Frontiers in Endocrinology

Introduction

Kardiovaskulární onemocnění (KVO) je nejčastější a nejzávažnější komplikací diabetu, která u pacientů s diabetem mellitem 2. typu vede ke značným úmrtím a invaliditě. Pacienti s T2DM mají dvakrát až třikrát vyšší riziko KVO než pacienti bez T2DM (3, 4). Ve srovnání s tradičními faktory, jako je krevní tlak, lipidy a index tělesné hmotnosti , endogenní sloučeniny malých molekul detekované metabolomickými přístupy s větší pravděpodobností odrážejí stav buněk související se společným působením buněčné výživy, léčiv, znečišťujících látek z prostředí a dalších vnějších faktorů (7). Acylkarnitinové metabolity jsou skupinou esterových látek vznikajících kombinací volného karnitinu a acyl-koenzymu A (acyl-CoA) produkovaného mastnými kyselinami (8). Kohortová studie zjistila, že plazmatické koncentrace některých acylkarnitinů jsou u pacientů s T2DM vyšší než u populace bez T2DM (9). Navíc koncentrace acylkarnitinů a mitochondriálního 4-hydroxynonenalu v srdeční tkáni myší krmených fruktózou byla vyšší než u kontrolní skupiny (10). Vzhledem k tomu, že 4-hydroxynonenal vzniká peroxidací lipidů, může zvýšený obsah 4-hydroxynonenalu naznačovat vysoký oxidační stres (11). Pouze několik klinických studií však zkoumalo souvislosti mezi acylkarnitiny a KVO u T2DM. Ve skutečnosti stále není jednoznačné, zda existují asociace mezi acylkarnitiny a CVD u T2DM.

Provedli jsme proto průřezový průzkum v nemocnicích s cílem odhadnout asociaci mezi metabolity acylkarnitinů a CVD u čínských pacientů s T2DM.

Materiál a metody

Metoda studie a populace

Tato studie použila průřezový design studie ke zkoumání souvislosti mezi acylkarnitiny a CVD u T2DM. Z hlavní elektronické databáze Liaoning Medical University First Affiliated Hospital (LMUFAH), Jinzhou, Čína, jsme získali elektronické lékařské záznamy 2 554 hospitalizovaných pacientů s dostupnými údaji o metabolitech, kteří byli přijati do nemocnice od května 2015 do srpna 2016 (12).

Kritéria pro zařazení byla stanovena následovně: (1) věk ≥ 18 let; (2) diagnóza T2DM; a (3) k dispozici byly metabolity acylkarnitinu: acetylkarnitin (C2), propionylkarnitin (C3), butyrylkarnitin (C4), hydroxylbutyrylkarnitin (C4-OH), sukcinylkarnitin (C4DC), isovalerylkarnitin (C5), 3-hydroxyisovalerylkarnitin (C5-OH), glutarylkarnitin (C5DC), tiglylkarnitin (C5:1), hexanoylkarnitin (C6), oktanoylkarnitin (C8), dekanoylkarnitin (C10), lauroylkarnitin (C12), myristoylkarnitin (C14), 3-hydroxyl-tetradekanoylkarnitin (C14-OH), tetradekanoyldiacylkarnitin (C14DC), tetradekenoylkarnitin (C14:1), palmitoylkarnitin (C16), 3-hydroxypalmitoylkarnitin (C16-OH), 3-hydroxypalmitoleylkarnitin (C16:1-OH), oktadekanoylkarnitin (C18), arachidový karnitin (C20), behenový karnitin (C22), tetrakosanový karnitin (C24), hexakosanový karnitin (C26). Vylučovací kritéria byla následující: (1) diagnostikovaný diabetes 1. typu; (2) těhotenství. Do analýzy bylo zahrnuto celkem 741 pacientů s T2DM, kteří splňovali inkluzní a neměli vylučovací kritéria.

Etický souhlas se studií byl získán od Etické komise pro klinický výzkum LMUFAH a od informovaného souhlasu bylo Etickou komisí pro klinický výzkum LMUFAH upuštěno vzhledem k retrospektivnímu charakteru průřezové studie.

Sběr dat a klinická definice

Demografické a klinické údaje byly získány z hlavní elektronické databáze nemocnice, včetně věku, pohlaví, délky trvání diabetu, komplikací diabetu, užívání léků (antidiabetika, antihypertenziva a léky snižující hladinu lipidů), BMI, systolický krevní tlak (SBP), diastolický krevní tlak (DBP), glykovaný hemoglobin (HbA1c), triglyceridy (TG), cholesterol v lipoproteinech o nízké hustotě (LDL-C) a cholesterol v lipoproteinech o vysoké hustotě (HDL-C).

CVD bylo definováno jako předchozí ischemická choroba srdeční (ICHS), srdeční selhání (SS) nebo cévní mozková příhoda. BMI byl vypočten jako podíl tělesné hmotnosti v kilogramech a čtverce tělesné výšky v metrech, vyjádřený v kg/m2. Nadváha byla definována jako BMI ≥ 24,0 kg/m2, ale <28,0 kg/m2, a obezita jako BMI ≥ 28,0 kg/m2 podle doporučení Čínské diabetologické asociace pro použití v Číně (13). K měření SBP a DBP byl použit kalibrovaný rtuťový sfygmomanometr po 5-10minutovém klidu pacientů. Pacientům s T2DM byla odebrána krev přes noc nalačno (nejméně 8 h nalačno). Měření HbA1c, TG, HDL-C a LDL-C bylo provedeno v biochemické laboratoři LMUFAH. Podle počtu atomů uhlíku v řetězci acylové skupiny byly acylkarnitiny rozděleny do tří skupin: acylkarnitiny s krátkým řetězcem zahrnující C2, C3, C4, C4-OH, C5, C5-OH, C5DC, C5:acylkarnitiny se středně dlouhým řetězcem zahrnující C8, C10, C12, C14, C14-OH, C14DC a C14:1; acylkarnitiny s dlouhým řetězcem zahrnující C16, C16-OH, C16:1-OH, C18, C20, C22, C24 a C26 (14).

Kvantifikace acylkarnitinů

Metabolomická metoda stanovení byla popsána v předchozích studiích (15). Stručně řečeno, vzorky suché krve odebrané punkcí prstu po 8 hodinách nalačno byly použity metabolomické analýzy. Metabolomika v suchých krevních skvrnách byla měřena pomocí technologie hmotnostní spektrometrie (MS). MS metabolomická analýza byla provedena pomocí systému AB Sciex 4000 QTrap (AB Sciex, Framingham, MA, USA). Zdrojem ionizace elektrosprejem byl iontový zdroj. Napětí iontového spreje bylo 4,5 kV. Pro skenování analytů byl použit pozitivní režim. Mobilní fází, která nesla testovanou složku, byl 80% vodný roztok acetonitrilu. Pro absolutní kvantifikaci byly použity izotopově značené vnitřní standardy acylkarnitinu od Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, USA).

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí Statistical Analysis System Release 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Hodnota P < 0,05 byla považována za statisticky významnou. Kategoriální údaje mezi dvěma skupinami byly porovnány pomocí Chí-kvadrát testu nebo případně Fisherova exaktního testu a vyjádřeny jako množství a procenta. P-P graf nebo Q-Q graf byl použit k testům normality, pokud byla analyzovaná proměnná spojitou proměnnou. Spojité proměnné, které odpovídaly normálnímu rozdělení, byly prezentovány jako průměr ± směrodatná odchylka (SD) a porovnávány Studentovým t-testem, nebo jako medián s mezikvartilovým rozpětím (IQR) v opačném případě a porovnávány Wilcoxonovým signifikantním rank testem.

Pro zvládnutí vícenásobných porovnání byla použita faktorová analýza k redukci velkého počtu korelovaných acylkarnitinů na menší počet nekorelovaných faktorů. K posouzení vhodnosti pro faktorovou analýzu byly použity Kaiser-Meyer-Olkinův (KMO) a Bartlettův test sféricity (16). Koeficient KMO < 0,5 je považován za nepřijatelný, zatímco hodnoty kolem 0,8 byly považovány za záslužné. K extrakci faktorů a získání odpovídající matice faktorových zátěží byla použita analýza hlavních komponent. Rotací Varimax se původní matice faktorového zatížení otočila, aby se získalo řešení, které je stručnější a snadněji interpretovatelné než původní extrakce faktorů (17). Jednotlivé acylkarnitiny, které měly maximální zátěž pro faktor, byly použity jako příslušné komponenty faktoru. Scree plot je liniový graf vlastních čísel faktorů ve faktorové analýze (18). Vodorovnou osou scree grafu je počet faktorů a svislou osou je vlastní hodnota faktorů. Počet acylkarnitinových faktorů byl určen podle vlastního čísla, komunalit a scree plot: vlastní číslo > 1, komunalita ≥ 50 %, počet faktorů se nachází na strmém svahu scree plot.

Multivariabilní binární logistická regrese byla použita k odhadu poměrů šancí (OR) a jejich 95% intervalů spolehlivosti (CI) extrahovaných acylkarnitinových faktorů pro KVO u T2DM. Ke kontrole matoucích účinků demografických a klinických proměnných bylo použito strukturované schéma úprav. Konkrétně model 1 byl univariační model; model 2 byl upraven pro všechny ostatní acylkarnitinové faktory; model 3 byl dále upraven pro věk, pohlaví, BMI, délku trvání diabetu, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C, HDL-C; a model 4 byl kromě proměnných upravených v modelu 3 dále upraven pro užívání léků, včetně antidiabetik, antidiabetik a léků snižujících lipidy.

Výsledek

Popis subjektů studie

Průměrný věk pacientů ve studii byl 57,9 (SD: 14,1) let a medián trvání diabetu byl 5 (IQR: 0-10) let. Z nich 391 (52,8 %) bylo mužů a 288 (38,9 %) mělo KVO (87 pouze s CAD, 109 pouze s cévní mozkovou příhodou, 6 pouze s VF, 51 s CAD i cévní mozkovou příhodou, 53 s CAD i VF, 18 s cévní mozkovou příhodou i VF a 18 se všemi) (tabulka 1, datový list 1).

V porovnání se skupinou bez KVO byli pacienti s T2DM s KVO častěji starší a měli delší trvání diabetu, vyšší SBP, nižší HbA1c a méně často užívali inzulin. Tito pacienti měli tendenci mít nižší LDL-C, nižší míru užívání antidiabetik, vyšší míru užívání léků snižujících hladinu lipidů a antihypertenziv. Mezi oběma skupinami nebyly zjištěny významné rozdíly v pohlaví, BMI, DBP, HDL-C a TG. C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14-OH a C14:1 byly vyšší, zatímco C5-OH a C24 byly nižší u pacientů s KVO než u jejich protějšků bez KVO. Ostatní acylkarnitiny byly v obou skupinách podobné (tabulka 2).

Výsledky faktorové analýzy acylkarnitinů

Výsledky faktorové analýzy byly přijatelné, jak naznačuje vysoký koeficient KMO 0,898 a vysoce významná P-hodnota Bartlettova testu sféricity <0,0001. Faktory 1-5 měly vlastní hodnoty větší než 1 a nacházely se na strmém svahu grafu scree (obrázek 1). Extrahovali jsme tedy pět faktorů a zátěže acylkarnitinů na těchto pěti faktorech po rotaci varimax byly uvedeny v tabulce 3. Faktor 1 zahrnoval C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8 a C14DC; faktor 2 zahrnoval C10, C12, C14, C14-OH, C14:1 a C16-OH; faktor 3 zahrnoval C16, C16:1-OH, C18, C20 a C3; faktor 4 zahrnoval C22, C24 a C26; faktor 5 zahrnoval C4DC, C5, C5-OH a C5:1. Faktor 3 zahrnoval C16, C16:1-OH, C18, C20 a C3. Těchto pět faktorů vysvětlilo 65,9 % celkového rozptylu.

Asociace mezi extrahovanými faktory a rizikem KVO u T2DM

Faktory 1, 2 a 4 byly v univariační analýze pozitivně asociovány s rizikem KVO u T2DM. Po úpravě na ostatní faktory byly tyto pozitivní asociace stále významné (model 2). Avšak pouze faktor 1 (OR: 1,42, 95% CI: 1,03-1,95) a faktor 2 (OR: 1,24, 95% CI: 1,03-1,49) byly stále pozitivně spojeny s rizikem KVO po další úpravě na věk, pohlaví, BMI, délku trvání diabetu, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C a HDL-C. V případě, že se faktor 1 (OR: 1,42, 95% CI: 1,03-1,95) a faktor 2 (OR: 1,24, 95% CI: 1,03-1,49), zůstaly pozitivně spojeny s rizikem KVO. Po konečné úpravě na užívání léků se velikost účinku faktoru 1 (OR: 1,45, 95% CI: 1,03-2,03) a faktoru 2 (OR: 1,23, 95% CI: 1,02-1,50) v podstatě nezměnila (tabulka 4).

Analýza citlivosti

Po imputaci střední hodnoty a vícenásobné imputaci chybějících hodnot u HbA1c (n = 200) zůstaly velikosti účinku faktorů 1 a 2 pro riziko KVO u T2DM stabilní a významné v uni- i multivariabilních analýzách (tabulka S1).

Diskuse

Tato studie ukázala, že některé acylkarnitiny, tj, C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8 a C14DC ve faktoru 1 a C10, C12, C14:1, C14, C14-OH a C16-OH ve faktoru 2, byly spojeny s rizikem KVO u T2DM a tyto asociace byly nezávislé na ostatních acylkarnitinech a tradičních rizikových faktorech KVO. Tyto acylkarnitinové metabolity extrahované ve faktoru 1 a 2 byly hlavně acylkarnitiny s krátkým a středně dlouhým řetězcem.

Cesta energetického zásobování oxidací mastných kyselin s dlouhým řetězcem u člověka je následující. V buňkách se mastná kyselina s dlouhým řetězcem (FA) spojuje s koenzymem A (COA) za vzniku acyl-koenzymu A s dlouhým řetězcem (acyl-COA) (19). Karnitin se spojuje s acylovou skupinou dlouhého řetězce acyl-COA za vzniku dlouhého řetězce acylkarnitinu pomocí karnitin palmitoyltransferázy 1 umístěné ve vnější mitochondriální membráně (20). Acylkarnitin je transportován do mitochondrií prostřednictvím karnitin acylkarnitin translokázy (CATC) (21). Acylkarnitin s dlouhým řetězcem je rozkládán na acyl-CoA s dlouhým řetězcem a karnitin karnitin palmitoyltransferázou 2 ve vnitřní mitochondriální membráně (22). Acyl-COA s dlouhým řetězcem je dehydrogenován působením acyl-COA dehydrogenázy s velmi dlouhým řetězcem za vzniku enoyl-COA (23). Enoyl-COA vytváří 3-hydroxyacyl-CoA hydratací za regulace enoyl-CoA hydratázy (23). 3-hydroxyacyl-CoA je dehydrogenován 3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenázou s dlouhým řetězcem za vzniku 3-ketoacyl-CoA (24). 3-ketoacyl-CoA podléhá thiolýze dlouhořetězcovou letoacyl-CoA thiolázou za vzniku acetyl-CoA a acyl-CoA se zkráceným dvouuhlíkatým řetězcem (25). Zkrácený COA znovu vstupuje do tohoto metabolického cyklu, až vstoupí do cesty oxidace mastných kyselin s krátkým řetězcem. Ve srovnání s mastnými kyselinami s dlouhým řetězcem mohou mastné kyseliny se středním a krátkým řetězcem vstupovat do mitochondrií přímo bez asistence CACT. Podobně jako u mastných kyselin s dlouhým řetězcem, i u mastných kyselin se středně dlouhým a krátkým řetězcem dochází ke srovnání zkráceného-COA a acetyl-CoA za kombinované katalýzy některých podobných enzymů. Zkrácený-COA znovu vstupuje do cyklu mastných kyselin s krátkým řetězcem, dokud není přeměněn na acetyl-CoA. Nakonec acetyl-CoA vzniklý při oxidaci mastné kyseliny poskytuje energii účastí v cyklu trikarboxylové kyseliny (obr. 2A).

Několik studií uvádí sníženou rychlost oxidace glukózy, zvýšenou rychlost oxidace FA a spotřebu kyslíku v myokardu u ob/ob a db/db myší (26, 27). Americký výzkumný tým dospěl k podobnému závěru opakovaným měřením výše uvedených myší v různých týdnech věku (28). Tým na základě dalšího PCR experimentu vyslovil podezření, že genová exprese podílející se na příjmu a oxidaci FA je v nerovnováze, což vede k tomu, že FA vstupující do kardiomyocytů převyšuje mitochondriální oxidační kapacitu. Kromě toho některé další studie zjistily, že kardiomyocyty potkanů Zucker neměly významně zvýšenou oxidaci ve srovnání se zvýšeným množstvím FA s dlouhým řetězcem v kardiomyocytech (29, 30). Studie stanovila hladiny FA u lidí a zjistila, že ačkoli se rychlost oxidace FA zvýšila, procento množství oxidovaných mastných kyselin bylo nižší v důsledku zvýšeného příjmu (31). Kromě toho se acyl-CoA může hromadit v cytoplazmě, pokud dojde k přetížení FA (32). Metabolomická analýza shodně zjistila, že ve srovnání s pacienty bez T2DM byla oxidace mastných kyselin s dlouhým řetězcem u pacientů s T2DM neúplná, což vedlo k významnému zvýšení plazmatických hladin C6, C8, C10, C12 a C14 (33). Někteří výzkumníci prokázali, že procento tělesného tuku pozitivně koreluje se sérovými hladinami C2, C3, C4, C5, C6, C8:1 a C16:1 (34). Je pravděpodobné, že vyšší množství tělesného tuku korelovalo s neúplnou beta oxidací mastných kyselin, což převážně vedlo k vyššímu množství acylkarnitinu s krátkým nebo středním řetězcem. Zjistili také, že sérové hladiny C2, C6, C8, C10, C12, C14, C14:1 a C14-OH byly v prediabetickém stavu zvýšené (34).

Předpokládáme tedy, že mírně zvýšená rychlost oxidace mastných kyselin kardiomyocyty u pacientů s T2DM nemůže adekvátně oxidovat volné FA s dlouhým řetězcem, které se v kardiomyocytech hromadí. Nahromaděné volné FA vyvolávají kardiotoxicitu. Na druhé straně může být cesta oxidace mastných kyselin se středním a krátkým řetězcem inhibována v důsledku zvýšené rychlosti oxidace mastných kyselin s dlouhým řetězcem. V důsledku této inhibice se koenzym A se středním a krátkým řetězcem dostatečně nepřeměňuje na acetyl-CoA. A konečně, kumulativní vazba karnitinu na acyl-CoA vede ke zvýšení acylkarnitinů se středním a krátkým řetězcem (obrázek 2B).

V naší studii bylo zaznamenáno několik omezení. Za prvé, naše studie byla průřezová a nemohla stanovit kauzální vztahy mezi acylkarnitiny a KVO u T2DM. Za druhé, naše subjekty byli hospitalizovaní pacienti. Jejich T2DM byla závažnější než u pacientů s T2DM na svobodě. Naše zjištění tedy nelze extrapolovat na obecnou populaci pacientů s T2DM. Zatřetí, naše studie nesbírala dietní faktory a stravovací návyky mohou být v naší analýze jedním z hlavních matoucích faktorů (35). Pečlivě jsme však upravili potenciálně matoucí účinky jiných metabolitů acylkarnitinu a demografických a klinických faktorů, mimo jiné včetně věku, BMI, tlaku, HbA1c a lipidového profilu. Vzhledem k tomu, že se jedná o „výsledky“ stravy, mohlo přizpůsobení těmto metabolitům acylkarnitinu a klinickým faktorům částečně odstranit matoucí účinky stravovacích návyků. Nicméně jsme uznali, že i přes pečlivé přizpůsobení těmto matoucím faktorům nemůžeme vyloučit, že existují neupravené matoucí účinky. Proto je třeba naše výsledky interpretovat s opatrností. Začtvrté jsme nestanovovali hladiny inzulinové rezistence a acyl-CoA. Konečně u 200 případů chybělo u našich subjektů stanovení HbA1c. Tyto asociace však zůstaly stabilní po průměrné imputaci a vícenásobné imputaci, což naznačuje, že významné zkreslení je nepravděpodobné.

Náš výzkum měl důležité důsledky pro veřejné zdraví. KVO je častou a závažnou komplikací u T2DM, která je významně spojena s předčasným úmrtím u T2DM. Přestože intenzivní léčba hyperglykémie, hypertenze a abnormálních lipidů dokáže snížit riziko KVO u T2DM, reziduální riziko KVO zůstává značně vysoké (36). Je důležité lépe porozumět mechanismům vzniku KVO u T2DM. Naše studie poskytuje nový pohled na cesty od metabolických poruch u T2DM k CVD.

Závěrem naše studie zjistila, že zvýšené plazmatické hladiny některých metabolitů acylkarnitinu extrahovaných ve faktorech 1 a 2, tj. C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14OH a C14:1, jsou spojeny s rizikem CVD u čínských hospitalizovaných pacientů s T2DM. Vzhledem k povaze průřezové studie jsou k replikaci našich zjištění v budoucnu zapotřebí prospektivní kohortové studie.

Prohlášení o dostupnosti dat

Soubory dat vytvořené pro tuto studii lze nalézt v Metabolights s jedinečným identifikátorem MTBLS1427, přístupné prostřednictvím http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1427.

Etické prohlášení

Studie zahrnující lidské účastníky byly posouzeny a schváleny Etickou komisí pro klinický výzkum První přidružené nemocnice Liaoningské lékařské univerzity. V souladu s národní legislativou a institucionálními požadavky nebyl pro tuto studii vyžadován písemný informovaný souhlas s účastí.

Příspěvky autorů

Z-ZF, SZ a XY navrhli studii. SZ a X-FF analyzovali data a napsali návrh. H-HL a MG shromáždili data. JL, Y-FC a X-YS poskytli kritické připomínky a přispěli k napsání tohoto rukopisu. SZ, TH, J-XC, JZ a DS se podíleli na revizi tohoto rukopisu.

Financování

Tato práce byla podpořena projektem pro Národní klíčový program výzkumu a vývoje (2019YFA0802300), Přírodní vědeckou nadací provincie Liaoning (20170540364), Všeobecným vědeckým výzkumným projektem ministerstva školství provincie Liaoning (L2015326), Klíčovým programem výzkumu a vývoje provincie Liaoning (2019JH8/10300036), třináctý pětiletý plán a projekt TMU pro talenty (11601501/2016KJ0313), individualizovaná diagnostika a léčba kolorektálního karcinomu (LNCCC-B05-2015), Nadace Výboru pro vědu a technologie města Tianjin (15JCYBJC54700), Čínská postdoktorandská vědecká nadace (2016M590210), klíčový projekt Tianjin Health Bureau Science Foundation (16KG154) a projekt Tianjin Thousand Youth Talents.

Střet zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

Autoři děkují všem lékařům, zdravotním sestrám a výzkumným pracovníkům LMUFAH v Jinzhou za jejich účast v této studii.

Doplňkové materiály

Doplňkové materiály k tomuto článku naleznete online na adrese: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00212/full#supplementary-material

.