Une bande de flux latéral basée sur des nanoparticules d’or pour détecter la 6-monoacétylmorphine dans le fluide oral

Introduction

L’abus d’opioïdes a augmenté de façon spectaculaire ces dernières années et constitue une cause majeure de morbidité et de mortalité. Selon le Rapport mondial sur les drogues 2017 publié par l’Office des Nations unies contre la drogue et le crime, la consommation d’opiacés et d’opioïdes sur ordonnance n’est peut-être pas aussi répandue que celle du cannabis, mais les opioïdes restent des drogues majeures avec des dommages potentiels et des conséquences sur la santé . Par conséquent, la détection facile et rapide des opioïdes est un besoin urgent.

L’abus d’héroïne illicite est l’une des formes les plus courantes de dépendance aux opioïdes. L’héroïne (diacétylmorphine, diamorphine ou Diagesil®) est un dérivé semi-synthétique de la morphine et un puissant analgésique opioïde . Le métabolisme de l’héroïne est visualisé dans la figure 1 . L’héroïne s’hydrolyse rapidement en 6-monoacétylmorphine (6-MAM) et finalement en morphine. Comme l’héroïne s’hydrolyse rapidement après son administration, ses métabolites sont généralement employés pour confirmer l’usage. En outre, le 6-MAM est le seul indicateur spécifique de l’abus récent d’héroïne par rapport à la morphine, et il a suscité un grand intérêt de la part de la communauté des chercheurs.

Plusieurs méthodes pour détecter le 6-MAM ont été décrites, et elles peuvent être divisées dans les catégories suivantes : (1) analyse chromatographique, y compris la chromatographie en phase gazeuse et la chromatographie liquide à haute performance ; (2) analyse spectroscopique telle que la spectroscopie Ramen, la spectroscopie infrarouge, la chimiluminescence , etc… ; (3) électrophorèse capillaire ; et (4) méthodes de dosage immunologique (antigène-anticorps) . Les techniques d’instrumentation complexes exercent une pression énorme sur le dépistage de base des drogues, car elles nécessitent des équipements sophistiqués et des opérateurs professionnels. Le laboratoire est parfois fermé ou éloigné. Même les commissariats de police ne peuvent pas accueillir cet équipement complexe et coûteux. Or, un policier doit juger immédiatement si un matériau suspect contient ou non de l’héroïne et doit réagir rapidement. Il est donc urgent de développer des méthodes spécifiques, fiables et simples pour détecter les drogues illicites dans les échantillons biologiques.

Parmi les méthodes de détection rapide, les bandes de flux latéral (LFS) à base de nanoparticules d’or colloïdal (AuNP) ont été largement adoptées pour un dépistage rapide en raison de la propriété optique des AuNP qui dépend de la taille et de la distance, avec le premier rapport de Mirkin et de ses collaborateurs . Le principe des tests semi-quantitatifs à flux latéral est que la couleur rouge des AuNPs peut être visualisée à l’œil nu à partir de la combinaison antigène-anticorps en quelques minutes . Plusieurs kits de test commerciaux pour la détection de l’abus d’héroïne sont disponibles, notamment ceux des sociétés NovaBios et Wondfo. Cependant, la plupart des kits de dépistage de l’héroïne ne mesurent que la morphine mais pas le 6-MAM, car il est difficile de faire la distinction entre le 6-MAM et la morphine. La morphine pourrait être métabolisée à partir d’autres drogues ou pourrait avoir été prescrite. Le 6-MAM est uniquement traçable à l’héroïne.

Les échantillons comprennent le sang, le plasma, l’urine, les cheveux, les fluides oraux ainsi que dans l’haleine, la sueur, le lait maternel, les dents, etc… . Les échantillons les plus couramment utilisés pour le dépistage de l’héroïne illicite sont le sang, l’urine et les fluides oraux. Parmi ceux-ci, le test sanguin est le plus précis et le plus fiable, mais il est également invasif. L’analyse d’urine est la plus pratique et la plus utilisée pour le dépistage de l’abus de drogues. Les fluides oraux sont de plus en plus utilisés pour les tests au point de service, car ils sont faciles à recueillir en public. Cependant, les fluides oraux sont très visqueux et présentent de faibles concentrations de la cible ; c’est pourquoi la plupart des tests utilisent l’urine pour le dépistage du 6-MAM. Le développement de tous les tests de fluides oraux sera confronté au même problème de collecte d’échantillons et d’amélioration de la sensibilité. Une étude précédente a montré que le 6-MAM est fréquemment détecté dans le fluide oral. La norme de détection des LFS pour le 6-MAM dans le fluide oral est de 4 ng ml-1 . Ici, nous avons développé un test à flux latéral pour l’héroïne dans les échantillons de fluide oral.

Nous avons exploré les AuNPs comme marqueurs d’anticorps dans un test à flux latéral pour la détection rapide et sensible de 6-MAM via un signal colorimétrique. Tout d’abord, nous avons synthétisé la 6-MAM, puis nous l’avons conjuguée à de l’albumine de sérum bovin (BSA) pour permettre de l’enrober sur une ligne T. De plus, pour surmonter les difficultés liées aux échantillons de fluides oraux, les types de membranes en nitrocellulose (NC), la formule de solution du tampon d’échantillon et le tampon adsorbant en éponge ont été choisis pour rechercher les meilleures conditions pour les LFS de fluides oraux. Enfin, le LFS 6-MAM a été validé et a montré une sensibilité et une spécificité exceptionnelles.

Expérimental

2.1. Matériaux

Les anticorps contre la 6-MAM ont été fournis par Bioventure (Shanghai). La BSA et la polyvinylpyrrolidone (PVP) ont été achetées auprès de Sigma (Barcelone, Espagne). Le Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) et STANDAPOL ES-1 (S7) ont été achetés à BASF (Allemagne). L’eau distillée (résistivité 18,2 MΩ cm-1) a été réalisée par un système d’eau ultra-pure RephiLe PURIST UV (Chine). Le système de dispersion Reel était de Doyesgo (Chine). Le spectromètre de masse Vion IMS Q-Tof était de Waters (USA). Tous les matériaux standard tels que le 6-MAM et la morphine ont été obtenus auprès des Instituts nationaux de contrôle des aliments et des médicaments (Chine). Le microscope était de Motic AE2000 (Xiamen, Chine). Tous les autres réactifs chimiques et immunologiques non spécifiés ici étaient des produits commerciaux standard de qualité analytique/réactif.

2.2. Les composants de la bandelette à flux latéral

Les LFS sont constitués d’un support en plastique, d’une bandelette adsorbante en éponge (tampon éponge), d’un tampon échantillon, d’un tampon conjugué, de membranes NC et d’un tampon absorbant. La bande d’éponge adsorbante est spécialement conçue pour le prélèvement de liquide oral et transporte rapidement le liquide oral dans le tampon d’échantillon. Le tampon d’échantillonnage contient un système tampon et quelques tensioactifs. Les conjugués anticorps-AuNP ont été pulvérisés sur le tampon conjugué pour réagir avec l’échantillon et être libérés du tampon et entrer dans la membrane NC recouverte de 6-MAM-BSA sur la ligne T et d’anticorps de chèvre anti-lapin sur la ligne C. Le tampon absorbant est un papier filtre situé à l’extrémité de la bandelette ; il maintient le flux capillaire. Il suffit de placer le LFS dans la bouche ou de l’insérer dans un gobelet d’échantillon de fluide oral. Une vue schématique du LFS est présentée dans la figure 2. Un schéma de la LFS pour la détection du 6-MAM est exposé dans la figure 3.

2.3. Synthèse du conjugué 6-monoacétylmorphine-sérum albumine bovine

Le 6-MAM a été préparé comme décrit précédemment dans des travaux de recherche . Brièvement, la morphine a d’abord été produite par hydrolyse alcaline de l’héroïne. Un groupe ester N-hydroxysuccinimide (NHS) a ensuite été ajouté à la molécule de 6-MAM pour la conjuguer aux protéines porteuses (figure 4). Le 6-MAM activé a été assuré par un spectromètre de masse Waters® Vion IMS Q-Tof. Ensuite, la synthèse a été réalisée comme décrit (figure 5) avec quelques modifications. Tout d’abord, 80 mg de BSA dans 6 ml de tampon de phosphate de potassium 50 mM (pH = 7,5) ont été laissés refroidir à 0°C. Ensuite, 20 mg de 6-MAM activé dans 1 ml de diméthylformamide (DMF) anhydre ont été ajoutés goutte à goutte à 0°C. Le mélange a été réchauffé à température ambiante et agité pendant une nuit. Le conjugué 6-MAM-BSA résultant a été dialysé contre un tampon phosphate de potassium 50 mM (pH = 7,5) avec six changements de tampon (au moins 6 h chacun à 4°C).

2.4. Préparation de conjugués nanoparticules d’or-anticorps

Les AuNPs de 20 nm ont été préparés via une méthode de réduction du citrate . Ici, 2 ml de solution HAuCl4 à 1% ont été ajoutés dans 100 ml d’eau bouillante sous agitation vigoureuse, puis 2 ml de solution de citrate de sodium à 1% ont été immédiatement ajoutés. Lorsque la solution est devenue rouge, elle a été bouillie pendant 15 minutes supplémentaires. La solution a été refroidie à température ambiante et stockée à 4°C pour une utilisation ultérieure.

Après avoir ajusté la valeur du pH de la solution d’AuNPs à 9,0 par du K2CO3 0,1 M, 30 µg d’anticorps 6-MAM ont été ajoutés dans 10 ml de solution d’AuNPs et incubés pendant 30 min. Cette opération a été suivie de 20 µl de 100,0 g l-1 de BSA pendant 15 min pour bloquer les sites réactifs. La solution a été centrifugée à 3740g pendant 15 min, et le surnageant a été re-centrifugé à 12 100g pendant 30 min supplémentaires. Tous les précipités d’or ont été mélangés et mesurés pour identifier l’absorbance maximale par spectroscopie UV-visible. Il a ensuite été stocké à 4°C pour une utilisation ultérieure.

La même méthode a été utilisée pour conjuguer les AuNPs aux anticorps IgG de lapin. Lors de la fabrication du tampon conjugué, les conjugués d’anticorps ont été dilués jusqu’à l’absorbance cinq avec un tampon (0,05 M Tris-HCl contenant 10,0 g l-1 de BSA, 0,4% de Triton X-100, 5% de tréhalose, 10% de saccharose, pH 8,2). Enfin, 500 µl de conjugués AuNPs-anticorps mélangés ont été pulvérisés sur une fibre de verre de 20 mm2, puis séchés à 37°C pendant une nuit.

2.5. Préparation de la membrane de nitrocellulose enduite

Pour fabriquer la bandelette de test à flux latéral, des antigènes 6-MAM-BSA (0,6 mg ml-1) ont été distribués sur les membranes NC comme lignes de test (ligne T). Les lignes de contrôle (ligne C) ont été recouvertes d’anticorps polyclonaux de chèvre anti-lapin (0,15 mg ml-1). Les membranes NC enduites ont été séchées à 37°C pendant la nuit. Neuf membranes NC commerciales de quatre sociétés ont été évaluées : Millipore (HF90, HF135 et HF180), GE-Whatman (FF120HP et AE100), Sartorius (CN95 et CN150) et Pall (Vivid90 et Vivid170).

2.6. Sensibilité et spécificité

La bandelette est un test compétitif, et les deux postes avaient des bandes de 6-MAM. Lorsque l’échantillon contient du 6-MAM, il se lie à l’anticorps marqué au nanogold sur le tampon conjugué. Les anticorps en excès continuent à avancer le long de la direction chromatographique en raison de l’action capillaire et se lient ensuite à l’antigène 6-MAM sur la ligne T. L’intensité du signal de la ligne T est directement liée à la concentration de 6-MAM dans l’échantillon. Une couleur plus foncée indique une concentration de 6-MAM plus faible.

Un fluide oral négatif a été prélevé chez six personnes et dopé au 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) pour la détection de la sensibilité. Dix drogues couramment consommées ont été utilisées pour vérifier la spécificité des LFS. Ces drogues étaient la morphine (MOP, 100 µg ml-1), la codéine (COD, 100 µg ml-1), le tétrahydrocannabinol (THC, 10 µg ml-1), la méthylène dioxyméthamphétamine (MDMA, 100 µg ml-1), la kétamine (KET, 100 µg ml-1), méthylamphétamine (MET, 100 µg ml-1), cocaïne (COC, 100 µg ml-1), méthadone (MTD, 100 µg ml-1), éphédrine (EPH, 100 µg ml-1) et pseudoéphédrine (PEPH, 100 µg ml-1).

Résultats et discussion

3.1. Synthèse du conjugué 6-monoacétylmorphine-sérum-albumine bovine

Les membranes de CN sont généralement d’abord revêtues d’une protéine porteuse avant la conjugaison de l’anticorps. Des lieurs sont utilisés pour maintenir la spécificité structurelle. Ici, un groupe ester NHS a d’abord été ajouté à la molécule de 6-MAM comme lieur pour la protéine porteuse. Ceci a été validé avec un spectromètre de masse Waters® Vion IMS Q-Tof. Nous avons trouvé un large pic dans les chromatogrammes de chromatographie liquide à ultra-performance (UPLC) du 6-MAM activé à 8,8 min avec un m/z de 706,27645 (figure 6) contre un m/z prédit de 706,2758. Ceci indique que le lieur a été attaché avec succès au 6-MAM. L’importance d’une synthèse précise est évidente car seule la structure est correctement établie, ce qui pourrait conduire à un appariement avec les anticorps 6-MAM.

Nous n’avons pas utilisé la dialyse par gradient de diméthylsulfoxyde car le produit est soluble et le protocole de conjugaison précédent est trop complexe. La BSA présentait plusieurs pics dans le chromatogramme UPLC (données non présentées) à cause des différents analogues. Cela a conduit à une gamme de rapports de conjugaison. Par conséquent, il y avait différents pics dans le chromatogramme UPLC correspondant aux différents rapports de conjugaison. Les résultats de la conjugaison ont pu être confirmés plus efficacement par l’appariement antigène-anticorps que par le rapport de conjugaison.

3.2. Types de sélection des membranes de nitrocellulose

Les membranes de nitrocellulose lient les protéines de manière électrostatique via les interactions du dipôle fort de l’ester nitrique avec le dipôle fort des liaisons peptidiques de la protéine. Les propriétés incluant le débit capillaire, l’intensité du signal et le bruit de fond ont été évaluées car elles peuvent influencer les performances finales du LFS. En outre, le débit est l’objet d’une attention particulière car il peut affecter la capacité d’adsorption des protéines et même la sensibilité. Le débit d’une membrane dépend des propriétés globales des structures poreuses telles que la taille des pores, la distribution de la taille des pores et la porosité. Une taille de pore plus grande entraîne une adsorption plus faible des protéines.

Nous avons comparé neuf membranes NC (tableau 1). Chaque test a été répété trois fois, et le résultat moyen a été enregistré. Les résultats du LFS ont été mesurés en 3 min, et le meilleur débit d’échantillon était inférieur à 20 s cm-1. L’intensité du signal à la ligne T devait également se situer au niveau normal. Une couleur de fond plus profonde nuisait à la précision. La membrane Millipore HF135 était le meilleur choix pour le 6-MAM après une prise en compte complète du débit de l’échantillon, de l’intensité du signal au niveau de la ligne T et de la couleur de fond.

3.3. Le tampon d’échantillon

La solution pour traiter le tampon d’échantillon est très importante pour le test car elle a servi de système tampon de réaction lorsque les échantillons de fluide oral réhydratent le tampon. La solution comprend généralement un système tampon avec une force ionique et une valeur de pH appropriées ; certains matériaux de blocage et tensioactifs peuvent accélérer le débit du fluide oral sur la membrane. Le tampon d’échantillonnage traite les complexités des effets de matrice du fluide oral et le rend compatible avec la membrane NC. De plus, le système tampon assure la libération des analytes et stabilise le débit car le fluide oral est trop visqueux.

Quatre formules différentes ont été considérées. Les formules de solution sont données dans le tableau 2. Les résultats indiquent que le système tampon 4 avec le tensioactif STANDAPOL ES-1 (S7) a donné les meilleures performances à un débit d’échantillon de 17 s cm-1, avec une intensité de signal normale et un fond blanc. Le tensioactif S7 est un tensioactif anionique fort qui offre une capacité de lavage plus forte que S17 et S9.

3.4. Collecte des fluides oraux

Les fluides oraux sont plus difficiles à collecter que l’urine en raison de leur viscosité élevée. Il existe de nombreux types de dispositifs de collecte des fluides oraux : cotons-tiges, éponges, tubes et gobelets en plastique. Certaines méthodes stimulent les fluides oraux par le biais de vinaigre, de bains de bouche, de pastilles, etc. Cependant, cette stimulation peut modifier la concentration des analytes dans le fluide oral et est plus compliquée et plus longue. Nous avons finalement recueilli le fluide oral directement dans la bouche par un adsorbant en éponge (ESSENTRA, UK), qui est un mélange de fibres polymères avec une taille de pores appropriée.

Deux types d’adsorbants en éponge (K1 et K2) ont été conçus sur mesure, et les structures des deux tampons en éponge sont présentées dans la figure 7. K2 était beaucoup plus lâche et régulier par rapport à K1. Les deux ont été évalués en testant la performance de manipulation des fluides, notamment en laissant tomber de l’eau sur le tampon éponge, en mettant le LFS final dans le tampon négatif de phosphate de potassium (pH = 7,0) et en mettant le LFS final dans la bouche. L’éponge K2 avait un débit d’échantillon deux fois plus rapide (20 s cm-1 en moyenne) que l’éponge K1 pour l’eau, le tampon PBS ou les fluides oraux réels. C’est un point très important pour les tests de fluides oraux. En conclusion, K2 a été choisi pour ses performances distinguées dans le traitement des échantillons de fluides oraux.

3,5. Sensibilité et spécificité

Les petites molécules sont généralement détectées via un test compétitif dans les LFS. Ici, il n’y a aucun signal (ligne rouge) dans la ligne T. Cela représente une concentration de 6-MAM dans l’échantillon qui est supérieure à la valeur seuil. La sensibilité de l’analyse du liquide oral devrait être beaucoup plus élevée que celle de l’analyse d’urine en raison de la faible concentration de métabolites de drogues dans le liquide oral. Ici, nous avons réussi à réaliser un LFS qualitatif pour le 6-MAM avec une sensibilité de 4 ng ml-1, ce qui répond aux exigences des limites de détection générales des liquides oraux. Les résultats sont présentés dans la figure 8. En outre, la figure 9 montre la spécificité par rapport aux médicaments les plus couramment consommés. Le LFS 6-MAM était spécifique au 6-MAM sans réaction croisée notamment avec la morphine ou la codéine.

Conclusion

Le 6-MAM est le métabolite spécifique de l’héroïne. Nous rapportons ici un AFL pour la 6-MAM via un conjugué spécial apparié à un anticorps spécifique. Nous avons fabriqué un conjugué qui relie la 6-MAM à la protéine porteuse via un groupe ester NHS en position C3 (figure 10). Ici, l’anticorps a identifié le groupe acétyle de la 6-MAM. Il s’agit d’une condition préalable à la spécificité de la 6-MAM. Enfin, nous avons réalisé un test LFS très sensible, sans réaction croisée avec 10 médicaments couramment utilisés, dont la morphine et la codéine. Nous avons identifié les membranes NC, le tampon d’échantillonnage, la taille des pores et l’adsorbant éponge appropriés pour réaliser un test qui utilise les fluides oraux au point de soins.

Avec les avantages ci-dessus, le 6-MAM LFS pour l’échantillon de fluide oral pourrait être appliqué à la fois à la recherche et aux utilisations industrielles. Il pourrait aider la police à économiser de la main-d’œuvre et du temps/des coûts dans le dépistage préliminaire. Les fluides oraux sont pratiques et moins invasifs et conviennent aux contrôles routiers. En conclusion, un fluide oral LFS pour l’abus d’héroïne visant la 6-MAM est un produit prometteur pour lutter contre la conduite sous l’emprise de la drogue.

Ethique

L’utilisation des échantillons d’héroïne pour la recherche a été supervisée par le troisième institut de recherche du ministère chinois de la Sécurité publique. Tous les auteurs déclarent être en conformité avec les normes éthiques.

Accessibilité des données

Les données sont déposées dans le dépôt numérique Dryad : https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Contributions des auteurs

L.Z. a conçu cette étude, et X.H et J.Z. ont aidé à réaliser les expériences des figures 4 et 5. F.C. et Y.Z. ont réalisé les études de la figure 6. J.L. a analysé les données et rédigé l’article. Tous les auteurs ont donné leur approbation finale pour la publication.

Intérêts concurrents

Nous déclarons ne pas avoir d’intérêts concurrents.

Financement

Aucun financement n’a été reçu pour cet article.

Disclaimer

Toutes les opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimés ici sont ceux des auteurs.

Notes de bas de page

Cet article a été édité par la Royal Society of Chemistry, y compris la commande, le processus d’examen par les pairs et les aspects éditoriaux jusqu’au point d’acceptation.