Validation d’anticorps

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Pas tous les anticorps sont valables pour chaque expérience et condition, ils doivent être validés pour l’application et l’espèce spécifiques. Actuellement, il n’existe aucun moyen standard de « validation des anticorps », ce qui peut avoir un impact considérable sur la reproductibilité et la fiabilité des expériences. Les revues et les organismes subventionnaires ont pris des mesures pour combler cette lacune. Nombre d’entre eux exigent désormais que l’on indique explicitement comment on va valider un anticorps pour une utilisation spécifique. Malheureusement, il n’existe pas de critères universellement acceptés pour la validation des anticorps. Il appartient donc à chaque chercheur de valider chaque anticorps pour l’application prévue.

Validation de base

Les méthodes standard de validation des anticorps comprennent le western blot, l’ELISA, la cytométrie de flux et l’IHC. La plupart des chercheurs sont à l’aise avec ces méthodes éprouvées. Le processus de validation peut prendre beaucoup de temps car le chercheur ou le fabricant doit valider l’anticorps pour chaque application. Cette difficulté est aggravée par le fait que les conditions de chaque essai sont différentes. Par exemple, un western blot dépend de la dénaturation des protéines. Ainsi, un anticorps validé pour un western blot peut fonctionner correctement dans des conditions de dénaturation mais peut ne pas reconnaître les antigènes dans leur conformation native (c’est-à-dire ELISA).1 De même, un anticorps validé pour l’affinité des protéines natives pourrait ne pas lier le même antigène après dénaturation ou fixation.

Les méthodes ci-dessus jouent des rôles nécessaires dans la validation des anticorps. Cependant, nous ne pouvons pas nous fier uniquement à ces méthodes, car elles ne représentent pas les applications en constante expansion. Le niveau de confiance des anticorps validés peut être augmenté en incluant d’autres techniques de validation.

Anciennes techniques, nouvelles utilisations

Pour remédier aux lacunes de la validation de base des anticorps, un groupe de scientifiques s’est récemment réuni pour « proposer un ensemble de directives standard pour la validation des anticorps ».2 Ils suggèrent qu’en plus des méthodes de validation de base des anticorps, les chercheurs commencent à s’appuyer sur des piliers conceptuels. Ceux-ci comprennent les stratégies génétiques, les stratégies d’anticorps indépendants et l’expression de protéines marquées.2

• Stratégies génétiques : CRISPR-Cas9 et plus

  Les stratégies génétiques consistent en des techniques telles queCRISPR-Cas9, RNAi, et siRNA knockdown, utilisées conjointement avec un test de détection de protéines. Ces méthodes détectent toute liaison non spécifique par l’anticorps en question après avoir éliminé ou abaissé le gène approprié. Si l’anticorps est spécifique, alors aucun signal ou un signal réduit de l’anticorps devrait être détecté dans les lignées cellulaires knocked out ou down, respectivement.

• Approche de l’anticorps indépendant

  L’utilisation d’anticorps indépendants est une autre méthode qui pourrait détecter une liaison non spécifique. L’approche par anticorps indépendants emploie deux anticorps différents (indépendants) qui se lient au même antigène mais à des épitopes différents. Par conséquent, les deux anticorps devraient présenter le même schéma de détection et aucune liaison hors cible.2 Cette technique nécessite de multiples échantillons à tester pour contrôler l’expression variable de la protéine cible, ce qui pourrait devenir coûteux et long.2 En outre, la technique de validation repose sur la disponibilité de multiples anticorps qui reconnaissent différents épitopes sur la même protéine cible. GenScript offre le binning d’épitopes dans les services de mAbMonoExpress™ qui incluent des « anticorps indépendants » pour les antigènes protéiques.

• Expression de protéines marquées

  Analyser la détection de protéines cibles marquées peut également fournir un moyen de mesurer la liaison non spécifique des anticorps. Dans cette méthode, les protéines cibles sont modifiées avec soit une étiquette d’affinité (c’est-à-dire FLAG), soit une protéine fluorescente (c’est-à-dire GFP). Ensuite, comme dans le cas de l’approche par anticorps indépendants, le schéma de détection de l’anticorps en cours de validation est comparé à celui de l’anticorps spécifique de l’étiquette. Bien que simple, un problème avec cette méthode est de s’assurer que les protéines marquées sont exprimées à des niveaux endogènes, car « la surexpression pourrait masquer la détection des événements de liaison hors cible ».2

  Anticorps recombinants comme alternative aux anticorps monoclonaux?

  Un appel à l’action récent concernant la validation des anticorps a suggéré que les chercheurs utilisent uniquement des anticorps recombinants, plutôt que des anticorps polyclonaux ou même monoclonaux. Les anticorps monoclonaux sont produits à partir de lignées cellulaires d’hybridomes. Malheureusement, les lignées cellulaires d’hybridomes peuvent mourir, perdre leurs gènes codant pour les anticorps ou ne pas se développer lorsqu’elles sont retirées du stockage congelé.3 De plus, les anticorps monoclonaux produits par les hybridomes peuvent se lier à plus d’une cible. Par conséquent, la détermination de la séquence de l’anticorps codé par l’hybridome et la production de l’anticorps par recombinaison permettent de surmonter ces problèmes. En outre, en raison de la séquence définie, les anticorps recombinants peuvent fournir une autre couche de validation par rapport à l’utilisation des techniques ci-dessus seules.3

  Ces méthodes de validation supplémentaires proposent de « fournir la preuve qu’un anticorps se lie à sa cible, et dans la plupart des cas, elles devraient également permettre d’évaluer la réactivité croisée potentielle dans les conditions testées ».2 Cependant, les anciennes et les nouvelles stratégies devront probablement être réalisées en combinaison pour valider correctement l’anticorps.

Choisir la méthode de validation d’anticorps appropriée

Avec toutes ces questions autour des anticorps, comment choisir la méthode appropriée ?

D’abord, vous devez décider dans quel essai vous utiliserez l’anticorps. Par exemple, la méthode CRISPR-Cas9 n’implique pas de modification de la protéine cible et valide l’absence de réactivité croisée de l’anticorps avec d’autres protéines. Vous pouvez donc utiliser cette technique pour valider des anticorps pour une grande variété de tests, notamment le western blot, l’IHC, l’immunocytochimie (ICC), la cytométrie de flux, l’ELISA, l’immunoprécipitation (IP), l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et les tests protéiques en phase inverse2. Cependant, en raison des difficultés liées à l’expression d’une protéine modifiée, la validation d’un anticorps à l’aide de l’expression d’une protéine marquée est suggérée uniquement pour les western blots, l’IHC, l’ICC et la cytométrie en flux.

Deuxièmement, le chercheur doit être conscient des limites d’échantillon de ces méthodes de validation. Par exemple, les techniques CRISPR-Cas9/KO et d’expression de protéines marquées ne peuvent pas être utilisées pour valider des anticorps dans des échantillons de tissus humains et de fluides corporels, comme le plasma et le sérum2. Cela est dû au fait que vous ne pouvez pas effectuer de manipulation génétique chez les humains, contrairement aux lignées cellulaires.

Enfin, quel que soit l’anticorps et la méthode de validation respective utilisés par le fournisseur d’anticorps, le chercheur doit effectuer au moins une stratégie de validation dans son application particulière ou son contexte d’échantillon.2

Valider chaque anticorps pour votre application spécifique et votre espèce est essentiel pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Ces informations vous aideront à orienter votre décision quant aux méthodes appropriées à utiliser dans votre laboratoire. Pour plus d’aide avec la validation des anticorps ou d’autres applications, visitez les Ressources Techniques des Anticorps de GenScript.

Adapté du contenu créé par BitesizeBio au nom de GenScript.