Précipitation des protéines au sulfate d’ammonium : La clé du salage

La précipitation saline peut être un outil très puissant pour purifier les protéines par précipitation. Le sulfate d’ammonium est généralement le sel de choix car il est bon marché, très soluble dans l’eau et capable de devenir beaucoup plus hydraté (interagit avec plus de molécules d’eau) que presque tous les autres solvants ioniques. Dans la pratique, le sulfate d’ammonium est soit ajouté directement sous forme solide, soit ajouté sous forme de solution (généralement) saturée pour précipiter les protéines souhaitées.

À de faibles concentrations de sel (<0,15M), l’ajout de plus de sel en général tend à augmenter la solubilité des protéines, car les ions protègent les molécules de protéines des charges des autres molécules ; cette tendance est appelée « salting-in ». À un moment donné, la force ionique devient trop élevée et commence à avoir un effet négatif sur la solubilité des protéines, ce que l’on appelle le « relargage ». Cela se produit parce que le sel dissous entre en compétition avec les protéines pour les rares molécules d’eau, ce qui augmente la tension superficielle de l’eau et provoque donc un repli plus serré de la protéine. La réduction de la surface des protéines signifie moins d’interactions protéine-eau, ce qui permet plus d’interactions hydrophobes entre les molécules de protéines, provoquant l’agrégation et ensuite la précipitation.

Les protéines en solution peuvent également être fractionnées puisqu’elles précipitent en fonction de la concentration en sel. De cette façon, il est possible de purifier des protéines spécifiques en ajoutant une quantité spécifique de sulfate d’ammonium pour précipiter les protéines indésirables, en récupérant le surnageant, puis en ajoutant un peu plus de sulfate d’ammonium pour précipiter la protéine désirée et en conservant ce culot de protéine précipitée. Comme la précipitation saline n’affecte que la solubilité des protéines et ne les dénature pas, la fraction récupérée peut être conservée dans la solution saline pendant des périodes prolongées sans avoir à s’inquiéter d’une contamination bactérienne puisque la forte teneur en sel inhibe toute croissance microbienne ou activité protéasique.

Parce que la précipitation au sulfate d’ammonium ne fait que réduire la solubilité des protéines et ne les dénature pas les protéines peuvent être concentrées en éliminant la solution de sulfate d’ammonium restante puis le culot de protéines peut être resolubilisé dans des tampons standards ou une concentration plus faible de sulfate d’ammonium. La chromatographie par interaction hydrophobe ou la chromatographie par filtration sur gel peuvent ensuite être utilisées pour purifier davantage la solution de protéines. Le sulfate d’ammonium peut également être utilisé pour guider certaines protéines dépliées par des dénaturants tels que l’urée vers leurs conformations natives correctes en augmentant progressivement la concentration de sulfate d’ammonium.

Il existe quelques bonnes pratiques à prendre en compte lors du travail avec le sulfate d’ammonium, telles que :

• Utiliser un mortier et un pilon pour briser les amas et autrement broyer le sulfate d’ammonium pour faciliter l’addition et la dissolution.
• Ajouter seulement une petite quantité de sulfate d’ammonium à la fois, attendre qu’il se dissolve et remuer doucement pour éviter la formation de mousse.
• Utiliser un tampon tel que 50 mM HEPES ou Tris pour minimiser la nature acidifiante du sulfate d’ammonium.
• Utilisez du sulfate d’ammonium de qualité analytique car les qualités inférieures présentent généralement une contamination par les métaux lourds.

Le processus de précipitation des sels présente quelques inconvénients. La salaison des protéines nécessite une connaissance préalable de la solubilité de la protéine. En outre, les contaminants présents dans l’échantillon initial peuvent encore être présents dans la fraction contenant la protéine d’intérêt ; ce procédé concentre la protéine mais ne la purifie pas. En outre, il peut être nécessaire d’éliminer le sel de l’échantillon de protéines et donc un traitement supplémentaire sous forme de dialyse ou de chromatographie sera nécessaire.

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