi, l’épirubicine pourrait être capable d’inhiber deux rôles clés de la topoisomérase II ; sa capacité à ségréguer correctement les chromosomes nouvellement répliqués ainsi que sa fonction de re-ligature des cassures transitoires de l’ADN double brin.
En résumé, en utilisant le test FISH avec une sonde d’ADN centromérique pour les érythrocytes MN, il a été montré que l’épirubicine est non seulement clastogène mais aussi aneugène dans les cellules somatiques in vivo. En utilisant le test d’incorporation de BrdU, il a été démontré que le retard méiotique causé par l’épirubicine était d’environ 48 h. Avec l’analyse FISH des spermatozoïdes, il a été démontré que l’épirubicine induit des aneuploïdies pendant la méiose qui donnent des spermatozoïdes disomiques ainsi qu’un arrêt méiotique complet qui crée des spermatozoïdes diploïdes. La prévalence de spermatozoïdes autodiploïdes (XX88, YY88) et disomiques (XX8 ou YY8) indique que la deuxième division méiotique est plus sensible à l’épirubicine que la première division méiotique. Les résultats suggèrent également que les stades de prophase antérieurs contribuent relativement moins à l’aneuploïdie induite par l’épirubicine. Le potentiel clastogène et aneugène de l’épirubicine peut entraîner le développement de tumeurs secondaires et des anomalies de la reproduction chez les patients cancéreux et le personnel médical exposés à des régimes médicamenteux comprenant de l’épirubicine. Bien que l’épirubicine présente une toxicité systémique et cardiaque moindre que la doxorubicine et d’autres anthracyclines ayant un spectre d’action antitumorale équivalent, elle a des effets aneuploïdogènes et cytotoxiques sur les cellules non tumorales. Cet effet aneuploïdogène du médicament peut être responsable de l’apparition de résultats reproductifs anormaux et de tumeurs secondaires, qui sont remarqués chez certains patients cancéreux quelque temps après le traitement réussi de leurs cancers primaires par une chimiothérapie contenant de l’épirubicine.