Technologie de l’ADN ramifié (bDNA)

BY admin
|

Introduction

Le dosage de l’ADN ramifié (bDNA) constitue un outil unique et puissant pour une quantification fiable des molécules d’acide nucléique. Fondamentalement différent des méthodes d’amplification de cible telles que la PCR, le test ADNb mesure directement les molécules d’acide nucléique à des niveaux physiologiques en amplifiant le signal rapporteur, plutôt que de répliquer les séquences cibles comme moyen de détection, et évite donc les erreurs inhérentes à l’extraction et à l’amplification des séquences cibles. Le test ADNb utilise une amplification linéaire du signal en utilisant des sondes oligonucléotidiques synthétiques et des molécules d’ADNb, et peut mesurer avec précision et exactitude entre environ 500 et 10 000 000 de molécules. Les nouvelles avancées de la technologie bDNA comprennent l’ajout de molécules préamplificatrices et l’incorporation de nouveaux nucléotides, isoC et isoG, dans les séquences de sondes oligonucléotidiques pour améliorer encore le signal et réduire le bruit causé par l’hybridation non spécifique des composants du test bDNA. Ces améliorations ont étendu la limite de détection quantitative du test bDNA à aussi peu que 50 molécules.

Histoire de la technologie bDNA

Bien adapté à une utilisation de routine dans un cadre clinique ou de recherche, le test bDNA a été appliqué avec succès dans un certain nombre de domaines, y compris le pronostic et le suivi des patients atteints de maladies virales. Fournissant un moyen fiable de quantifier directement la charge virale dans les échantillons cliniques, les tests bDNA ont été développés pour mesurer l’ADN du virus de l’hépatite B, l’ARN du virus de l’hépatite C, l’ARN du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 et l’ADN du cytomégalovirus. Grâce à la conception personnalisée de sondes oligonucléotidiques, les applications potentielles du test bDNA vont bien au-delà de la quantification des acides nucléiques viraux. En créant des sondes oligonucléotidiques pour des séquences spécifiques de molécules d’acide nucléique cibles, le test bDNA a été adapté à une grande variété d’applications. Par exemple, les chercheurs ont conçu des sondes pour le test ADNb afin de mesurer les niveaux d’ARNm cellulaires. Cette approche s’est avérée fructueuse pour un certain nombre d’applications de recherche, notamment la surveillance des changements dans les niveaux d’ARNm des cytokines chez les populations de patients sains et immunodéprimés, l’étude des modèles d’épissage de l’insuline et l’évaluation de l’induction des gènes de stress pour les applications de toxicologie moléculaire. Compte tenu de sa polyvalence, de sa facilité d’utilisation et de son haut niveau de performance, le test bDNA est rapidement en train de devenir la méthode de choix pour la quantification des acides nucléiques

Outline

Le test bDNA utilise un format de microplaque à 96 puits et repose sur une série de réactions d’hybridation spécifiques et sur la détection par chimioluminescence des sondes hybridées. Des sondes de « capture » contenant une séquence nucléotidique spécifique sont fixées à la surface de chaque micropuits. Ces sondes de capture se lient à un sous-ensemble de « sondes cibles » qui sont liées à des séquences nucléotidiques spécifiques dans la molécule d’acide nucléique cible. Cette série d’hybridations ancre la molécule d’acide nucléique cible à la surface du micropuits. La détection de l’acide nucléique cible et l’amplification du signal sont réalisées par une autre série d’hybridations.

Un deuxième sous-ensemble de sondes cibles lie la molécule d’acide nucléique cible à des molécules amplificatrices d’ADNb. Avec l’ajout de molécules préamplificatrices pour fournir une couche supplémentaire d’amélioration entre les sondes cibles et les molécules amplificatrices d’ADNb, une amplification du signal encore plus grande peut être obtenue. Chaque molécule amplificatrice d’ADNb a été conçue pour contenir 15 bras, chacun d’entre eux contenant trois sites de liaison pour des « sondes de marquage » conjuguées à la phosphatase alcaline. Un signal chimioluminescent est généré lors de l’introduction d’un substrat de dioxétane qui est activé par la phosphatase alcaline. Ce signal est facilement quantifié en comptant le nombre de photons émis dans un luminomètre. Le dosage de l’ADNb est intrinsèquement quantitatif puisque le nombre de photons émis est directement lié à la quantité d’acide nucléique cible dans l’échantillon.

Matériels

Équipement – Réchauffeur de plaques Chiron équipé d’un support de micropuits 8×12 – Luminomètre à lecture de plaques Chiron

Réactifs pour le jour 1

  • Micropuits oligonucléotides-.micropuits modifiés
  • Diluant de lyse
  • Réactif de lyse (protéinase K)
  • Sondes cibles pour la capture
  • Sondes cibles pour le marquage
  • Spécimens

    • .

  • Etalons et contrôles (facultatif)

Réactifs pour le jour 2

Procédure

Jour 1

  1. Préparation du réactif de travail de l’échantillon en combinant :
  • 6 ml de diluant de lyse
  • 600 ml de réactif de lyse
  • 32 ml de sondes cibles 500 fm/ml pour la capture (20 fm/200 ml final)
  • 96 ml de sondes cibles 500 fm/ml pour le marquage (60 fm/200 ml final)

Note : Les concentrations réelles des sondes cibles varient en fonction de la molécule d’acide nucléique cible.

  1. Pour les échantillons de plasma ou de sérum, pipeter 150 ml de réactif de travail pour échantillon et 50 ml de sérum ou de plasma dans des micropuits modifiés par des oligonucléotides en double. Pour les échantillons de cellules ou de tissus, préparer et extraire les culots d’ARN dans le réactif de travail des échantillons comme décrit, et pipeter 200 m de chaque extrait d’ARN dans des micropuits doubles modifiés par des oligonucléotides.
  2. Si on le souhaite, des contrôles positifs et négatifs peuvent être inclus à des fins de spécificité. Les contrôles doivent être traités de la même manière que celle décrite pour les échantillons à l’étape 2 (ci-dessus) et analysés en double.
  3. Si on le souhaite, des standards peuvent être inclus pour une quantification absolue. Pipeter 150 ml de réactif de travail pour échantillon et 50 ml du membre de la courbe standard approprié dans des micropuits modifiés par des oligonucléotides en double.
  4. Sceller les micropuits avec un film Mylar et incuber les micropuits pendant une nuit à 53°C dans le réchauffeur de plaques Chiron. (Remarque : la température dépendra de la température optimale définie pour le dosage spécifique.)

Jour 2

  1. Sortez la plaque du réchauffeur de plaques Chiron et laissez-la reposer 10 min à température ambiante. Pendant que la plaque refroidit, préparer la solution d’amplificateur en diluant le concentré d’amplificateur à 200 fm/ml dans du diluant pour étiquette. La concentration finale doit être de 10 fm/50 ml.
  2. Laver les micropuits deux fois avec le lavage A, puis pipeter 50 ml d’amplificateur dilué dans chaque puits. Incuber les micropuits pendant 30 min à 53°C dans le réchauffeur de plaques Chiron.
  3. Sortir la plaque du réchauffeur de plaques Chiron et la laisser reposer 10 min à température ambiante. Pendant que la plaque refroidit, préparez la solution de travail de l’étiquette en diluant la sonde d’étiquette à 500 fm/ml dans un diluant d’étiquette. La concentration finale doit être de 20 fm/50 ml.
  4. Laver les micropuits deux fois avec le lavage A, puis pipeter 50 ml de la solution de travail de marquage dans chaque puits. Incuber les micropuits pendant 15 min à 53°C dans le réchauffeur de plaques Chiron.
  5. Sortir la plaque du réchauffeur de plaques Chiron et la laisser reposer 10 min à température ambiante. Pendant ce temps, préparer la solution de substrat composée de 99,7% v/v de LumiphosPlus et de 0,3% v/v de SDS 10% (par exemple : 3 ml de LumiphosPlus, 9 ml de SDS 10%).
  6. Laver les micropuits deux fois avec le lavage A, puis trois fois avec le lavage B. Ajouter 50 ml de la solution de substrat dans chaque puits.
  7. Mesurer la chimiluminescence dans le luminomètre à lecture de plaque. (Cela comprend l’incubation des micropuits pendant 30 minutes à 37°C avant la mesure pour atteindre la cinétique de l’état d’équilibre).

Dépannage

  • Les puits modifiés par des oligonucléotides doivent être manipulés avec soin. Ne pas casser les bandes de puits en segments. Scellez solidement les puits avec un scellant de plaque frais pour éviter l’évaporation pendant les incubations. Lors du retrait de l’opercule de plaque après les incubations, faire attention à ne pas tirer les puits hors du support de micropuits.
  • Tous les échantillons, standards et contrôles doivent être dosés en double pour une quantification optimale. Annuler les spécimens lipémiques ou turbides car ils peuvent donner des résultats non concluants.
  • Pour des résultats optimaux, tous les réactifs doivent être amenés à la température indiquée dans la procédure de dosage avant utilisation. Ajouter le réactif dans les micropuits en touchant l’embout de la pipette à la paroi près du point médian du puits, au-dessus de la surface du fluide dans le puits.

Application

La quantification virale ou le test de charge virale fait désormais partie de la prise en charge de routine des patients infectés par le VIH-1 ou le virus de l’hépatite C (VHC). Il existe actuellement plusieurs technologies moléculaires qui peuvent être utilisées dans le cadre d’un laboratoire clinique. Parmi celles-ci, seuls les tests d’ADN ramifié (ADNb) sont approuvés par la FDA pour les tests de charge virale du VIH-1 et du VHC. Cette technologie d’amplification du signal est construite sur une série de réactions d’hybridation qui se prêtent très bien à une automatisation complète et réduisent ainsi la quantité de travail nécessaire pour effectuer ce type d’analyse.

Les tests de diagnostic moléculaire utilisant la technologie bDNA pour la détection de molécules cibles d’acide nucléique sont des outils sensibles, spécifiques et fiables pour le diagnostic des infections virales et bactériennes et pour le suivi de l’évolution de la maladie au cours de la thérapie. Les tests bDNA ont évolué des stades de développement dans le laboratoire de recherche à des tests quantitatifs approuvés par la US Food and Drug Administration avec des applications cliniques précieuses. Les tests ADNb demandent moins de travail que de nombreuses procédures moléculaires car ils se prêtent à une automatisation totale. Avec l’ADNb, l’amplification d’une séquence cible n’est pas nécessaire et, par conséquent, la contamination croisée entre les échantillons répétés, due à un excès d’amplicons ou à un transfert, est moins probable dans les tests d’ADNb. En outre, comme l’ADNb est une technologie d’amplification du signal, le test est capable de quantifier avec moins de 0,5 log ou une variabilité de 3 fois pour toute sa gamme dynamique.

La technologie de l’ADNb s’est avérée polyvalente car des méthodes ont été développées pour la détection de l’infection par un large éventail de microorganismes, notamment le parasite Trypanosoma

brucei, le cytomégalovirus, les bactéries Staphylococcus sensibles aux antibiotiques et résistantes aux antibiotiques, le papillomavirus humain et le virus de l’hépatite B. Cependant, les efforts les plus récents ont porté sur le développement de tests ADNb pour la quantification de l’ARN du VIH-1 et du virus de l’hépatite C (VHC), ce qui a conduit à l’application de routine des méthodes ADNb dans les laboratoires de diagnostic moléculaire clinique. En décrivant l’avancement des méthodes bDNA, cette revue met l’accent sur les tests bDNA pour le VIH-1 et le VHC.

Tests bDNA VIH-1 de première génération

Des tests bDNA de première génération précis et reproductibles ont été développés pour la détection de l’ARN du VIH-1 et de l’ARN du VHC dans le plasma humain (Quantiplex HIV-1 or HCV RNA 1.0, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 Dans l’un des premiers rapports sur le test Quantiplex bDNA, aucune réactivité n’a été observée avec des échantillons de plasma provenant de donneurs séronégatifs en utilisant le test bDNA de première génération

, ce qui indique une excellente spécificité.9 Des résultats positifs dans le dosage de l’ADNb ont été observés dans 83 % des échantillons provenant de 348 patients séropositifs pour le VIH-1.9 La gamme dynamique pour la quantification à l’aide du dosage Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 s’étendait de 104 (limite inférieure de détection) à plus de 106 copies d’ARN du VIH/mL.9,11 Des variations de la charge virale de 2 à 3 fois étaient statistiquement significatives avec le test bDNA, ce qui indique que le test Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 est très précis et reproductible.11 En comparaison, des variations de la charge virale d’au moins 3,7 à 5,8 fois étaient nécessaires pour que les résultats soient statistiquement significatifs avec les premières versions du test RT-PCR.11 Ainsi, l’ADNb est devenu la méthode de choix pour la plupart des essais cliniques évaluant la charge virale et l’efficacité clinique des nouveaux inhibiteurs de la transcriptase inverse et de la protéase du VIH-1.

La sensibilité de la méthode de détection de l’ADNb a été améliorée dans le test VIH-1 de deuxième génération (test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0, Bayer) en modifiant la conception des sondes de cible et de capture et en ajoutant des oligonucléotides préamplificateurs. L’amélioration de la conception des sondes cibles et de capture a permis d’augmenter la rigueur de l’hybridation, diminuant ainsi le bruit de fond du test. Les préamplificateurs augmentent considérablement l’intensité du signal car chaque molécule préamplificatrice possède plusieurs régions pour l’hybridation à de nombreuses molécules d’ADNb. En outre, chaque molécule d’ADNb possède de multiples séquences répétées pour l’hybridation de sondes marquées AP. Le signal produit par le test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 a montré une linéarité d’environ 500 copies/mL à 1,6 × 106 copies/mL (la plage dynamique indiquée était de 500 à 8 × 105 copies/mL). La sensibilité du test ADNb du VIH-1 de deuxième génération a été multipliée par 20 par rapport au test de première génération (les limites inférieures de détection étaient de 500 copies/mL et de 10 × 104 copies/mL, respectivement). Dans le cadre d’une analyse approfondie de la précision, les résultats des tests initiaux et les résultats des retests du test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 ont été comparés. Le test HIV-1 RNA 2.0 s’est avéré très reproductible.14 Sur 174 échantillons dont la charge virale était supérieure à 5 000 copies/ml, 96 % présentaient des différences inférieures à 0,3 log10 en nombre de copies entre les résultats initiaux et les résultats du retest. Sur 69 échantillons dont la charge virale était comprise entre 500 et 5 000 copies/mL, 86 % présentaient des différences inférieures à 0,3 log10 entre les résultats initiaux et les résultats de la réanalyse. Cependant, parmi les 5 339 patients qui ont été testés dans le cadre de tests cliniques de routine pendant un intervalle d’un an, des charges virales inférieures à 500 copies/mL ont été observées dans 41,6 % des échantillons.

Par conséquent, un test ADNb avec une sensibilité plus élevée (c’est-à-dire une limite inférieure de détection de <500 copies/mL) était nécessaire pour une proportion substantielle de patients.

Les caractéristiques de performance du test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 et d’un test RT-PCR (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ont été comparées en utilisant des dilutions d’échantillons standards dont le nombre de copies du virus HIV-1 était connu. Lorsque des dilutions des mêmes échantillons standard ont été testées dans les deux tests, les nombres de copies du VIH-1 étaient généralement plus élevés dans le test RT-PCR que dans le test ADNb. Par exemple, les gammes de nombres de copies d’ARN étaient de 900 à 7,68 × 105 copies/mL dans le test ADNb et de 3 360 à 1,88 × 106 copies/mL dans le test RT-PCR. Les deux tests étaient linéaires pour les plages dynamiques indiquées.

La comparaison des pentes des lignes de régression du nombre de copies du VIH-1 par rapport à la sortie du signal a suggéré que le test ADNb avait moins d’erreur systématique proportionnelle. La variabilité entre les séries, en utilisant un échantillon standard avec 1 650 copies de VIH-1/mL, était plus faible dans le test bDNA que dans le test RT-PCR ; les coefficients de variation pour les tests bDNA et RT-PCR étaient respectivement de 24,3 % et 34,3 %, ce qui indique que le test bDNA était légèrement plus précis à ce nombre de copies d’ARN du VIH-1. Par rapport à l’utilisation de la norme de 1 650 copies/mL, les coefficients de variation entre les séries étaient plus élevés pour un échantillon contenant 165 copies d’ARN du VIH-1/mL (44,0 % et 42.7% pour les tests bDNA et RT-PCR, respectivement). Les résultats des tests étaient similaires lorsque des nombres égaux de copies du VIH-1 étaient comparés entre les sous-types A à F du VIH en utilisant le test bDNA. Cependant, par cette version de la RT-PCR, les sous-types A, E et F ont été détectés moins efficacement que les sous-types B, C et D. Les différences entre le test bDNA de deuxième génération et le test Amplicor Monitor RT-PCR pour la quantification du VIH-1 indiquaient qu’une cohérence dans la méthode de test était nécessaire pour chaque patient individuel tout au long du diagnostic et du traitement.

Tests bDNA du VHC

Tout en continuant à développer un test bDNA du VIH-1 de troisième génération amélioré, Bayer a reconnu le besoin de développer un test de charge virale du VHC avec une utilité clinique émergente similaire à celle du test du VIH-1. Pour la détection du VHC, le test bDNA de première génération (test Quantiplex HCV RNA 1.0, Bayer) avait une plage de quantification dynamique dans le plasma humain de 3,5 × 105 à 1,2 × 108 copies d’ARN du VHC/mL. Les génotypes 1 à 6 ont été détectés à l’aide de ce test, bien que la sensibilité ait été plus faible pour les génotypes 2 et 3 (taux de détection de 67 % : signal positif pour 60 des 89 échantillons de sérum connus pour contenir les génotypes 2 ou 3 du VHC) par rapport au génotype 1 (taux de détection de 97 % : signal positif pour 67 des 69 échantillons de sérum connus pour contenir le génotype 1 du VHC). Une comparaison entre le test Quantiplex HCV RNA 1.0 et un test RT-PCR développé par un laboratoire de recherche pour le VHC a montré une plus grande sensibilité du test RT-PCR, qui avait une limite inférieure de détection de 2,5 × 104 copies d’ARN du VHC/mL. Cependant, le test ADNb du VHC avait une meilleure reproductibilité et prenait moins de temps que le test RT-PCR du VHC développé par le laboratoire.

Pour améliorer le taux de détection des génotypes 2 et 3 du VHC, un test de deuxième génération a été développé (test Quantiplex HCV RNA 2.0, Bayer).15 Le principal changement de conception dans le test ARN du VHC de deuxième génération était d’utiliser des sondes pour les séquences du génome du VHC qui étaient plus fortement conservées entre les génotypes. Ces régions conservées étaient les séquences 5′ non traduites et les séquences du gène central du génome du VHC. Les changements apportés aux sondes cibles et de capture ont permis de réduire considérablement la variation du taux de détection entre les génotypes du VHC dans le test de deuxième génération. Chacun des 6 génotypes du VHC avait un taux de détection élevé, et la détection des génotypes 2 et 3 du VHC s’est nettement améliorée (détection de 93 % contre 67 % des échantillons connus pour contenir les génotypes 2 ou 3 du VHC dans les tests HCV 2.0 et HCV 1.0, respectivement). De plus, la sensibilité du test bDNA de deuxième génération était légèrement améliorée par rapport au test HCV 1.0 (les limites inférieures de quantification étaient de 2,0 × 105 contre 3,5 × 105 ).

Troisième génération de tests bDNA pour le VIH-1 et le HCV

Dans les tests bDNA de première et deuxième génération, l’hybridation non spécifique des sondes oligonucléotidiques à des séquences non ciblées limitait la sensibilité du test. L’amélioration technologique essentielle du test ADNb de troisième génération (test Quantiplex HIV-1 RNA 3.0, Bayer) a été l’utilisation de bases non naturelles, la 5′-méthyl-2′-déoxyisoguanosine (isoG) et la 5′-méthyl-2′-isodeoxycytidine (isoC), dans la synthèse de toutes les sondes du système bDNA, à l’exception des prolongateurs de capture qui servent à capturer l’acide nucléique viral cible à la surface de la plaque. Comme les oligonucléotides contenant des isoG et des isoC ne sont pas présents dans la nature, l’hybridation non spécifique est considérablement réduite. Ainsi, les sondes modifiées avec les bases non naturelles ne forment pas d’hybrides stables avec la sonde de capture en l’absence d’ARN cible. Lors de la description initiale du test de troisième génération, la limite de détection du VIH-1 dans les échantillons de plasma de 11 patients était de 50 copies par ml, ce qui représente une amélioration de 10 fois la limite de détection par rapport au test de deuxième génération. Au cours du traitement par une thérapie antirétrovirale hautement active, la charge virale du VIH-1 a diminué pour passer en dessous de la limite de détection chez les 11 patients.

Le test VERSANT HIV-1 RNA 3.0 a une plage dynamique de 75 à 5 × 105 copies d’ARN du VIH/mL. La version 3.0 a également été approuvée à une limite inférieure de détection égale à 50 copies/mL dans plusieurs autres pays. Lorsque des échantillons appariés ont été comparés dans le test ADNb du VIH-1 de deuxième génération (Quantiplex version 2.0) et dans le test RT-PCR Amplicor Monitor 1.0, des nombres de copies du VIH-1 systématiquement plus faibles ont été obtenus avec le test ADNb. Toutefois, une étroite corrélation quantitative entre le nombre de copies d’ARN du VIH-1 a été observée entre le test de troisième génération (version 3.0) et le test RT-PCR Amplicor Monitor 1.5.18 Les résultats de la charge virale dans le test ADNb version 3.0 et dans le test RT-PCR Amplicor étaient environ 2 fois plus élevés que dans le test version 2.0. Des résultats quantitativement similaires dans le test ADNb version 3.0 et dans le test RT-PCR sont importants pour les soins aux patients en raison de la possibilité probable que des méthodes différentes soient utilisées pour tester les échantillons d’un même patient pour le cours des thérapies anti-VIH. Des données récentes suggèrent qu’il n’est peut-être pas nécessaire de procéder à une nouvelle sélection pour les patients testés avec un test RT-PCR.

Similaire au test bDNA version 3.0 du VIH-1, le test bDNA de troisième génération pour le VHC utilise également des oligonucléotides substitués par des isoC et des isoG pour réduire l’hybridation non spécifique. L’utilisation d’oligonucléotides substitués par des isoC et des isoG a multiplié la sensibilité du test par 62 environ. La limite inférieure de détection du test HCV RNA 3.0 était de 3,2 × 103 copies/ml, contre 2 × 105 copies/ml pour le test HCV RNA 2.0. La plage de quantification linéaire dynamique de l’essai HCV RNA 3.0 s’étendait de 3,2 × 103 copies/mL (615 UI/mL) à 4 × 107 copies/mL (7,7 × 106 UI/mL). Le test HCV RNA 3.0 avait une spécificité élevée (98,2 %) et, comme le test de deuxième génération, était aussi efficace pour la quantification de l’ARN du VHC pour tous les génotypes. Les écarts types entre les séries et à l’intérieur des séries pour les échantillons répétés étaient respectivement de 0,2 log10 et 0,14 log10, ce qui indique que le test de troisième génération était hautement reproductible.

En plus de l’éradication du VHC dans le sérum, un objectif important des thérapies anti-VHC est de réduire les niveaux de VHC dans le foie. L’utilité du test HCV RNA 3.0 pour la détection et la quantification de l’ARN du VHC dans les échantillons de biopsie du foie a été étudiée chez 25 patients co-infectés par le VHC et le VIH.20 La reproductibilité du test bDNA du VHC de troisième génération était similaire entre les échantillons de biopsie du foie et les échantillons de sérum. De plus, la détection de l’ARN du VHC dans les échantillons de foie de patients infectés par les génotypes 1, 3 et 4 par le test HCV RNA 3.0 était hautement spécifique et sensible. Dans cette étude portant sur 25 patients, des niveaux élevés de VHC intrahépatique avant traitement ont été corrélés à une faible fréquence de réponse au traitement anti-VHC. Les niveaux intrahépatiques de VHC avant traitement étaient les plus élevés chez les patients infectés par le génotype 1 du VHC. Les résultats de cette étude ont démontré que des marqueurs importants de la progression de la maladie du VHC, les niveaux de VHC dans le foie et dans le sérum, peuvent être quantifiés de manière fiable par l’analyse de l’ADNb pendant le traitement. Les méthodes pour les tests bDNA de troisième génération comprennent la préparation de l’échantillon, l’hybridation et la détection du signal pour l’ARN du VIH-1 et l’ARN du VHC. Tous les 3 s eps sont réalisés dans les micropuits de la plateforme System 340 pour le test HCV RNA 3.0 qui ne nécessite pas d’étape d’extraction séparée. Dans la version 3.0 du test HIV-1 RNA, la préparation de l’échantillon est différente de la méthode HCV RNA et est réalisée en dehors de la plateforme System 340. Une étude récente a évalué une adaptation de la version 3.0 de la méthode de l’ARN du VIH-1 dans laquelle l’étape de traitement de l’échantillon de VIH-1 a été modifiée pour permettre le dépistage simultané du VHC et du VIH-1 sur la plateforme du Système 340. La méthode VIH-1 a été modifiée en omettant l’incubation de 2 heures à 63°C pour la lyse virale. Au lieu de cela, la lyse du VIH-1 et du VHC a été effectuée sur la plateforme du système 340. Les méthodes de test de l’ADNb du VHC sont restées inchangées dans l’essai combiné. La spécificité et la quantification par la méthode combinée bDNA étaient conformes aux spécifications des tests individuels pour le VIH-1 et le VHC. Les tests simultanés pour le VIH-1 et le VHC ont amélioré le déroulement des opérations dans le laboratoire clinique et ont permis de réduire les coûts. La détection et la quantification de l’ARN du VIH-1 et du VHC étant cruciales pour le diagnostic et l’évaluation des réponses au traitement, la possibilité de réaliser des tests simultanés pour les deux virus représente une avancée significative dans le diagnostic moléculaire.