Racine adventice
Méthodes d’enracinement des microshoots
Si les microshoots ne forment pas de racines pendant le stade de multiplication, ils doivent recevoir des traitements spéciaux pour initier et faire croître un système de racines adventives. Les microboutures peuvent être enracinées in vitro et ensuite acclimatées au milieu ambiant, ou elles peuvent être enracinées ex vitro, combinant ainsi l’enracinement et l’acclimatation.
La facilité et le taux de réussite de l’enracinement déterminent la méthode utilisée sur un cultivar particulier. La méthode la plus rentable est l’enracinement ex vitro des microboutures. L’enracinement ex vitro permet d’éviter un transfert in vitro supplémentaire sur le milieu d’enracinement et accélère l’acclimatation rendant la micropropagation plus efficace. L’enracinement in vitro est utilisé si les installations d’enracinement et d’acclimatation ex vitro font défaut, si les taux de réussite sont faibles avec l’enracinement ex vitro, et à la discrétion du responsable du laboratoire.
Enracinement in vitro. Les ingrédients du milieu et les conditions d’incubation sont faciles à modifier lorsque des conditions in vitro sont utilisées pour favoriser l’initiation des racines et le développement précoce. Les formulations de sels nutritifs peuvent rester les mêmes, être modifiées ou réduites, souvent à des macrosels demi-puissants, et l’humidité relative réduite par l’utilisation de couvercles ventilés (figure 5). Les conditions d’incubation de la culture en lumière et en température peuvent être modifiées pour l’enracinement. De nombreuses micro-souches sont incubées dans l’obscurité pendant une période pour l’initiation des racines, puis transférées dans des conditions éclairées.
Figure 5. Un ruban chirurgical microporeux assure la ventilation de ce vaisseau de pousses en cours d’enracinement ; cela permet de réduire l’humidité relative et de préparer les nouvelles plantes à l’environnement de la serre.
Le milieu nutritif d’enracinement sur lequel sont placées les micro-sujets fraîchement coupés contient généralement de l’auxine. Généralement, des concentrations micromolaires d’IBA et/ou de NAA sont ajoutées au milieu avant l’autoclavage. La concentration d’auxine dépend de l’espèce et du cultivar. Cette information est généralement disponible en ligne à l’aide d’un moteur de recherche savant, tel que Google Scholar http://scholar.google.com/. En général, le nom de la plante, les mots « vitro » et « racine » (ou racine adventice) dans la chaîne de recherche permettent d’obtenir des informations spécifiques. Si la littérature fait défaut pour une plante particulière, utilisez des parents proches dans la recherche pour déterminer comment ils ont réagi.
Parce qu’il est reconnu que les mêmes concentrations d’auxine qui stimulent l’initiation des racines adventives peuvent inhiber le développement des racines, certains utilisent une approche à deux milieux. Lorsque des microshoots de Cotinus coggygria ont été sur un milieu contenant 10 µM d’IBA pendant 5 jours avant d’être transférés sur un milieu sans auxine, 100% se sont enracinés ; alors que seulement 40% se sont enracinés avec une culture continue sur un milieu avec les 10 µM d’IBA (Metivier et al., 2007). Padilla et Burgos (2010) ont cultivé des microshoots d’olivier sur des milieux contenant jusqu’à 4 µM d’IBA pendant 2 semaines, suivis d’un transfert sur un milieu basal sans auxine qui a donné lieu à un enracinement de 65 à 93%, selon le cultivar.
Dans certains cas, des solutions d’IBA ont été appliquées aux microshoots en trempage basal pendant une minute ou plus. Tsvetkov et al. (2007) ont obtenu leur meilleur enracinement de microshoots de Sorbus domestica lorsqu’ils ont été trempés dans une solution d’IBA à 14,8 µM pendant 80 s avant d’être placés sur un milieu basal.
L’obscurité pendant ou avant l’enracinement peut augmenter le succès de l’enracinement et le synchronisme de l’enracinement entre les microshoots. L’étiolement, le développement des pousses sans lumière, augmentera la compétence cellulaire pour l’enracinement adventice (Murray et al., 1994). Lorsque les microboutons de noyer étaient étiolés, l’enracinement était meilleur avec une émergence plus rapide des racines qu’à partir des pousses vertes (Leslie et al., 2010) ; cependant, les pousses étiolées étaient fragiles et nécessitaient une manipulation plus prudente.
La culture de microboutons verts sur un milieu d’enracinement dans l’obscurité pendant une période relativement courte peut considérablement améliorer l’enracinement. Une période d’obscurité de 4 à 7 jours sur un milieu Murashige et Skoog demi-puissant contenant 1 µM de phloroglucinol et 1,4 µM d’IBA, suivie d’une incubation dans des conditions éclairées, a permis un meilleur enracinement des microboutures de pommes ‘Delicious’ que si elles étaient cultivées uniquement à la lumière ou dans l’obscurité pendant des périodes plus longues (Zimmerman, 1984). Lors de la culture de micro-souches de porte-greffe de pomme ‘MM106’ sur un milieu contenant 4 µM d’IBA dans l’obscurité pendant 0 à 10 jours, une étude histologique a révélé que l’induction des racines se produisait pendant les 3 premiers jours ou moins dans l’obscurité et que les primordia coniques des racines étaient visibles au 7e jour (Naija et al., 2008). Le moment du traitement dans l’obscurité est critique et peut avoir besoin d’être déterminé pour chaque culture ou génotype ; néanmoins, il peut grandement améliorer le succès de l’enracinement.
Certaines espèces s’enracinent mieux si les sommets des microsouches sont éclairés et la partie basale dans le milieu est dans l’obscurité, de la même manière que les macrocultures sont enracinées dans un milieu de serre sous brume. L’assombrissement du milieu peut être obtenu en peignant l’extérieur des récipients de culture en noir jusqu’à un niveau légèrement supérieur à celui du milieu et en recouvrant le milieu de granulés de polycarbonate stériles ou d’une autre substance empêchant la lumière de pénétrer, ou en assombrissant le milieu lui-même en ajoutant du charbon actif. Parfois, un milieu de serre, tel que la vermiculite, qui exclut également la lumière, est utilisé pour l’enracinement in vitro après avoir été mouillé avec le milieu nutritif.
Il a été démontré que l’assombrissement des bases seulement des microsouches augmentait l’enracinement des amandes, des pêches et des olives (Rugini, 1988) et des pommes (Mencuccini et Rugini, 1993) par rapport aux témoins incubés soit dans l’obscurité, soit sous des lumières. Cependant, dans une étude séparée, Mencuccini et Rugini (1993) ont rapporté que l’obscurcissement basal avait peu d’effet sur l’enracinement des microsouches d’amande, d’abricot, de châtaigne, de jojoba et d’olive et qu’il était inhibiteur pour le noyer. Par conséquent, si le succès de l’enracinement est inférieur à ce qui est souhaitable, l’assombrissement basal peut être utile.
Enracinement ex vitro. Si les pourcentages d’enracinement sont similaires, l’enracinement ex vitro peut être plus efficace et plus rentable que l’enracinement in vitro (Leva, 2011). Les coûts sont plus élevés lors de l’enracinement in vitro en raison des ingrédients, du temps de préparation, de l’autoclavage des milieux, de la main d’œuvre pour les transferts et le déplacement des cultures, et de l’espace d’incubation. Le déplacement vers la serre est similaire entre l’enracinement in vitro et ex vitro, et le temps de transplantation peut être similaire ou plus lent lorsqu’il y a des racines sur les micro-souches (Figures 4 et 6). L’efficacité est gagnée par l’enracinement ex vitro. Il a été signalé que la qualité des racines des microplants de noyer est supérieure lorsque les racines se forment ex vitro sous brouillard qu’in vitro dans un milieu gélifié (Leslie et al., 2010).
Figure 6. (a) et (b) Plantules de cerisier micropropagées enracinées in vitro prêtes à être transplantées dans un milieu de serre en tourbe de sphaigne avant d’être placées sous une humidité relative élevée pour l’acclimatation. (c) Les plantules de cerisier en cours de plantation, première étape de l’acclimatation en serre. (d) Les plantules de noyer étant plantées dans un plat avant d’être placées sous une humidité relative élevée dans une serre.
L’enracinement ex vitro peut être une amélioration de l’enracinement in vitro. Bien que les microshoots in vitro de Gardenia jasminoides se soient enracinés en 10 jours, contre 14 pour les microshoots ex vitro, tous les microshoots enracinés ex vitro ont survécu à l’acclimatation contre 80% de survie pour les microshoots enracinés in vitro (Hatzilazarou et al., 2006). Une moins bonne survie des microshoots enracinés in vitro par rapport aux microshoots enracinés ex vitro a également été rapportée pour le noyer (Leslie et al., 2010).
Il peut être nécessaire de traiter les microshoots avec de l’auxine avant de les planter dans le milieu d’enracinement pour l’enracinement ex vitro. Des microshoots de pistachier traités avec 2% d’IBA dans du talc se sont enracinés ex vitro à 79% contre 48% pour les témoins (Benmahioul et al., 2012).
Une amélioration de l’enracinement ex vitro peut également être obtenue avec de l’auxine appliquée sous forme de trempage liquide appliqué à la partie basale des microshoots. Une impulsion de 15 min dans 250 µM d’IBA a provoqué l’enracinement de 90% des microshoots de l’espèce Melia azedarach par rapport à l’absence d’enracinement sur les microshoots témoins (Husain et Anis, 2009). Un trempage de 2 h dans une solution aqueuse de 588 µM d’IBA a provoqué l’enracinement de 90% des microshoots de Malus zumi par rapport à 20% d’enracinement des témoins (Xu et al., 2008).
Peut-être en raison d’une réversion vers la juvénilité, l’augmentation du temps étant multiplié in vitro peut augmenter l’enracinement des microshoots. Leva et Petruccelli (2012) ont testé l’enracinement jusqu’à sept sous-cultures et ont constaté que l’enracinement était meilleur après la septième sous-culture.
Les installations, l’espèce, la méthode d’expédition, la demande des clients et les préférences de la direction dictent toutes la façon dont les microboutures sont enracinées. Les espèces qui s’enracinent très facilement ou qui s’enracinent pendant la phase de prolifération des pousses peuvent être acclimatées rapidement à l’environnement ex vitro. Ce sont les espèces difficiles qui font l’objet d’une attention particulière, en ce qui concerne l’éclairage, le traitement auxin, l’enracinement in vitro ou ex vitro, et d’autres facteurs. Les clones difficiles à enraciner demandent des prix plus élevés aux clients car l’enracinement est un obstacle à une production efficace. L’enracinement peut être amélioré s’il est abordé comme un processus à plusieurs étapes d’acquisition de la compétence, d’initiation des racines et de croissance ultérieure des racines. Toutes ces étapes doivent être prises en compte et traitées, en particulier avec les clones les plus difficiles à enraciner.