Une approche plus précise de la détection et du sous-typage des amyloïdes : Combinaison de la coloration rouge Congo in situ et de l’immunohistochimie

Abstract

L’amylose est le résultat de diverses maladies différemment abordables. Il est vital de sous-typer les dépôts amyloïdes afin d’établir et finalement de traiter correctement la maladie sous-jacente. Outre la coloration classique au rouge Congo, d’autres procédures comme la coloration immunohistochimique sont nécessaires pour la classification. Nous présentons ici une approche plus précise utilisant une double coloration rouge Congo/immunohistochimique facilement applicable dans les diagnostics de routine. Des modifications de la technique de coloration au rouge Congo et des procédures immunohistochimiques ont été nécessaires afin de combiner les deux procédures de coloration sur une seule lame. L’évaluation a été réalisée à l’aide de la microscopie classique à lumière et à fluorescence. En raccourcissant le temps de coloration du rouge Congo à 10 s et en modifiant le blocage de la peroxydase endogène, des résultats précis ont pu être obtenus pour évaluer la double coloration rouge Congo/immunohistochimie à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les sections de 2 μm au lieu de 4 μm d’épaisseur étaient supérieures pour l’évaluation, car elles augmentaient la spécificité de la coloration. La combinaison du rouge Congo et de l’immunohistochimie comme double coloration in situ sur une lame est une approche réalisable dans le diagnostic de l’amylose. Elle permet de se concentrer sur les zones fluorescentes positives au rouge Congo lors de l’évaluation de l’immunohistochimie, évitant ainsi de signer des résultats faussement positifs. En outre, il augmente le rapport signal/bruit des sections colorées par immunohistochimie sur la microscopie conventionnelle.

© 2016 S. Karger AG, Bâle

Introduction

L’amylose est la description morphologique du dépôt de protéines mal repliées que l’on peut trouver dans de nombreux types de tissus différents . Les protéines formant l’amyloïde proviennent d’une pléthore de sources, allant des tumeurs, comme les néoplasmes plasmocytaires ou les carcinomes médullaires de la thyroïde, aux infections chroniques, ou sont observées à la suite du vieillissement. Dans de rares cas, l’amylose est due à des troubles du repliement des protéines hérités génétiquement. L’importance clinique de l’amylose va de la découverte fortuite à l’autopsie à des maladies potentiellement mortelles. Lors de l’examen de spécimens de tissus, il est important que les pathologistes gardent à l’esprit la probabilité de dépôts amyloïdes, car il peut s’agir du premier indice d’une maladie sous-jacente grave encore inconnue. Il est important de noter que, bien qu’il existe des résultats prometteurs concernant les thérapies ciblant les dépôts amyloïdes eux-mêmes, les approches thérapeutiques de l’amylose visent toujours principalement le trouble sous-jacent et, dans la majorité des cas, celui-ci peut et doit être déterminé sur la base de la sous-typisation amyloïde.

La coloration histochimique classique de l’amyloïde est le rouge Congo, introduit par Bennhold en 1922 ; la biréfringence typique « vert pomme » utilisant la polarisation a été décrite pour la première fois en 1927. Afin d’augmenter la sensibilité et la spécificité de la coloration au rouge Congo, plusieurs méthodes ont été utilisées, notamment l’évaluation des sections colorées au rouge Congo par lumière fluorescente, en raison des propriétés fluorescentes connues du rouge Congo. Tout récemment, des approches utilisant une technique de polarisation de l’hématoxyline-éosine renforcée numériquement ont été proposées pour la détection de l’amyloïde , étant particulièrement utiles pour identifier l’amyloïde dans les cas où peu de tissus sont disponibles.

L’étalon-or pour le sous-typage de l’amyloïde est l’immunohistochimie, y compris plusieurs protocoles bien établis ; cependant, il existe certaines lacunes, en particulier en considérant la spécificité plus faible des anticorps contre la chaîne légère amyloïdogène lambda. Une nouvelle approche pour sous-typer les variantes particulièrement rares de l’amylose est la spectrométrie de masse ; malheureusement, en raison de problèmes de coût et de disponibilité, cette méthode prometteuse n’a pas été largement utilisée jusqu’à présent, avec un défaut supplémentaire étant sa limitation évidente dans les cas où peu de tissus sont disponibles ou avec une quantité limitée d’amyloïde déposée. Une autre réalisation récente est l’utilisation de la microscopie immunoélectronique des aspirats de graisse abdominale pour sous-typer les dépôts amyloïdes ; cependant, il s’agit d’une méthode sophistiquée.

Plusieurs études antérieures se sont concentrées sur la combinaison de la fluorescence et de l’immunohistochimie . Ici, nous présentons des preuves supplémentaires de la praticabilité d’une telle approche et rapportons un protocole facilement traduisible en routine, qui nous a permis d’aborder avec précision la sous-typisation amyloïde sur des tissus fixés au formol et inclus en paraffine. La double coloration rouge Congo/immunohistochimie permet de se concentrer sur les zones positives au rouge Congo lors de l’évaluation immunohistochimique et d’augmenter le rapport signal/bruit des sections colorées par immunohistochimie lors de l’évaluation conventionnelle en microscopie optique, améliorant à la fois la spécificité et la sensibilité de la procédure ainsi que la réduction de la quantité de tissus nécessaires au diagnostic.

Matériels et méthodes

Sélection des cas

Des spécimens avec un diagnostic prouvé d’amylose provenant de nos archives ont été utilisés pour établir la nouvelle technique. Ils sont énumérés dans le tableau 1, y compris les étapes pour lesquelles le tissu respectif a été utilisé.

Approches de coloration au rouge Congo

La coloration au rouge Congo a été initialement réalisée selon le protocole établi dans notre institut : les tissus fixés au formol et inclus en paraffine sont coupés en coupes de 6-μm d’épaisseur, déparaffinés et colorés au rouge Congo pendant 30 min – 2.5 g de rouge Congo (Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne) et 1 g d’hydroxyde de potassium (Merck Millipore) dissous dans 500 ml d’éthanol à 80 % ; ensuite, les sections sont rincées à l’eau du robinet avant d’être contre-colorées à l’hématoxyline (Merck Millipore) pendant 4 min. Dans une étape suivante, les sections sont différenciées dans une solution de HCl/éthanol à 0,5% et rincées à nouveau avec de l’eau du robinet pendant 10 min avant d’être déshydratées et montées.

Pour notre étude, le protocole a été modifié concernant le temps de coloration au rouge Congo afin de voir, quel impact des temps de coloration plus courts pourraient avoir sur la coloration immunohistochimique ultérieure. Des sections d’une épaisseur de 2 et 4 μm ont également été testées.

Coloration immunohistochimique et blocage de la peroxydase endogène

Les conditions de coloration immunohistochimique pour les différents sous-types amyloïdes sont listées dans le tableau 2. Comme suggéré par le fabricant, deux clones différents ont été utilisés pour la détection des chaînes légères amyloïdogènes kappa et lambda, respectivement. L’immunohistochimie a été réalisée après la procédure de coloration au rouge Congo. Brièvement, des lames déparaffinées et bloquées contre la peroxydase endogène (voir plus loin) ont été incubées dans une solution de sérum de cheval normal (pour la coloration de l’amyloïde AA) ou de chèvre normale (pour toutes les autres colorations)/Tris-buffered saline (TBS) (900 μl de sérum/60 ml de TBS) pendant 30 min à température ambiante (les deux sérums provenant de Vector Lab., Burlingame, Calif, USA), puis incubé pendant une nuit avec l’anticorps primaire à 4°C, rincé et incubé avec une solution d’IgG anti-souris biotinylée (pour la coloration de l’amyloïde AA) ou d’IgG anti-lapin biotinylée (pour toutes les autres procédures de coloration) (300 μl d’IgG/900 μl de sérum normal de cheval ou de chèvre/60 ml de TBS ; les deux IgG proviennent de Vector Lab.) pendant 30 min à température ambiante ; enfin, ils ont été rincés et incubés avec un kit avidine-biotine-peroxydase (Vectastain de Vector Lab.) pendant 30 min et visualisés en appliquant du 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC ; de Dako, Glostrup, Danemark) prêt à l’emploi comme chromogène (10-20 min sous contrôle optique instantané) et de l’hématoxyline de Meyer (de Medite, Dietikon, Suisse). L’AEC a été préférée car des expériences antérieures ont montré de meilleurs résultats signal/bruit pour la visualisation de l’AEC par rapport à la visualisation de la diaminobenzidine. Comme l’AEC est soluble dans l’eau et l’alcool, les lames ont été recouvertes de Medi-Mount (de Medite, Burgdorf, Allemagne) pendant 30 min avant de les recouvrir.

Puisque le traitement habituel pour le blocage de la peroxydase endogène des tissus (solution de H2O2 à 3% dans de l’éthanol à 70%) après avoir terminé la coloration au rouge Congo a conduit à la perte de la congophilie, d’autres méthodes pour le blocage de la peroxydase endogène ont été testées, telles que : le déplacement de cette étape avant la coloration au rouge Congo et la substitution de l’éthanol à 70% par de l’eau distillée.

Évaluation

Les sections doublement colorées au rouge Congo/immunohistochimie ont d’abord été évaluées à l’aide d’un microscope optique conventionnel pour estimer si le produit chromogène immunohistochimique respectif était visualisé comme prévu, moins bien ou mieux par rapport à la coloration de routine diagnostique (sans pré-coloration au rouge Congo). Ensuite, un microscope à fluorescence avec un filtre à rhodamine (Zeiss Axioskop 40 ; Zeiss, Göttingen, Allemagne) a été utilisé pour évaluer la fluorescence du colorant rouge Congo. Les zones qui présentaient une fluorescence intensive spécifique ont été évaluées plus avant par microscopie optique pour voir si les dépôts amyloïdes pouvaient également être détectés par immunohistochimie dans ces zones.

Résultats

Étape 1 : Modifications du protocole de coloration du rouge Congo

Plusieurs temps de coloration du colorant rouge Congo ont été testés. Cela était nécessaire car la capacité des anticorps à se lier aux antigènes était réduite par la procédure de coloration au rouge Congo et le rouge Congo à pleine intensité rendait difficile une évaluation concomitante, puisqu’un chromogène rouge (AEC) de couleur similaire à celle du rouge Congo était utilisé pour l’immunohistochimie. En appliquant le temps de coloration original de 30 min, la biréfringence a pu être détectée pour les dépôts amyloïdes à l’aide d’un filtre polarisé en microscopie optique conventionnelle. Lorsque la coloration au rouge Congo n’a duré que 5, 10 ou 20 s, des signaux positifs ont toujours pu être détectés en utilisant le filtre rhodamine d’un microscope à fluorescence, alors que la microscopie conventionnelle n’a montré qu’occasionnellement une congophilie et une biréfringence en utilisant le filtre polarisé (fig. 1). Pour une analyse plus approfondie, le temps de coloration du rouge Congo a été de préférence réduit à 10 s afin d’éviter une coloration excessive ; 10 s a été choisi pour des raisons de praticabilité (plus facile à respecter régulièrement par rapport à 5 s) dans le laboratoire humide.

Étape 2 : Modifications des protocoles immunohistochimiques pour combiner le rouge Congo et la coloration immunohistochimique sur une diapositive

Dans une première étape, la coloration immunohistochimique a été réalisée sur des sections séparées pour confirmer l’antigénicité des tissus utilisés pour cette étude, qui ont montré des résultats de coloration satisfaisants en utilisant les protocoles de routine établis, comme détaillé dans le tableau 2.

Lors de la combinaison de la coloration au rouge Congo (temps de coloration au rouge Congo de 10 s) avec la coloration immunohistochimique sur les mêmes sections, il a été noté que la congophilie disparaissait après avoir terminé les procédures immunohistochimiques en utilisant le traitement commun pour le blocage de la peroxydase endogène des tissus (solution de H2O2 à 3% dans de l’éthanol à 70%) puisque le colorant rouge Congo a été éliminé par lavage. Par conséquent, dans une troisième étape, le traitement pour le blocage de la peroxydase endogène a été modifié. Le blocage de la peroxydase endogène en utilisant la méthode conventionnelle, mais en l’appliquant avant la procédure de coloration au rouge Congo, ainsi que le remplacement de l’éthanol à 70 % par de l’eau distillée, lors du blocage de la peroxydase endogène après la coloration au rouge Congo, ont donné des résultats satisfaisants, tant pour l’évaluation de la coloration au rouge Congo que pour la coloration immunohistochimique. Afin de respecter autant que possible le déroulement habituel des opérations en laboratoire, la méthode consistant à remplacer l’éthanol par de l’eau distillée a été appliquée. La tentative d’omettre le blocage de la peroxydase endogène a modérément diminué les résultats du rapport signal/bruit pour la visualisation de l’AEC (en supposant que les enzymes endogènes non bloquées utilisaient l’AEC et, d’une part, produisaient une légère coloration de fond et, d’autre part, privaient le complexe ABC-peroxydase de chromogène pour une visualisation correcte) et n’a donc pas été exploitée davantage. La qualité de la coloration immunohistochimique après pré-coloration au rouge Congo était la même que celle de la coloration immunohistochimique sans coloration préalable au rouge Congo ; nous avons donc conclu que la réalisation d’une immunohistochimie sur des sections pré-colorées au rouge Congo pendant 10 s n’entraîne pas de perte d’antigénicité ni de résultats de coloration non spécifiques.

Étape 3 : Modifications des épaisseurs de section

Enfin, nous avons examiné le rôle de différentes épaisseurs de section (2 et 4 μm). En général, la spécificité et l’évaluabilité de la coloration immunohistochimique (rapport signal/bruit) étaient meilleures sur les sections plus fines ; en outre, il y avait moins d’artefacts concernant le détachement des tissus des lames pendant les procédures de coloration. Tous les cas ont montré les mêmes résultats que ceux obtenus lors du sous-typage diagnostique initial des dépôts amyloïdes.

Exemples de mise en œuvre de l’approche décrite dans les procédures de diagnostic de routine

Les figures 2 et 3 illustrent deux cas de routine, dans lesquels la sous-typisation amyloïde a pu être réalisée en utilisant le nouvel algorithme proposé dans cette étude ; en appliquant uniquement la technique conventionnelle, aucun résultat interprétable n’a été obtenu.

Discussion

Nous présentons et validons ici une procédure combinée de double coloration rouge Congo/immunohistochimie, qui permet de se concentrer sur les zones positives au rouge Congo lors de l’évaluation de l’immunohistochimie, améliorant ainsi la spécificité de la sous-typisation amyloïde basée in situ. Elle aide également à épargner les tissus, ce qui est un problème car le matériel de biopsie devient de plus en plus limité en raison des approches diagnostiques modifiées utilisant des carottes d’aiguilles fines et des forcipes de biopsie.

Contrairement à d’autres nouvelles techniques d’évaluation proposées se concentrant sur l’évaluation d’images numérisées sophistiquées , notre approche peut être facilement incorporée dans les diagnostics de routine. Les conditions préalables comprennent uniquement la modification de la coloration rouge Congo établie, l’immunohistochimie amyloïde disponible ainsi qu’un microscope à fluorescence avec un filtre à rhodamine. L’idéal serait d’utiliser des microscopes équipés à la fois pour la microscopie à fluorescence et pour la microscopie optique classique, car cela simplifie le processus de vérification des mêmes zones d’intérêt (fluorescentes) de dépôt amyloïde lors de l’évaluation de l’immunohistochimie par un simple changement de source lumineuse et de filtre. Cependant, deux microscopes différents pourraient également être utilisés, mais dans les cas difficiles, prendre une photo des zones respectives en microscopie de fluorescence et de lumière pourrait être suggéré pour une évaluation plus facile.

En concordance avec les études précédentes, nous avons pu montrer que le rouge Congo n’interfère pas ou ne perturbe pas l’immunohistochimie . En outre, par rapport aux épaisseurs de section de 4-6 μm utilisées dans la plupart des études jusqu’à présent , nous avons pu démontrer que l’utilisation de sections plus fines de 2 μm, qui sont avantageuses pour l’immunohistochimie (meilleur rapport signal-bruit, moins d’artefacts de détachement), peut également conduire à des résultats satisfaisants concernant la coloration au rouge Congo, si elle est lue par un microscope à fluorescence.

Il y a eu plusieurs articles récents propageant l’utilisation de la fluorescence pour évaluer les dépôts amyloïdes et démontrant sa supériorité sur la microscopie à lumière polarisée en étant à la fois plus spécifique et plus sensible . Dans cette étude, nous avons affiné et optimisé cette approche de plusieurs manières en travaillant sur un protocole adapté concernant le temps de coloration, les procédures de coloration ainsi que l’épaisseur des sections. Ces changements ont finalement permis de réaliser une double coloration in situ pour la détection sensible et spécifique des dépôts amyloïdes ainsi que pour la sous-typisation de ces dépôts, ce qui est crucial pour distinguer la maladie sous-jacente conduisant aux dépôts amyloïdes. Notre approche de double coloration permet non seulement de détecter de manière sensible l’amyloïde par fluorescence et en même temps de catégoriser précisément ces dépôts, mais aussi d’économiser du matériel en évitant les coupes sérielles, sur lesquelles les dépôts amyloïdes, parfois minuscules, auraient déjà été coupés. Depuis l’établissement de cette double coloration, nous avons déjà utilisé cette approche dans plusieurs cas, dans lesquels un diagnostic final n’a pas pu être atteint par d’autres méthodes. Les figures 2 et 3 illustrent deux de ces cas.

Cependant, il pourrait y avoir encore de la place pour une perfection supplémentaire. Comme les systèmes de détection à base d’immunoalcaline-phosphatase qui ne nécessitent pas de blocage de la peroxydase endogène ne sont pas actuellement utilisés dans notre flux de travail immunohistochimique, la substitution des systèmes de détection à base d’immunoperoxydase par les premiers pourrait encore améliorer les résultats et alléger le flux de travail du laboratoire.

Pour conclure, nous présentons une approche optimisée et raffinée pour la double coloration rouge Congo/immunohistochimie. Cette approche est bénéfique en ce qui concerne la spécificité, les coûts et la quantité de tissu nécessaire. Ses exigences sont minimales et devraient permettre une utilisation généralisée.

Reconnaissances

Thomas Menter est soutenu par la Fondation Nuovo-Soldati pour la recherche sur le cancer, Vaduz, Liechtenstein.

Déclaration d’éthique

L’étude ne concerne que du matériel humain d’archive de l’Institut de pathologie de Bâle et a été approuvée par la Commission d’éthique de la Suisse du Nord-Ouest et de la Suisse centrale (EKNZ 2014-252). Aucun animal n’a été impliqué.

Déclaration de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts.

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