Structure complexe de l’arrestine-2 liée à un récepteur couplé aux protéines G

Caractérisation fonctionnelle et détermination de la structure du complexe Arr2-NTSR1

Les interactions des arrestines avec les RCPG non visibles sont relativement faibles et hautement dynamiques, mais l’obtention d’un complexe stable est une étape essentielle pour les études structurelles. Par conséquent, avant nos études structurelles, nous avons caractérisé l’interaction de NTSR1 avec les arrestines en utilisant le système commercial NanoBiT, qui est une méthode efficace pour détecter les interactions protéine-protéine.17 NTSR1 a été trouvé pour interagir avec les deux Arr2 et Arr3, qui est renforcée par les concentrations accrues de l’agoniste peptidique, la neurotensine (NTS). Les mutants d’arrestines avec trois résidus hydrophobes C-terminaux mutés en alanine (mutants 3 A ; I386A, V387A et F388A dans l’Arr2, et I387A, V388A et F389A dans l’Arr3),18,19 qui sont connus comme la forme pré-activée des arrestines, ont montré une activité de liaison accrue avec NTSR1 (Fig. 1b).

Nous avons également testé l’interaction arrestine-NTSR1 par le test Tango, un test cellulaire qui détermine les activités de liaison des protéines membranaires aux partenaires de liaison solubles.7,20 Nos essais Tango ont montré que l’activité de liaison de NTSR1 à Arr2 était augmentée d’environ deux à trois fois, respectivement, lorsque l’agoniste peptidique NTS ou l’agoniste à petites molécules ML314, un modulateur positif-allostérique (PAM) connu,21,22 était ajouté. L’activité de liaison de l’Arr2 à NTSR1 a été multipliée par quatre environ lorsque NTS et ML314 ont été utilisés. La liaison de NTSR1 à Arr2 a été encore améliorée en introduisant des mutations 3A (Fig. 1c).

Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons réalisé des études structurelles en utilisant le mutant 3A de Arr2 en complexe avec NTSR1 en présence de NTS et de ML314 mais le complexe s’est dissocié dans les grilles de cryo-EM en raison des effets indésirables associés à la vitrification des échantillons. Pour surmonter ce problème de dissociation, nous avons fusionné le NTSR1 humain de type sauvage avec le mutant humain 3A Arr2 à son extrémité C-terminale avec un lieur de trois acides aminés (GSA). Le domaine RIL du cytochrome b562 (BRIL) a également été fusionné à l’extrémité N-terminale du récepteur pour augmenter l’expression du complexe. La protéine Arr2 a été stabilisée en fusionnant la chaîne légère Fab30, un fragment d’anticorps utilisé pour stabiliser la forme active de la protéine Arr223, à son extrémité C avec un lieur de 12 acides aminés (GSAGSAGSAGSA). La construction du complexe de fusion a été co-exprimée avec la chaîne lourde Fab30 étiquetée His8 et une kinase de RCPG, GRK5, qui a phosphorylé le récepteur pour une meilleure liaison de l’arrestine. La protéine complexe a été purifiée à l’aide d’une colonne d’affinité au nickel en présence de 2 µM de NTS et de 10 µM de ML314, puis concentrée et purifiée à nouveau par chromatographie par filtration sur gel pour les études structurales (Fig. 1d, e, voir la section « Matériels et méthodes » pour plus de détails).

La protéine complexe BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 purifiée a présenté une température de fusion (Tm) relativement élevée à 58 °C déterminée par le test de décalage de thermostabilité24 (Fig. 1f). Elle présentait une distribution uniforme lorsqu’elle était inspectée par coloration négative EM (Fig. 1g). Les données de cryo-EM de particules uniques ont été recueillies avec un microscope FEI Titan Krios. Un nombre total de 17 206 micrographies a été enregistré, et plus de 5 millions de particules complexes ont été sélectionnées et triées pour le traitement ultérieur des données. La classification 2D a identifié de multiples conformations de particules complexes. Après une classification 3D intensive, 220 464 particules (~4,5% du total des particules initiales) ont été sélectionnées pour la reconstruction de la structure (Informations supplémentaires, Fig. S1). La carte de densité a montré une résolution moyenne de 4,8 Å déterminée par le critère de corrélation de Fourier shell (FSC) de 0,143, avec la structure centrale composée de l’Arr2 et de la région variable Fab (Fv) montrant une plage de résolution allant jusqu’à 4,5 Å (Fig. 2a et Informations supplémentaires, Figs. S1, S2). Cependant, l’hétérogénéité conformationnelle entre NTSR1 et Arr2 est toujours présente comme l’illustre l’analyse multi-corps (informations supplémentaires, Fig. S3), même si une très faible fraction de l’ensemble complet de données a été utilisée dans la reconstruction finale.

Malgré une résolution modérée, la carte EM a permis de déterminer clairement la position et l’orientation de NTSR1, Arr2, et Fab30 dans l’assemblage du complexe (Fig. 2). Le modèle de complexe a été construit en amarrant la structure cristalline du complexe NTSR1-NTS (PDB : 4GRV),14 et la structure de l’Arr2 liée au peptide C-terminal de la vasopressine phosphorylée (V2Rpp) et au Fab30 (PDB : 4JQI)23 dans la carte de densité, suivi d’un ajustement manuel du modèle, d’un raffinement en espace réel et de cycles itératifs de raffinement Rosetta et de reconstruction du modèle par rapport à la carte EM25. Le modèle final du complexe contient les résidus de NTSR1 de R49 à T416, dont l’ICL3 (A270 à P292) et la région de liaison entre l’hélice 8 et la queue C-terminale (P384 à S404) sont manquants. Le modèle de Arr2 comprend les résidus T6 à M352 et le modèle de Fab30 contient un total de 409 résidus qui comprennent à la fois la chaîne légère et la chaîne lourde du Fab. Le BRIL fusionné à l’extrémité N-terminale et la petite molécule ML314 ne sont pas visibles sur la carte de densité et ne sont donc pas inclus dans le modèle du complexe. Les statistiques et la géométrie du modèle structurel sont résumées dans les informations supplémentaires, tableau S1.

La structure globale du complexe Arr2-NTSR1

Le complexe Arr2-NTSR1 est formé par l’assemblage asymétrique des deux composants, l’axe horizontal de l’Arr2 coupant la surface interne de la membrane cellulaire à environ 20°, ce qui entraîne l’interaction des boucles hydrophobes du bord C (L191 et M192, et L334 à L338) de l’arrestine avec la membrane cellulaire (Fig. 2a, b). Ceci est cohérent avec la structure cristalline du complexe visuel arrestine-rhodopsine, qui a montré pour la première fois l’assemblage asymétrique arrestine-GPCR et a confirmé la fonction des boucles hydrophobes du bord C de l’arrestine en tant qu’ancrage membranaire qui stabilise la liaison de l’arrestine au récepteur incorporé à la membrane, ce qui a été confirmé ultérieurement par voie expérimentale.7,26,27 L’interaction des boucles hydrophobes du bord C de l’Arr2 avec la couche de la membrane cellulaire suggère que la capacité de liaison aux lipides est une propriété générale des membres de la famille des arrestines.

Malgré la similitude de l’assemblage asymétrique du complexe Arr2-NTSR1 avec celui du complexe Arr1-rhodopsine, l’orientation relative de l’arrestine au récepteur est dramatiquement différente entre ces deux complexes arrestine-récepteur. La superposition des TMDs des récepteurs de ces deux complexes révèle que l’orientation de l’Arr2 est tournée de 90° autour de l’axe transmembranaire par rapport à celle de l’arrestine visuelle (Fig. 2c). Dans cette nouvelle orientation, les positions d’ICL3 et des TM5 et TM6 du récepteur sont dirigées vers le domaine N-terminal de l’Arr2, ce qui permet à ICL3 de ressembler à la queue C-terminale pour interagir avec le domaine N de l’Arr2 (Fig. 2b).

Pour évaluer la stabilité conformationnelle de l’assemblage du complexe, nous avons effectué six simulations indépendantes de dynamique moléculaire tout-atome de deux microsecondes du complexe Arr2-NTSR1 sans le Fab30 stabilisateur. Tout au long de la simulation, les boucles C-edge L334 à L338 sont restées en association avec les lipides membranaires et la queue C-terminale de NTSR1 est restée en interaction avec le domaine N-terminal de l’Arr2 (Informations supplémentaires, Figs. S4 et S5). Cependant, la structure centrale de l’arrestine peut tourner autour de la structure cryo-EM dans une mesure limitée, et la boucle en doigt étendue peut se désengager du noyau TMD de NTSR1 (Informations supplémentaires, Fig. S5). Ces données de simulation suggèrent que la boucle en doigt ainsi que l’interface centrale entre l’Arr2 et le récepteur sont hautement dynamiques et que l’assemblage du complexe Arr2-NTSR1 capturé par la structure cryo-EM représente probablement l’un des nombreux états conformationnels, ce qui est cohérent avec le fait que l’hétérogénéité conformationnelle de l’assemblage du complexe Arr2-NTSR1 existe toujours dans les particules de la classe 3D utilisée dans la reconstruction cryo-EM finale (Informations supplémentaires, Fig. S3).

L’interface centrale de l’Arr2-NTSR1

Le complexe Arr2-NTSR1 est assemblé par des interactions intermoléculaires qui consistent en deux interfaces majeures séparées : une interface centrale constituée de deux patchs séparés entre les boucles de la crête centrale de l’arrestine et le côté intracellulaire de la TMD du récepteur, et une interface de queue entre le domaine N-terminal de l’Arr2 et la queue C-terminale du récepteur (Fig. 2b). Une parcelle de l’interface centrale entre l’Arr2 et le NTSR1 est la boucle en doigt (de E66 à L71) de l’arrestine, qui est insérée dans la cavité intracellulaire de la TMD du récepteur et entourée par ICL1, ICL2, TM5 et 6, du récepteur (Fig. 3a). Dans cette configuration, la surface supérieure de la boucle du doigt forme une interface directe avec le virage entre TM7 et l’hélice 8 du récepteur (Fig. 3a).

Pour valider l’interface de la structure complexe, nous avons réalisé des expériences de réticulation de disulfure à base de cellules. Dans cette série d’expériences, des résidus de cystéine spécifiques au site ont été introduits à l’interface de l’Arr2 et du NTSR1. Les deux protéines avec des mutations de cystéine ont été co-exprimées dans des cellules en tant que protéines séparées. Les produits de réticulation ont été formés en traitant les cellules avec un réactif oxydant et ont été contrôlés par SDS-PAGE suivi d’un western blotting pour détecter l’étiquette Flag qui a été fusionnée à l’extrémité C-terminale de Arr2. La même méthode a été utilisée pour valider l’interface visuelle du complexe arrestine-rhodopsine.7,9 Des réactions de réticulation d’un total de 177 paires de résidus ont été réalisées, parmi lesquelles nous avons observé de forts signaux de réticulation entre les résidus D67 et L68 de l’Arr2 dans la région centrale de la boucle en doigt, avec les résidus V367 à N370 de NTSR1 situés dans le tournant entre TM7 et l’hélice 8 (Fig. 3b, et les positions de ces résidus d’interface sont présentées sous forme de sphères dans la Fig. 3a). À titre de comparaison, le résidu L71 à l’extrémité C-terminale de la boucle du doigt n’a montré aucun signal de réticulation ou un signal très faible avec ces résidus de NTSR1 (Fig. 3a, b). On a également constaté que plusieurs résidus de la boucle du doigt se réticulaient avec des résidus de l’ICL1 (Q98) et de la TM6 (R294 et A297), qui sont des composants de la cavité intracellulaire de la TMD du récepteur (Informations supplémentaires, Fig. S6). Ces données de réticulation ont validé le patch d’interface entre la boucle en doigt de l’Arr2 et le récepteur et ont montré que la boucle en doigt de l’arrestine sert de composant clé de l’interface centrale de ce complexe Arr2-GPCR.

Les séquences d’acides aminés de la boucle en doigt de l’Arr2 sont enrichies en résidus acides, similaires à ceux de l’arrestine visuelle (Fig. 3c), qui est connue pour se lier à la cavité TMD chargée positivement.7 Lorsque NTSR1 et la rhodopsine sont superposées, la boucle en doigt de Arr2 occupe le même espace que la région correspondante de l’arrestine visuelle, mais elle ne s’insère pas aussi profondément dans la cavité TMD que l’arrestine visuelle (Fig. 3d), ce qui indique que l’association de la boucle en doigt de Arr2 avec la cavité intracellulaire de la TMD de NTSR1 pourrait être plus dynamique que celle entre l’arrestine visuelle et la rhodopsine.

L’autre patch de l’interface centrale entre l’Arr2 et le NTSR1 est l’interaction des régions de crête de l’Arr2 avec ICL1 et ICL2 du récepteur, qui est différente de celle du complexe arrestine visuelle-rhodopsine. Contrairement aux orientations similaires des boucles des doigts des deux arrestines, la superposition des deux récepteurs a laissé les structures centrales des arrestines dans deux orientations qui diffèrent par un angle d’environ 90° comme le montre la figure 2c. Les différentes orientations des structures centrales des arrestines Arr2 et visuelles dans leurs complexes GPCR entraînent des modes de liaison différents des régions crestales des arrestines avec les boucles intracellulaires des récepteurs, en particulier ICL1 et ICL2, dans ces deux complexes arrestine-GPCR (Figs. 2c et 4).

La comparaison structurale de NTSR1 et de la rhodopsine révèle qu’ils partagent une conformation TMD conservée avec leur ICL1 adoptant une boucle étendue et ICL2 formant une hélice courte dans leurs complexes respectifs liés à l’arrestine. L’hélice ICL2 de la rhodopsine est insérée dans la fente formée par la boucle centrale, la boucle inférieure et la boucle lariat de l’arrestine visuelle (appelée fente MBL).7 Cependant, la même fente MBL dans l’Arr2 est occupée par l’ICL1 de NTSR1 (Fig. 4a) en raison de l’orientation différente de l’arrestine. En conséquence, l’ICL2 de NTSR1 s’éloigne de la fente MBL pour se repositionner au sommet de la boucle lariat (Fig. 4a). Les expériences de réticulation disulfure ont montré des signaux de réticulation entre les résidus récepteurs L94 à S96 sur ICL1 de NTSR1 et le résidu G286 à la boucle inférieure de Arr2, ce qui est cohérent avec l’interface de ICL1 de NTSR1 avec cette région de crête de Arr2 (Fig. 4b).

L’ICL3 du récepteur, bien qu’invisible sur la carte de densité, forme probablement une interface avec le domaine N de la β-arrestine d’après la conformation du complexe Arr2-NTSR1 (Fig. 2b). Les données de réticulation disulfure ont montré que les résidus ICL3 Q275, C277, T278 et V279 de NTSR1 se sont réticulés avec les résidus T56, T58, V81 et N83 à la surface supérieure du N-domaine de l’Arr2 (Fig. 4c et informations supplémentaires, Fig. S6). Ces résidus ICL3 ont également montré de forts signaux de réticulation avec le résidu K160 de l’ARRONGE (Fig. 4d). D’autres signaux de réticulation disulfure ont été observés entre la plupart des résidus de Q273 à G280 de la ICL3 de NTSR1 et le résidu P14 de la protéine Arr2 (Fig. 4d). Ces données de réticulation indiquent que l’ICL3 du récepteur est positionné près du domaine N et peut interagir avec des résidus à la surface du domaine N de l’Arr2 (Fig. 4e).

L’interface de la queue de l’Arr2-NTSR1

Alors que l’interface du noyau de l’Arr2-NTSR1 est très dynamique, l’interface de la queue entre la queue C-terminale de NTSR1 et le domaine N de l’Arr2 semble similaire à celle du complexe arrestine-rhodopsine visuel9 (Fig. 5). Nous avons observé la densité électronique à un niveau de contour de 0,016 (auquel la densité de la structure globale du complexe peut être correctement représentée) d’environ dix résidus de la queue C-terminale de NTSR1 qui se lient au premier brin β de Arr2 (Fig. 5a). Cependant, des informations détaillées sur cette région de la queue C-terminale, y compris ses résidus spécifiques, sont difficiles à identifier en raison de la résolution limitée de la carte de densité. Les analyses de la protéine de fusion NTSR1-Arr2-Fab30 par spectrométrie de masse (Fig. 5b et Informations complémentaires, Fig. S7) ont révélé que sept résidus sérine ou thréonine de S401 à T416 sur la queue C-terminale de NTSR1 étaient phosphorylés, ce qui suggère une implication possible de cette région dans la liaison à la surface chargée positivement du N-domaine de l’arrestine. Des expériences de réticulation disulfure ont montré que le résidu P14 de l’Arr2 au niveau du tour C-terminal du premier β-brin s’est fortement réticulé avec les résidus du récepteur H406 à S410 (Fig. 5d et informations supplémentaires, Fig. S6), ce qui indique que les résidus du récepteur C-terminal à H406 sont probablement la région qui se lie au N-domaine de l’arrestine (Fig. 5c).

Un modèle pour l’interaction Arr3-GPCR

Le génome humain contient deux sous-types de β-arrestine : Arr2 et Arr3, qui partagent plus de 53% d’identité de séquence mais ont à la fois quelques chevauchements et quelques fonctions divergentes. Comme l’Arr3 a montré une affinité de liaison au NTSR1 similaire à celle de l’Arr2 (Fig. 1b), nous avons voulu vérifier si le mode de liaison de l’Arr3 au NTSR1 est conservé avec celui de l’Arr2. Nos expériences de réticulation de disulfure ont montré que les résidus de la boucle en doigt de l’Arr3 E67 à L72 (correspondant à E66 à L71 de l’Arr2) se sont réticulés avec l’ensemble correspondant de résidus (A369 et N370) au niveau du tournant entre TM7 et l’hélice 8 de NTSR1 (Informations supplémentaires, Fig. S8), indiquant une interface de boucle en doigt conservée avec TM7 et H8 du récepteur entre ces deux β-arrestines.

En outre, les données de réticulation de disulfure ont montré que le résidu P15 de l’Arr3 (correspondant à P14 de l’Arr2) s’est réticulé avec les résidus N405 à T407 de la queue C-terminale du récepteur, suggérant une interface de queue similaire entre l’Arr3 et le NTSR1 (informations supplémentaires, figure S8). Un schéma de réticulation similaire entre les résidus ICL3 de NTSR1 et les résidus du domaine N de la protéine Arr3, y compris P15 à l’extrémité C-terminale du premier β-brin et K161 (correspondant à K160 de la protéine Arr2) sur la boucle entre les β-brins supérieurs, a également été observé (Informations supplémentaires, Fig. S8). Ensemble, ces données de réticulation suggèrent que l’assemblage global de l’Arr3 avec le NTSR1 est similaire à celui de l’Arr2 avec le NTSR1 dans cette configuration engagée du noyau.

Un modèle pour le recrutement de la β-arrestine par 5-HTR1A et 5-HTR1B

Plusieurs RCPG, y compris les récepteurs de la sérotonine 5-HTR1A et 5-HTR1B ainsi que plusieurs récepteurs de la dopamine, sont dépourvus ou contiennent une queue C-terminale très courte et il est proposé qu’ils utilisent leur ICL3 comme interface alternative pour recruter les β-arrestines28. Les récepteurs 5-HTR1A et 1B ont des ICL3 longs avec de multiples sites de phosphorylation pour une interaction potentielle avec les domaines N chargés positivement des β-arrestines. Nos essais de liaison biochimique ont démontré que les deux récepteurs se liaient à l’Arr2 et 3 avec une activité similaire à celle du NTSR1 avec l’Arr2 (Informations supplémentaires, Fig. S9). Cependant, lorsque la structure du complexe visuel arrestine-rhodopsine a été utilisée comme modèle, il a été difficile de modéliser le mode de liaison de l’ICL3 phosphorylé de 5-HTR1A ou 1B à la fente chargée positivement sur le domaine N des β-arrestines. Cela est dû au fait que les TM5 et 6 ainsi que l’ICL3 de la rhodopsine sont positionnés sur le site opposé à la surface chargée positivement du domaine N de l’arrestine dans la structure du complexe arrestine-rhodopsine visuel.

La structure du complexe Arr2-NTSR1, cependant, présente un assemblage complexe distinct avec l’Arr2 tourné de 90° par rapport à la position de l’arrestine visuel dans le complexe arrestine-rhodopsine (figure 2c). TM5 et TM6 de NTSR1 sont donc positionnés au-dessus de la surface avant du domaine N de l’Arr2, permettant à ICL3 du récepteur (non visible dans la structure) d’atteindre le domaine N chargé positivement de l’Arr2 (Fig. 4e). Nos données de réticulation disulfure fournissent la preuve que l’ICL3 de NTSR1 peut interagir avec la fente chargée positivement du domaine N de l’Arr2 et 3 (Fig. 4c-e, Informations supplémentaires, Figs. S6 et S8). Par conséquent, la structure du complexe Arr2-NTSR1 peut servir de modèle approprié pour modéliser l’interface des β-arrestines avec 5-HTR1A et 5-HTR1B.

En utilisant la structure du complexe Arr2-NTSR1 comme modèle, et la structure cristalline du 5-HTR1B lié à l’ergotamine comme modèle initial pour le 5-HTR1B (PDB : 4IAR),29 nous avons généré un modèle d’homologie du complexe Arr2-5-HTR1B, dans lequel l’interface centrale entre l’Arr2 et le 5-HTR1B est similaire à celle du complexe Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, b). Nous avons ensuite réalisé des expériences de réticulation de disulfure pour tester l’assemblage complexe de l’Arr2-5-HTR1B montré dans le modèle d’homologie (Fig. 6c et informations supplémentaires, Fig. S10).

Nous avons observé des signaux de réticulation entre les résidus de la boucle en doigt D67 L68, V70 et L71 de l’Arr2 et les résidus N373, E374 et D375 au niveau du virage entre TM7 et l’hélice 8 de 5-HTR1B (figure 6c). Les résidus D67, L68, V70 et L71 de la boucle du doigt se sont réticulés avec les résidus du récepteur R308 et K311 à la surface interne de TM6 (Informations supplémentaires, Fig. S10). Ces données de réticulation soutiennent un mode de liaison conservé de la boucle en doigt de l’Arr2 avec la cavité intracellulaire du domaine TM de 5-HTR1B (Fig. 6a, b). Les données de réticulation disulfure ont également montré des signaux de réticulation entre les résidus R285 et G286 de l’Arr2 dans la boucle inférieure de l’arrestine avec le résidu K79 de l’ICL1 de 5-HTR1B (Fig. 6c et Informations supplémentaires, Fig. S10). Cette réticulation spécifique est uniquement compatible avec l’orientation de l’arrestine dans le modèle Arr2-NTSR1, mais elle n’est pas compatible avec le complexe visuel arrestine-rhodopsine. Ensemble, ces données de réticulation ont soutenu une interface centrale entre la région de la crête de l’Arr2 et le côté intracellulaire du domaine TM de 5-HTR1B, qui est conservée avec celle du complexe Arr2-NTSR1 (Fig. 6a-c).

5-HTR1B contient de multiples résidus sérine et thréonine dans la zone centrale de son long ICL3 qui peuvent être phosphorylés pour se lier à la surface du domaine N de l’arrestine chargé positivement (Fig. 6d). Nous avons conçu des mutations de paires de cystéines dans l’interface potentielle entre l’ICL3 du récepteur et le N-domaine de l’Arr2 et avons constaté que les résidus T268, S295, L298 et E300 de l’ICL3 étaient réticulés avec des résidus à la surface du feuillet β supérieur, y compris T56, V81, N83, K147 et K157 de l’Arr2 (Fig. 6e et Informations supplémentaires, Fig. S10). Les résidus S260 et T268 sur ICL3 ont montré des signaux de réticulation avec les résidus K11 sur le premier brin β et N15 sur la spire suivant le premier brin β de Arr2 (Fig. 6e et Informations supplémentaires, Fig. S10). Le résidu S260 est proche de l’extrémité C-terminale de TM5, et sa réticulation avec K11 sur le côté chargé positivement du N-domaine de l’Arr2 n’est possible que dans l’orientation Arr2-NTSR1, mais pas dans l’orientation arrestine visuelle-rhodopsine, car dans la structure du complexe arrestine visuelle-rhodopsine, les deux TM5 et 6 du récepteur sont positionnés sur le site arrière de la surface chargée positivement du N-domaine de l’arrestine.

Nous avons également observé un schéma de réticulation Arr2 presque identique entre 5HTR1A et 5-HTR1B. Des signaux de réticulation ont été observés entre les résidus D67, L68, V70 et L71 de la boucle du doigt de l’Arr2 et les résidus N404, K405 et D406 (correspondant à N373, E374 et D375 de 5-HTR1B) au niveau du virage entre TM7 et l’hélice 8 de 5-HTR1A (informations supplémentaires, figure S11). Les résidus D67 et L68 de la boucle en doigt étaient également réticulés avec les résidus du récepteur R339 et K342 (correspondant à R308 et K311 de 5-HTR1B) à la surface interne de TM6 (Informations supplémentaires, Fig. S11). Nous avons également observé une réticulation disulfure entre les résidus R285 et G286 de la boucle inférieure de l’Arr2 et le résidu L67 de l’ICL1 de 5-HTR1A (correspondant à K79 de 5-HTR1B) (Informations supplémentaires, Fig. S11). Ces données de réticulation soutiennent une interface centrale similaire entre Arr2 avec 5-HTR1A et 5-HTR1B, qui est conservée avec celle du complexe Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, c).

L’ICL3 de 5-HTR1A contient plus de 100 résidus d’acides aminés (233 à 336) avec 12 résidus de sérine ou de thréonine qui constituent six codes de phosphorylation partiels avec des résidus d’acide glutamique ou d’acide aspartique (Informations supplémentaires, Fig. S12). Nous avons conçu des mutations de paires de cystéines pour cartographier l’interface potentielle entre ICL3 de ce récepteur et le domaine N de Arr2. Les données de réticulation ont montré que les résidus ICL3 V230, T240, P250, R261, K270 et D285 se réticulent avec V81 et K160 dans le N-domaine de l’Arr2 (Informations supplémentaires, Fig. S11). Le résidu P14 du premier brin β de l’Arr2 s’est fortement réticulé avec les résidus N300, P308, P315, P318, P321 et R323 de l’ICL3 de 5-HTR1A (Informations supplémentaires, Fig. S11).Ces données de réticulation, ainsi que le modèle d’homologie du complexe Arr2-5-HTR1B, ont permis d’obtenir une image globale de la façon dont 5-HTR1A et 5-HTR1B recrutent l’Arr2.

Dans cet article, nous rapportons une structure de l’Arr2 en complexe avec NTSR1, un RCPG de classe A, par analyse cryo-EM de particules uniques. Bien que le mode de liaison de l’interface de la queue entre la queue C-terminale du récepteur et le N-domaine de l’arrestine chargé positivement soit conservé avec celui du complexe visuel arrestine-rhodopsine, cette structure présente une orientation de l’Arr2 différente de celle observée dans le complexe visuel arrestine-rhodopsine. La modélisation de l’homologie et la cartographie de l’interface par réticulation de disulfure démontrent que cette interface centrale est conservée dans les complexes Arr2 avec la sous-famille 5-HTR1A et 1B. Dans ces modèles de complexes, l’orientation de l’Arr2 permet à l’ICL3 du récepteur d’atteindre la surface du N-domaine de l’Arr2, offrant la possibilité à un RCPG dépourvu de queue C-terminale d’utiliser son ICL3 pour interagir avec le N-domaine de l’arrestine. Comme l’Arr2 et l’Arr3 sont des partenaires protéiques exprimés de manière ubiquitaire pour la transduction du signal de nombreux RCPG non visuels, nos études structurelles et biochimiques de l’interaction de l’Arr2 avec les membres de la sous-famille NTSR1 et 5-HTR1 ont fourni un modèle alternatif pour comprendre l’interaction de l’Arr2 et de l’Arr3 avec les RCPG non visuels.