Séquençage au bisulfite

Le séquençage au bisulfite applique des méthodes de séquençage de routine sur de l’ADN génomique traité au bisulfite pour déterminer le statut de méthylation au niveau des dinucléotides CpG. D’autres stratégies de non-séquençage sont également employées pour interroger la méthylation au niveau de loci spécifiques ou à l’échelle du génome. Toutes les stratégies partent du principe que la conversion des cytosines non méthylées en uracile, induite par le bisulfite, est complète, ce qui sert de base à toutes les techniques ultérieures. Idéalement, la méthode utilisée devrait déterminer l’état de méthylation séparément pour chaque allèle. Les méthodes alternatives au séquençage au bisulfite comprennent l’analyse de restriction bisulfite combinée et l’immunoprécipitation de l’ADN méthylé (MeDIP).

Les méthodologies d’analyse de l’ADN traité au bisulfite sont en constante évolution. Pour résumer ces méthodologies en évolution rapide, de nombreux articles de synthèse ont été rédigés.

Les méthodologies peuvent être généralement divisées en stratégies basées sur la PCR spécifique à la méthylation (MSP) (figure 4), et en stratégies employant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) réalisée dans des conditions non spécifiques à la méthylation (figure 3). Les méthodes basées sur les microréseaux utilisent également la PCR basée sur des conditions non spécifiques de la méthylation.

Méthodes basées sur la PCR non spécifique de la méthylationEdit

Figure 3 : Méthodes d’analyse de la méthylation de l’ADN non basées sur la PCR spécifique de la méthylation. Après conversion au bisulfite, l’ADN génomique est amplifié par une PCR qui ne discrimine pas les séquences méthylées et non méthylées. Les nombreuses méthodes disponibles sont alors utilisées pour faire la discrimination en fonction des changements au sein de l’amplicon suite à la conversion au bisulfite.

Séquençage directEdit

La première méthode rapportée d’analyse de la méthylation utilisant de l’ADN traité au bisulfite a utilisé la PCR et le séquençage standard de l’ADN par didésoxynucléotides pour déterminer directement les nucléotides résistants à la conversion au bisulfite. Les amorces sont conçues pour être spécifiques du brin ainsi que du bisulfite (c’est-à-dire des amorces contenant des cytosines non-CpG de sorte qu’elles ne sont pas complémentaires de l’ADN non traité au bisulfite), flanquant (mais n’impliquant pas) le site de méthylation d’intérêt. Par conséquent, elle amplifiera à la fois les séquences méthylées et non méthylées, contrairement à la PCR spécifique de la méthylation. Tous les sites de cytosines non méthylées apparaissent sous forme de thymines dans la séquence amplifiée résultante du brin sens, et sous forme d’adénines dans le brin antisens amplifié. En incorporant des adaptateurs de séquençage à haut débit dans les amorces PCR, les produits PCR peuvent être séquencés avec un séquençage massivement parallèle. Une autre solution, qui demande beaucoup de travail, consiste à cloner et à séquencer le produit de la PCR. Des méthodes de PCR nichée peuvent être utilisées pour améliorer le produit pour le séquençage.

Toutes les techniques ultérieures d’analyse de la méthylation de l’ADN utilisant de l’ADN traité au bisulfite sont basées sur ce rapport de Frommer et al. (figure 2). Bien que la plupart des autres modalités ne soient pas de véritables techniques basées sur le séquençage, le terme  » séquençage au bisulfite  » est souvent utilisé pour décrire les techniques d’analyse de la méthylation de l’ADN par conversion au bisulfite en général.

Le pyroséquençageEdit

Le pyroséquençage a également été utilisé pour analyser l’ADN traité au bisulfite sans utiliser la PCR spécifique à la méthylation. Après amplification par PCR de la région d’intérêt, le pyroséquençage est utilisé pour déterminer la séquence convertie au bisulfite de sites CpG spécifiques dans la région. Le rapport entre C et T sur les sites individuels peut être déterminé quantitativement sur la base de la quantité d’incorporation de C et de T pendant l’extension de la séquence. La principale limite de cette méthode est le coût de la technologie. Cependant, le pyroséquençage permet bien une extension aux méthodes de criblage à haut débit.

Une autre amélioration de cette technique a été récemment décrite par Wong et al, qui utilise des amorces spécifiques à l’allèle qui incorporent des polymorphismes à nucléotide unique dans la séquence de l’amorce de séquençage, permettant ainsi une analyse séparée des allèles maternels et paternels. Cette technique est particulièrement utile pour l’analyse de l’empreinte génomique.

Analyse de conformation simple brin sensible à la méthylation (MS-SSCA)

Cette méthode est basée sur la méthode d’analyse du polymorphisme de conformation simple brin (SSCA) développée pour l’analyse des polymorphismes mononucléotidiques (SNP). La SSCA différencie les fragments d’ADN simple brin de taille identique mais de séquence distincte sur la base d’une migration différentielle en électrophorèse non-dénaturante. Dans le cas de la MS-SSCA, cette méthode est utilisée pour distinguer les régions traitées au bisulfite et amplifiées par PCR contenant les sites CpG d’intérêt. Bien que la SSCA manque de sensibilité lorsqu’une seule différence nucléotidique est présente, le traitement au bisulfite effectue fréquemment un certain nombre de conversions C-T dans la plupart des régions d’intérêt, et la sensibilité résultante approche les 100 %. La MS-SSCA permet également une analyse semi-quantitative du degré de méthylation de l’ADN basée sur le rapport des intensités des bandes. Cependant, cette méthode est conçue pour évaluer tous les sites CpG dans leur ensemble dans la région d’intérêt plutôt que des sites de méthylation individuels.

Analyse de fusion à haute résolution (HRM)Edit

Une autre méthode pour différencier l’ADN traité au bisulfite converti de celui non converti consiste à utiliser l’analyse de fusion à haute résolution (HRM), une technique quantitative basée sur la PCR initialement conçue pour distinguer les SNP. Les amplicons de PCR sont analysés directement par rampement de la température et libération résultante d’un colorant fluorescent intercalaire pendant la fusion. Le degré de méthylation, représenté par le contenu C-T de l’amplicon, détermine la rapidité de la fusion et la libération consécutive du colorant. Cette méthode permet une quantification directe dans un test à tube unique, mais évalue la méthylation dans la région amplifiée dans son ensemble plutôt que sur des sites CpG spécifiques.

Extension d’amorce mononucléotidique sensible à la méthylation (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE emploie la méthode d’extension d’amorce initialement conçue pour analyser les polymorphismes mononucléotidiques. L’ADN est converti au bisulfite, et des amorces spécifiques au bisulfite sont annelées à la séquence jusqu’à la paire de bases immédiatement avant le CpG d’intérêt. On laisse l’amorce s’étendre d’une paire de bases dans le C (ou le T) à l’aide de didésoxynucléotides de terminaison de l’ADN polymérase, et le rapport entre le C et le T est déterminé quantitativement.

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour déterminer ce rapport C/T. Au début, MS-SnuPE s’appuyait sur les ddNTP radioactifs comme rapporteur de l’extension de l’amorce. Des méthodes basées sur la fluorescence ou le pyroséquençage peuvent également être utilisées. Cependant, l’analyse par spectrométrie de masse par désorption ionisation laser assistée par matrice/temps de vol (MALDI-TOF) pour différencier les deux produits d’extension d’amorce polymorphes peut être utilisée, essentiellement sur la base du test GOOD conçu pour le génotypage des SNP. La chromatographie liquide haute performance en phase inverse à paire d’ions (IP-RP-HPLC) a également été utilisée pour distinguer les produits d’extension d’amorce.

Clivage spécifique des bases/MALDI-TOFEdit

Une méthode récemment décrite par Ehrich et al. tire davantage parti des conversions au bisulfite en ajoutant une étape de clivage spécifique des bases pour améliorer les informations obtenues à partir des changements de nucléotides. En utilisant d’abord la transcription in vitro de la région d’intérêt en ARN (en ajoutant un site promoteur de l’ARN polymérase à l’amorce PCR lors de l’amplification initiale), la RNase A peut être utilisée pour cliver la transcription de l’ARN sur des sites spécifiques aux bases. Comme la RNase A clive l’ARN spécifiquement au niveau des ribonucléotides cytosine et uracile, la spécificité de base est obtenue en incorporant du dTTP résistant au clivage lorsque le clivage spécifique à la cytosine (spécifique à la C) est souhaité, et en incorporant du dCTP lorsque le clivage spécifique à l’uracile (spécifique à l’U) est souhaité. Les fragments clivés peuvent ensuite être analysés par MALDI-TOF. Le traitement au bisulfite entraîne soit l’introduction/la suppression de sites de clivage par conversion de C en U, soit un déplacement de la masse du fragment par conversion de G en A dans le brin inverse amplifié. Le clivage C-spécifique coupe spécifiquement tous les sites CpG méthylés. En analysant les tailles des fragments résultants, il est possible de déterminer le schéma spécifique de méthylation de l’ADN des sites CpG dans la région, plutôt que de déterminer l’étendue de la méthylation de la région dans son ensemble. Cette méthode a démontré son efficacité pour le criblage à haut débit, permettant l’interrogation de nombreux sites CpG dans plusieurs tissus de manière rentable.

PCR spécifique à la méthylation (MSP)Edit

Figure 4 : La PCR spécifique à la méthylation est une méthode sensible pour amplifier et détecter de manière discriminante une région méthylée d’intérêt en utilisant des amorces spécifiques à la méthylation sur de l’ADN génomique converti au bisulfite. Ces amorces ne s’hybrident qu’aux séquences qui sont méthylées, et qui contiennent donc des 5-méthylcytosines résistantes à la conversion par le bisulfite. De manière alternative, des amorces spécifiques non méthylées peuvent être utilisées.

Cette méthode alternative d’analyse de la méthylation utilise également de l’ADN traité au bisulfite mais évite de devoir séquencer la zone d’intérêt. Au lieu de cela, les paires d’amorces sont conçues elles-mêmes pour être « spécifiques à la méthylation » en incluant des séquences complétant uniquement les 5-méthylcytosines non converties, ou, à l’inverse, « spécifiques à la non-méthylation », complétant les thymines converties à partir de cytosines non méthylées. La méthylation est déterminée par la capacité de l’amorce spécifique à réaliser une amplification. Cette méthode est particulièrement utile pour interroger les îlots CpG présentant éventuellement une forte densité de méthylation, car l’augmentation du nombre de paires CpG dans l’amorce accroît la spécificité du test. Le fait de placer la paire de CpG à l’extrémité 3′ de l’amorce améliore également la sensibilité. Le rapport initial sur l’utilisation du MSP décrivait une sensibilité suffisante pour détecter la méthylation de 0,1 % des allèles. En général, la MSP et ses protocoles connexes sont considérés comme les plus sensibles pour interroger le statut de méthylation d’un locus spécifique.

La méthode MethyLight est basée sur la MSP, mais fournit une analyse quantitative en utilisant la PCR quantitative. On utilise des amorces spécifiques de la méthylation, ainsi qu’une sonde rapporteuse de fluorescence spécifique de la méthylation qui s’annule à la région amplifiée. De manière alternative, les amorces ou la sonde peuvent être conçues sans spécificité de méthylation si une discrimination est nécessaire entre les paires de CpG au sein des séquences impliquées. La quantification est effectuée par rapport à un ADN de référence méthylé. Une modification de ce protocole pour augmenter la spécificité de la PCR pour réussir l’ADN converti au bisulfite (ConLight-MSP) utilise une sonde supplémentaire pour bisulfiter l’ADN non converti afin de quantifier cette amplification non spécifique.

Une autre méthodologie utilisant l’ADN amplifié par MSP analyse les produits en utilisant l’analyse de la courbe de fusion (Mc-MSP). Cette méthode amplifie l’ADN converti au bisulfite avec des amorces spécifiques de la méthylation et des amorces spécifiques de la non-méthylation, et détermine le rapport quantitatif des deux produits en comparant les pics différentiels générés dans une analyse de courbe de fusion. Une méthode d’analyse de fusion à haute résolution qui utilise à la fois la PCR quantitative et l’analyse de fusion a été introduite, notamment pour la détection sensible de la méthylation de bas niveau

Méthodes basées sur les microréseauxEdit

Les méthodes basées sur les microréseaux sont une extension logique des technologies disponibles pour analyser l’ADN traité au bisulfite afin de permettre une analyse de la méthylation à l’échelle du génome. Les microréseaux oligonucléotidiques sont conçus en utilisant des paires de sondes d’hybridation oligonucléotidiques ciblant les sites CpG d’intérêt. L’une est complémentaire de la séquence méthylée non altérée, et l’autre est complémentaire de la séquence non méthylée convertie en C vers U. Les sondes sont également bisulfitées. Les sondes sont également spécifiques au bisulfite pour empêcher la liaison à l’ADN incomplètement converti par le bisulfite. Le test de méthylation d’Illumina est l’un de ces tests qui applique la technologie de séquençage au bisulfite au niveau des microréseaux pour générer des données de méthylation à l’échelle du génome.