Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Úvod

Sérové albuminy jsou bílkoviny běžně používané v biodiagnostice a jako model ve výzkumu biologických rozhraní (Rosi a Mirkin, 2005; Singh a kol., 2005; Arcot a kol., 2015). Mezi nimi je hovězí sérový albumin (BSA) nejlevnějším a široce používaným proteinem jako blokátor v testech ELISA (Maingonnat et al., 1999). V papírové diagnostice BSA (Huang et al., 2018) selektivně zvyšuje hydrofobicitu papíru, aby se snížením absorpce kapaliny zlepšil průtok biologických tekutin a eluce. BSA chrání a zvyšuje životnost funkčních biomolekul vysušených na papíře. Funkčnost a životnost imunoglobinu G a imunoglobinu M sušených na povrchu ošetřeném BSA se může zvýšit až o řád (van Remoortere et al., 2001). BSA také zabraňuje nespecifické adsorpci proteinů analytů pro kvantitativní analýzu.

Ve více článcích bylo obsáhle referováno o jevu sorpce molekul BSA na různých rozhraních, jako je zlato (Dennison et al., 2017), slída (Fitzpatrick et al., 1992), křemík (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017) a celulóza (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). Konformace adsorbované molekuly BSA a topologie vytvořené vrstvy jsou silně ovlivněny pH, iontovou silou a teplotou. Molekuly BSA si v rozmezí pH 4,0 až 8,0 zachovávají svou nativní strukturu. Pod pH 4,0 a nad 8,0 mění molekuly BSA svou skládací konformaci, která se liší od jejich nativní struktury (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). Izoelektrický bod BSA je při pH 4,5. Při tomto pH se čistý povrchový náboj stává nulovým a molekuly BSA agregují. Zvyšující se pH zvyšuje náboj BSA a dominantní elektrostatické odpuzování stabilizuje molekuly BSA a zabraňuje agregaci (Li et al., 2008).

Přestože patří mezi nejstudovanější proteiny, zůstává mnoho otázek ohledně vlivu pH a iontové síly na konformaci BSA při adsorpci. V této souvislosti postrádá pojem pokrytí povrchu, definovaný výhradně pomocí povrchové frakce nebo hmotnostní hustoty, jasnost. Je třeba lépe porozumět proměnným, které definují rozhraní mezi pevnou a kapalnou fází BSA, aby bylo možné navrhnout robustní biodiagnostická zařízení.

Molekuly hovězího sérového albuminu se adsorbují na rozhraní a vytvářejí vrstvu o tloušťce v nanometrovém měřítku. Několik charakterizačních metod, jako je odrazivost (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), elipsometr, mikroskop atomárních sil (AFM), povrchová plazmonová rezonance (SPR) a křemenná krystalová mikrobalance s rozptylem (QCM-D), může měřit tloušťku adsorbované proteinové vrstvy v požadovaném nanometrovém měřítku. QCM-D může zejména kineticky monitorovat proces sorpce biomolekul měřením hmotnosti adsorbovaného proteinu na rozhraní v nanogramech (Kristensen a kol., 2013; Luan a kol., 2017). QCM-D umožňuje kontrolu teploty, iontové síly a pH prostředí. Disipační režim QCM odhaluje tuhost adsorbovaných proteinových vrstev.

V této studii je popsáno reverzibilní chování molekul BSA adsorbovaných na rozhraní zlata a soli reagující na pH. Adsorbovaná vrstva BSA se chová jako pH citlivá houba, kde se molekuly vody adsorbují a desorbují v závislosti na okolním pH v rozmezí 4-8. Tato práce sleduje a kvantifikuje jev sorpce vody v houbovité vrstvě BSA a objasňuje mechanismy, které se na něm podílejí při různém pH a iontové síle. Naším cílem je popsat pokrytí BSA na rozhraní pevné látky a kapaliny z hlediska počtu molekul a hmotnosti/tloušťky vrstvy. To má objasnit koncept pokrytí povrchu biomolekulami a objasnit dynamické chování adsorbovaných molekul BSA v kontextu biodiagnostiky.

Materiály a experimenty

Materiály

Lyofilizovaný prášek hovězího sérového albuminu (97 %) a sůl chloridu sodného (NaCl) (99,5 %) byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Austrálie). Kyselina chlorovodíková (HCl) a hydroxid sodný (NaOH) byly zakoupeny od společnosti Merck Ltd. Všechny chemikálie jsou analytické kvality a byly použity bez jakéhokoli čištění.

Měření QCM-D

Křemenná krystalová mikrobalance s rozptylovými měřeními byla provedena na přístroji E4-QCM-D od společnosti Biolin Scientific Ltd. Měření byla provedena na přístroji E4-QCM-D od společnosti Biolin Scientific Ltd., který je určen pro měření rozptylu. Zlatem potažené křemenné krystalové senzory byly použity po čištění v roztoku H2O2:NH3:H2O (1:5:5) po dobu 15 min a následném čištění UV-Ozonem po dobu 10 min.

Zlaté senzory byly umístěny v modulech s kapalnými buňkami. Ve fyziologickém roztoku (0,9% NaCl) byl rozpuštěn 1 mg/ml BSA a pH roztoku bylo nastaveno na hodnoty pH 7,0 a 4,5. V případě, že byl roztok rozpuštěn v roztoku BSA, byl roztok rozpuštěn v roztoku BSA. Odděleně bylo pH fyziologického roztoku nastaveno na 7,0 a 4,5. Připravené roztoky procházely moduly kapalných buněk pomocí peristaltického čerpadla. Současně byly sledovány změny rezonanční frekvence (F) a rozptylu (D) křemenného senzoru vzhledem k základní frekvenci 5 MHz a šesti různým lichým overtonům (1, 3, 5, 7, 9 a 13).

Nejprve byl do kapalinové buňky napumpován fyziologický roztok a nechal se vyrovnat, aby se vytvořila stabilní základní linie. Poté byla cela napuštěna BSA ve fyziologickém roztoku a molekuly BSA se mohly adsorbovat na rozhraní zlata. Poté byl napumpován fyziologický roztok, aby se odstranily všechny nepřichycené molekuly BSA. Cykly proplachování solnými roztoky o různém pH a vodou pak probíhaly následovně:

Získané změny rezonanční frekvence ΔF a rozptylu ΔD byly fitovány Sauerbreyovým modelem pomocí softwaru Dfind.

Měření DLS

Dynamický rozptyl světla (DLS) na BSA dispergovaném ve fyziologickém roztoku při různých pH (4,5 a 7,0) byl měřen na analyzátoru velikosti částic DLS (Brookhaven Nanobrook Omni). Byl použit zdroj 40 mW (640 nm) teplotně řízeného červeného polovodičového laseru. Měření byla provedena třikrát a zprůměrována. Všechna měření byla prováděna při pokojové teplotě (22 °C).

Měření kontaktního úhlu

Kontaktní úhel na zlatě a BSA adsorbované při různém pH na rozhraní zlata byl měřen pomocí sestavy OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Německo. Měření byla prováděna přímo na povrchu senzoru, který byl po měření vyjmut ze sestavy QCM. Všechna měření se prováděla při pokojové teplotě (22 °C). Na povrchu senzoru bylo provedeno minimálně pět měření kontaktního úhlu, která byla zprůměrována.

Mikroskop atomárních sil (AFM)

Měření mikroskopem atomárních sil byla provedena v poklepovém režimu pomocí AFM JPK Nanowizard III. Konzoly (AC160TS-R3) vybrané pro zobrazování měly jmenovitou frekvenci 300 kHz a konstantu pružiny 26 N/m. Zobrazování bylo prováděno na holém rozhraní zlata a na adsorbované vrstvě BSA při pH 4,5 na rozhraní zlata. Snímky byly pořízeny přímo na povrchu senzoru, který byl po měření vyjmut ze sestavy QCM. Všechna měření byla provedena při pokojové teplotě (22 °C).

Výsledky

Pomocí QCM-D byl studován reverzibilní jev sorpce vody reagující na pH molekul BSA adsorbovaných na rozhraní pevná látka-kapalina s cykly oplachování fyziologickým roztokem o pH 7,0 a 4,5. V případě, že se na rozhraní BSA adsorbují molekuly BSA adsorbované na rozhraní pevná látka-kapalina, je možné, že se na rozhraní BSA adsorbuje voda. Jako pevné rozhraní bylo zvoleno zlato, protože jeho hydrofobnost usměrňuje adsorpci BSA (Lori a Hanawa, 2004; Phan a kol., 2015; Ozboyaci a kol., 2016). Vrstvy BSA adsorbované při různých hodnotách pH se proplachují střídavými cykly solných roztoků o pH 4,5 a 7,0. V případě, že jsou vrstvy BSA adsorbovány při různých hodnotách pH, jsou proplachovány střídavými cykly solných roztoků. Kromě toho bylo provedeno oplachování čistou vodou Milli-Q, aby se vyhodnotil vliv iontové síly na adsorbovanou vrstvu BSA.

Obrázek 1 (nahoře) ukazuje změnu frekvence (F5 a F7) pro molekuly BSA adsorbované při pH 7,0 z roztoku BSA/solného roztoku s následným oplachováním původním solným roztokem (pH 7). Další cyklus oplachování byl proveden fyziologickým roztokem o pH 4,5. Poté následují střídavé cykly s fyziologickými roztoky o pH 4,5 a 7.

Na obrázku 1 byl po počáteční stabilní základní linii pozorován náhlý pokles F, který naznačuje adsorpci molekul BSA na rozhraní zlato-kapalina. F se snížila až na hodnotu ΔF = -35,5 a poté se stabilizovala. Po opláchnutí fyziologickým roztokem (pH 7) se F zvýšila z ΔF = -35,5 na ΔF = -34,0, což ukazuje na odstranění neadsorbovaných molekul BSA z povrchu. Po opláchnutí fyziologickým roztokem (pH 4,5) se F dále zvýšilo na ΔF = -30,0, což ukazuje další úbytek hmoty z povrchu senzoru. Pozdější cykly oplachování fyziologickým roztokem (pH 7,0) překvapivě snížily F na ΔF = -34,0, což znamená nárůst hmotnosti na povrchu senzoru v důsledku absorpce molekul vody ve vrstvě BSA. Následné cykly oplachování fyziologickým roztokem sledují stejnou cyklickou změnu hmotnosti na rozhraní zlata.

V druhém experimentu, podobně jako v prvním experimentu, po adsorpci molekul BSA při pH 4,5 následovaly cykly oplachování fyziologickým roztokem při různých pH (obr. 1: dole). Adsorbované molekuly BSA odpovídají poklesu F na ΔF = -38,5. Oplachování fyziologickým roztokem (pH 4,5) odstraní neadsorbované molekuly BSA (ΔF = -38,0).

Následující oplachování fyziologickým roztokem (pH 7,0) dále zvyšuje hmotnost vrstvy na povrchu zlata, což odpovídá poklesu F na ΔF = -43. Při oplachování fyziologickým roztokem (pH 7,0) se hmotnost vrstvy na povrchu zlata dále zvyšuje. Zvýšení hmotnosti je způsobeno absorpcí molekul vody ve vrstvě BSA. Pozdější oplachování fyziologickým roztokem (pH 4,5) desorbuje molekuly vody a vrací hodnotu F na ΔF = -37. Každý cyklus oplachování adsorbuje a desorbuje stejné množství molekul vody.

V témže experimentu byl studován vliv iontové síly na adsorbovanou vrstvu BSA oplachováním vrstvy čistou vodou. Obrázek 1 ukazuje adsorpci BSA při pH 7,0 a 4,5 s následnými cykly oplachování fyziologickým roztokem o různém pH a čistou vodou Milli-Q.

V obou případech oplachování vodou zvyšuje hodnotu v ΔF = -29,2 (BSA adsorbovaná při pH 4,5) a -26,5 (BSA adsorbovaná při pH 7,0). To naznačuje, že oplachování vodou dále snižuje hmotnost, což odpovídá další desorpci molekul vody z rozhraní. Každý cyklus oplachování udržuje stejné chování změny hmotnosti, která je způsobena sorpcí vody ve vrstvě BSA.

Zajímavé je, že ve všech experimentech střídavé cykly oplachování solným roztokem při pH 4,5 a 7,0 vykazují reverzibilní sorpci molekul vody ve vrstvě adsorbované BSA. Oplachování vrstvy BSA fyziologickým roztokem při pH 7,0 adsorbuje molekuly vody ve struktuře vrstvy BSA, což zvyšuje hmotnost rozhraní pevná látka-kapalina. Naproti tomu oplachování vrstvy BSA fyziologickým roztokem o pH 4,5 desorbuje molekuly vody z vrstvy BSA, což snižuje hmotnost rozhraní. Naměřená plně reverzibilní sorpce vody naznačuje, že molekuly BSA se během oplachování nedesorbují a jejich povrchové pokrytí zůstává stejné; mění se pouze počet molekul vody v mezifázi.

Jev sorpce vody při oplachování solným roztokem (při různém pH) nastává pouze díky adsorbované vrstvě BSA a je potvrzen samostatným experimentem s oplachováním solným roztokem na holém zlatém senzoru (Supplementary Material S1). Stabilní základní frekvence na holém zlatém senzoru je udržována solným roztokem (při pH 4,5). Poté bylo rozhraní zlata opláchnuto alternativním cyklem oplachování solným roztokem o pH 7,0 a 4,5 (Doplňkový materiál S1). Výsledky jasně ukazují, že alternativní oplachování fyziologickým roztokem o různém pH nemá na frekvenci zlatého senzoru žádný vliv. Proto pouze adsorbovaná vrstva BSA na zlatě vykazuje změnu frekvence na cyklech oplachování fyziologickým roztokem při různých hodnotách pH.

Adsorbovaná hmotnost, povrchové pokrytí a tloušťka adsorbované vrstvy BSA jsou extrahovány fitováním Sauerbreyova modelu na QCM data. Model se používá pro fitování tuhé vrstvy, kde je hodnota disipace menší než 2, jak bylo pozorováno ve všech našich experimentech (Doplňkový materiál S2). Sauerbreyova rovnice je dána vztahem Δm=-CΔfn, kde C = 17,7 ng/Hz.cm2 je konstanta pro 5 MHz křemenný krystal potažený zlatem, n je převýšení, Δm je adsorbovaná hmotnost a Δf je změna frekvence.

Molekuly BSA se adsorbovaly až do hmotnostního pokrytí 6,3 mg/m2 (tloušťka 5,6 nm) při pH 7,0 (obr. 2A). Oplachování předem adsorbované vrstvy BSA fyziologickým roztokem (pH 4,5) snížilo hmotnostní pokrytí na 5,6 mg/m2 a její tloušťku na 4,9 nm (tabulka 1), což je způsobeno uvolněním molekul vody ze struktury adsorbované vrstvy BSA. Dalším oplachováním fyziologickým roztokem (o pH 7,0) se molekuly vody znovu adsorbují ve stejném množství. Rozdíl v hmotnostní změně je Δm = 0,7 mg/m2.

Podobně jako na obrázku 2B, oplachování předem adsorbované vrstvy BSA při pH 4,5 fyziologickým roztokem (při pH 7,0) zvyšuje adsorbovanou hmotnost z 6,4 mg/m2 na 7,4 mg/m2 a tloušťku z 6,2 na 6,9 nm; to je způsobeno absorpcí molekul vody ve vrstvě BSA. Cyklus oplachování fyziologickým roztokem při různých hodnotách pH udržel rozdíl změny hmotnosti Δm = 1,0 mg/m2, což je 1,4krát více než změna hmotnosti při pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Průměrný počet molekul vody adsorbovaných/desorbovaných ve vrstvě BSA během cyklu oplachování fyziologickým roztokem se vypočítá z rozdílu adsorbované hmotnosti při různých pH (doplňkový materiál S3). Vrstva BSA adsorbovaná při pH 4,5 adsorbuje/desorbuje 3,3 × 1019 molekul vody během výplachových cyklů, což představuje 570 molekul vody/molekulu BSA (tabulka 1). Vrstva BSA adsorbovaná při pH 7,0 však během reverzibilního cyklu oplachování fyziologickým roztokem adsorbuje/dezorbuje 2,3 × 1019 molekul vody, tj. 450 molekul vody/molekulu BSA.

Měření dynamického rozptylu světla (DLS) objasňují agregovaný a neagregovaný stav BSA ve fyziologickém roztoku při pH 4,5 a pH 7,0 (obrázek 3). Při pH 4,5 DLS odhaluje, že molekuly BSA agregují a vykazují vícenásobné distribuce velikosti: 5 nm, 10 nm, 20 nm a 50 nm. Při pH 7,0 však molekuly BSA v důsledku elektrostatického odpuzování neagregují a mají distribuci velikosti 5 a 10 nm. Velikost 5 a 10 nm hydratované BSA je srovnatelná s velikostí a tvarem jednotlivých molekul BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright a Thompson, 1975).

Snímky z mikroskopu atomárních sil potvrzují adsorpci molekuly BSA na rozhraní zlata (Obrázek 4). Tyto snímky ukazují rozdíly v morfologii povrchu holého zlata (obrázky 4a,b) a BSA adsorbované na rozhraní zlata při pH 4,5 (obrázky 4c,d). Při porovnání zvětšených snímků holého zlata (obrázek 4b) a povrchu absorbovaného BSA (obrázek 4d) jsou patrné rozdíly mezi povrchy. Přestože oba povrchy jsou tvořeny částicemi, jejich definice, a tedy i zobrazovaný materiál, se liší. Částice holého povrchu zlata jsou více definované (např. ostřejší hranice mezi tvary), což naznačuje tvrdší materiál ve srovnání s povrchem pokrytým BSA. Zlato potažené BSA vykazuje přítomnost dalších agregátů molekul BSA. Zvětšený AFM snímek zlata potaženého BSA (Obrázek 4d) ukazuje, že boční rozměr agregovaných molekul BSA se pohybuje mezi 30 a 100 nm s výškou v rozmezí 5-15 nm.

K objasnění smáčivosti byl změřen kontaktní úhel vytvořený kapkami vody na dvou površích: zlatě a BSA adsorbované na zlatě (Obrázek 5). Zlatý senzor je hydrofilní s kontaktním úhlem 66°. Vrstva BSA adsorbovaná při pH 4,5 se však stává hydrofilnější, protože kontaktní úhel vody se snížil na 60°, který se dále snížil na 55° u vrstvy BSA adsorbované při pH 7,0. V případě vrstvy BSA adsorbované při pH 7,0 je úhel hydrofilní. Podobné pozorování bylo zaznamenáno u vrstev BSA adsorbovaných na křemíkovém povrchu, když se kontaktní úhel vody snížil z 57° (při pH 4,5) na 54° (při pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). Změna kontaktního úhlu a tloušťky vrstvy pro BSA adsorbované při různých pH naznačuje strukturní a topografické rozdíly během procesu adsorpce na rozhraní zlata.

Diskuse

Izoelektrický bod BSA je mezi pH 4,5-4,8; je to pH, při kterém se čistý náboj molekuly stává nulovým. V blízkosti izoelektrického bodu mají molekuly BSA menší mezimolekulové elektrostatické odpuzování. Vysoká iontová síla fyziologického roztoku (0,15 M) také hraje roli při stínění nábojů a brání elektrostatickým interakcím. Proto se molekuly BSA v suspenzi BSA a solného roztoku shlukují. Měření DLS (obr. 3A) potvrzují přítomnost agregátů BSA o velikosti až 60 nm v suspenzi BSA/solný roztok při pH 4,5.

Při adsorpci BSA (při pH 4,5) na rozhraní zlata se neočekává žádná elektrostatická přitažlivost BSA vůči rozhraní zlata. Slabý kladný náboj globulárního proteinu BSA však může poskytnout dostatečný drift pro adsorpci na rozhraní (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). V mnoha článcích bylo dříve uvedeno, že adsorpce BSA a podobných proteinů v blízkosti izoelektrického bodu je poháněna hydrofobními interakcemi, které převažují nad elektrostatickými interakcemi (Uyen a kol., 1990; Tilton a kol., 1991; Figueira a Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran a kol., 2009; Rabe a kol., 2011; Huang a kol., 2017; Xu a kol., 2018; Attwood a kol., 2019). Měření kontaktního úhlu (obr. 5) ukazují, že rozhraní holého zlata je méně hydrofobní a albumin se váže se zlatem prostřednictvím hydrofobních interakcí (Norde a Giacomelli, 2000; Figueira a Jones, 2008). Vzhledem k tomu, že odpuzování mezi molekulami BSA je odstíněno, hydratované molekuly BSA se adsorbují ve velkém množství (6,4 mg/m2) jako agregáty a s více kontaktními body na rozhraní zlata (obr. 6A). Obraz AFM (obr. 4c,d) potvrzuje adsorpci a agregaci molekul BSA na rozhraní zlata. AFM snímky ukazují, že boční rozměr agregátů se pohybuje mezi 30 a 100 nm, přičemž výška je rozložena mezi 5 a 15 nm. To potvrzuje, že molekuly BSA jsou adsorbovány jako kombinace stojaté i ploché konformace.

Při pH 7,0 jsou molekuly BSA negativně nabité. To vytváří elektrostatickou repulzi mezi molekulami BSA, která brání aglomeraci BSA v roztoku. Měření DLS ukazují distribuci neagregovaných molekul BSA o velikosti 5 a 10 nm (obrázek 3B). Tyto velikosti jsou srovnatelné s rozměry jednotlivých molekul BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright a Thompson, 1975). Při adsorpci BSA na zlato vzniká na rozhraní vrstva BSA kombinací elektrostatického odpuzování a hydrofobních interakcí. Silné laterální mezimolekulové odpuzování mezi adsorbovanými molekulami BSA snižuje adsorpční kapacitu BSA (5,6 mg/m2) na rozhraní. Proto se molekuly BSA adsorbují jako jednotlivé molekuly (nikoliv agregáty) a vytvářejí na rozhraní zlata monovrstvu (obrázek 6A).

V experimentech QCM-D (obrázek 1) se na rozhraní adsorbují předem hydratované molekuly BSA. Při alternativním oplachování fyziologickým roztokem o různém pH vrstva BSA dále adsorbuje/desorbuje molekuly vody. BSA adsorbovaná při pH 4,5 zachytí a uvolní více molekul vody (1,0 mg/m2) ve srovnání s molekulami BSA adsorbovanými při pH 7,0 (0,7 mg/m2). Důvodem je větší množství BSA adsorbované při pH 4,5 (6,4 mg/m2) než při pH 7,0 (5,6 mg/m2).

Vypočtená suchá hmotnost (nehydratovaná) molekul BSA adsorbovaných pro úplné pokrytí povrchu zlatého senzoru je přibližně 2 mg/m2 (doplňkový materiál S3). Vypočtená suchá hmotnost je srovnatelná s literárními údaji (Jachimska et al., 2016). Když se suchá molekula BSA hydratuje, její hydrofilní skupiny se rychle vážou s vodou. Vazba je způsobena dipolární strukturou vody, která interaguje s polárními skupinami v BSA. V hydratované BSA jsou některé molekuly vody vázány pevně, zatímco jiné molekuly vody jsou vázány volně nebo jsou jednoduše zachyceny mezi smyčkovou strukturou BSA. Množství vody hydratující vrstvu BSA zvyšuje adsorbovaný hmotnostní podíl na rozhraní. V cyklu oplachování solným roztokem při různých hodnotách pH dochází k redistribuci nábojů na adsorbované vrstvě BSA. Toto přerozdělení nábojů vytváří gradient mezi adsorbovanou vrstvou BSA a objemovým roztokem. Tento gradient působí jako hnací síla, která zachycuje a uvolňuje volně vázané molekuly vody z vrstvy BSA.

Tloušťka vrstvy BSA se vyhodnocuje fitováním Sauerbreyho modelu na data QCM-D (obrázek 2). Hydratovaná vrstva BSA adsorbovaná při pH 4,5 a opláchnutá fyziologickým roztokem (pH 7,0) dává větší tloušťku 6,9 nm (obrázek 6B). Velké množství adsorbovaných molekul BSA (6,4 mg/m2) zachytí mnoho molekul vody, které vrstvu BSA nabobtnají. Opláchnutím téže vrstvy fyziologickým roztokem (pH 4,5) se tloušťka vrstvy sníží na 6,4 nm, což je způsobeno uvolněním molekul vody z vrstvy. Podobný jev je pozorován u molekul BSA adsorbovaných při pH 7,0. Tloušťka vrstvy BSA je však tenčí než u vrstvy BSA adsorbované při pH 4,5 (obrázek 6B).

Dále platí, že adsorbovaná vrstva BSA při obou hodnotách pH zůstává během cyklů oplachování fyziologickým roztokem tuhá a nevratně připojená. Během změny pH dochází pouze k sorpci molekul vody. Tuhost a nevratnost adsorbované BSA je způsobena velkou velikostí a vysokou molekulovou hmotností BSA. Molekula BSA vytváří na rozhraní zlato-kapalina množství kontaktních bodů pomocí elektrostatických a hydrofobních interakcí, které brání desorpci molekul BSA z rozhraní.

Vrstva BSA se neodděluje od rozhraní zlata ani při změnách iontové síly roztoku (oplachování deionizovanou vodou). Oplachování vodou pouze desorbuje další molekuly vody z vrstvy BSA a hmotnost na povrchu senzoru se dále snižuje (obr. 2). Změnou iontové síly hydratovaného BSA čistou vodou se z vrstvy uvolní více molekul vody. Vrstva BSA se zmenší na tloušťku 4,8 nm (při adsorpci při pH 4,5) a 4,3 nm (při adsorpci při pH 7,0), jak ukazuje obrázek 6B. Pokračující cykly oplachování fyziologickým roztokem vedou ke stejnému reverzibilnímu jevu sorpce vody.

Závěr

Hovězí sérový albumin ve fyziologickém roztoku (0,9 % NaCl) byl adsorbován na rozhraní zlato-kapalina při pH 7,0 a 4,5. Na rozhraní zlato-kapalina byl adsorbován BSA ve fyziologickém roztoku. Dynamický proces byl měřen pomocí QCM-D a potvrzen pomocí AFM, DLS a měření kontaktního úhlu. Provedením cyklů oplachování fyziologickým roztokem při pH 4,5 a 7,0 byl u adsorbované vrstvy BSA pozorován reverzibilní, rychlý a na pH závislý jev sorpce vody. Molekuly vody hydratují vrstvu BSA při pH 7,0 a při pH 4,5 ji dehydratují. Vrstva BSA adsorbovaná při pH 4,5 je hydratována 1,4krát více molekulami vody než vrstva BSA adsorbovaná při pH 7,0. Tento jev se vysvětluje rozdílnou konformací molekul BSA adsorbovaných při různých pH. V blízkosti izoelektrického bodu při pH 4,5 se molekuly BSA neutralizují a adsorbují se ve velkém množství jako agregáty: 6,4 mg/m2. Při pH 7,0 se molekuly BSA nabijí (elektrostatické odpuzování) a adsorbují se jako vrstva jednotlivých molekul v množství 5,6 mg/m2. Vrstva agregovaných molekul BSA (při pH 4,5) adsorbovaná na rozhraní zlata zachytí více molekul vody (570 molekul vody/BSA) než vrstva jednotlivých molekul BSA (při pH 7,0), která zachytí 450 molekul vody/BSA. Změna iontové síly oplachováním vrstvy BSA čistou vodou pouze desorbuje více vody ze struktury adsorbované vrstvy. Ve všech případech je vrstva BSA tuhá a nevratně adsorbovaná na rozhraní zlata a během cyklu oplachování se adsorbují/desorbují pouze molekuly vody. Pozorovaný jev je důležitý pro základní pochopení a pro konstrukci nových biodiagnostických zařízení a robustních senzorů.

Prohlášení o dostupnosti dat

Zpracovaná data podporující závěry tohoto článku poskytnou autoři bez zbytečných výhrad každému kvalifikovanému výzkumníkovi.

Příspěvek autorů

VR, CB a BY provedli experimenty. VR a GG provedli analýzu dat a napsali rukopis.

Financování

Tato práce byla podpořena Australian Research Council (ARC), Australian paper, Norske Skog, Orora a Visy prostřednictvím grantu Industry Transformation Research Hub IH170100020.

Střet zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Doplňkové materiály

.