Új ismeretek az apoptoszóma szerkezetéről és működéséről

A korai szerkezeti információk döntő fontosságúak voltak az apoptoszóma doménszerveződésének feltárásában. A humán apoptoszóma hét Apaf-1 molekulát tartalmaz, amelyek szimmetrikusan egy kerék alakú szerkezetben helyezkednek el, hogy egy központi hubot alkossanak, amely NOD-okból áll, hét meghosszabbított HD2 karral, amelyek mindegyike egy V alakú régióban végződik, amelyet a két β-propeller alkot . Az NBD és a HD1 α/β-hajtása ADP/dATP-t köt meg közöttük, míg a WD40 ismétlődések alkotják a 7 és 8 lapátos β-propellereket . A korábbi feltételezésekkel ellentétben azt találtuk, hogy a szomszédos Apaf-1 molekulák α/β-hajtása közötti laterális kölcsönhatások szolgálják a központi hub szerveződését, míg az N-terminális CARD-ok e gyűrű felett ülnek, és pc-9 hiányában rendezetlenek (PDB 3J2T) . A közelmúltbeli közeli atomszerkezetek azonban azt mutatták, hogy az Apaf-1 CARD-ok pc-9 CARD-ok jelenlétében az aktív apoptoszóma felszínén korongszerűséget alkotnak, és ez az elrendeződés eltér a CED-4 és Dark esetében tapasztaltaktól (1. és 2. ábra) . A központi hub stabilitását a szomszédos Apaf-1 molekulák szomszédos NBD és HD1 moduljai közötti α-hélix kölcsönhatások, hidrogénkötések és sóhidak komplex hálózata tartja fenn . Úgy tűnik, hogy a szomszédos protomereken lévő WHD/HD1 kapcsolatok támogatják az apoptoszóma összeszerelését a szomszédos NBD- és HD1-doméneket áthidaló WHD-doménekkel . Ahogy a Darkban is előfordul, az Apaf-1 ISM hélixe (α12) kiterjedt hidrofób kölcsönhatásokon keresztül párosul az α13 hélixszel, hogy mindegyik alegységben egy hélix-hurok-hélix motívumot képezzen, amelyek viszont oldalirányban kölcsönhatásba lépnek a szomszédos alegységekkel, hogy egy hélixes csákánykerítést képezzenek, amely a gyűrű központi pórusát szegélyezi .

Az egészséges sejtekben az Apaf-1 monomerek zárt, inaktív konformációban léteznek, az ADP az NBD-HD1 határfelületén lévő résbe ágyazódva (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Ez a zárt konformáció előrevetíti a monomer kiterjedt konformációs változásainak szükségességét az apoptoszóma-összeszerelés elősegítése érdekében. A C. elegans és a Drosophila apoptoszóma-képződésével ellentétben az apoptózis jelátvitel során a mitokondriumokból felszabaduló citokróm c a monomer Apaf-1-hez kötődik, ami konformációs változásokat vált ki, amelyek nukleotidcseréhez vezetnek (ATP vagy dATP helyettesítheti az ADP-t), majd egy meghosszabbított Apaf-1 oligomerizációjához az apoptoszóma kialakulásához (3. ábra) . A bekövetkező konformációs változások megértéséhez pontos modellekre van szükség az Apaf-1 inaktív és kiterjesztett állapotáról. Meghatároztuk az inaktív Apaf-1 monomerek két kristályszerkezetét kötött ADP-vel, az egyikből hiányoztak a β-propellerek, a másikból pedig az N-terminális CARD-domének a kristályosítás megkönnyítése érdekében. A NOD azonban ebben a két kristályformában gyakorlatilag azonos, és ez lehetővé tette a teljes Apaf-1 monomer konszenzusos modelljének megalkotását kötött ADP-vel. A humán apoptoszóma közel atomi szerkezetét mostanra több csoport is létrehozta egy részecske krio-EM segítségével, hogy betekintést nyerjünk az Apaf-1 kiterjesztett konformációjába pc-9 hiányában és jelenlétében (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; 3. ábra) . Az előrejelzésnek megfelelően , az Apaf-1 konformációja a központi hub, a HD2 karok és a szabályozó régió lényegében azonos mind az inaktív, mind az aktív apoptoszómákban . Ezek a vizsgálatok fontos részleteket szolgáltattak a domének közötti van der Waals-kapcsolatokban részt vevő specifikus maradékokról az egyes Apaf-1 molekulákon belül, feltárták az aktív apoptoszómát stabilizáló domén kölcsönhatások szempontjából kritikus maradékokat, és kimutatták a tandem 7- és 8-lapátos β-propellerek V alakú szenzor-doménjén belüli kölcsönhatásokat, amely a citokróm c kötőfelületet képezi

Az Apaf-1 apoptoszómában a dATP-kötőhely az NBD-HD1 határfelületen található, és részben a Walker A hurok és a HD1 és a WHD közötti hurok alkotja. Míg az Apaf-1 inaktív állapotban képes ADP-t kötni, in vitro az apoptoszóma-összeszerelődéshez kis mértékben a dATP-t részesíti előnyben (áttekintve a hivatkozásban ), míg in vivo az ATP sokkal nagyobb mennyiségben fordul elő (~ 2 mM ATP vs. 10 μM dATP). . A stabilizáció egy része az NBD-ben lévő arginin-maradék (Arg265), valamint a HD1-ben lévő Ser325 és Tyr359 és a kötött ATP/dATP molekula közötti kölcsönhatások révén történik. Az NBD-HD1 pár elfordulása a WHD 20-as α-hélixe körül a HD1-WHD hurkot a nukleotidzseb aljára pozícionálja, ami lehetővé teszi, hogy az NBD-HD1 pár az összeszerelés során kerületi kölcsönhatásokat alakítson ki a központi hubon belül. Ez megtöri a WHD-vel való kölcsönhatásokat is, amelyek normális esetben a zárt konfigurációt stabilizálják .

Az érzékelő β-propellerek és a citokróm c kötődés

Az apoptoszóma kerék “küllők” a HD2 domének által nyúlnak ki a hubból, és mindegyik kar a két β-propeller érzékelő domént tartalmazó V alakú régió alapját képezi. A leghosszabb Apaf-1 izoformában (Apaf-1XL), amely a legtöbb szövetben expresszálódik , a tizenöt WD40 ismétlődés tandem 7 és 8 lapátos β-propellereket alkot, és egy nemrégiben végzett cryo-EM vizsgálat szerint ez egy új zárási mechanizmussal rendelkezik. A β-propellerek topológiája hasonló az aktin interakcióban lévő fehérjében (Aip1p) található topológiához, amelyben a HD2-től származó linker a 8 lapátos β-propeller utolsó lapátjának d-szálát alkotja (az 1a. ábrán a 7 lapátos propeller elején lévő kis kék régió jelzi), mielőtt átmegy a 7 lapátos β-propeller kialakításához . Ezt a topológiát az egér Apaf-1 3,0 Å felbontású kristályszerkezete igazolta, és úgy tűnik, hogy konzerválódott a sötét β-propellerekben .

Az Apaf-1 apoptoszómában a V alakú β-propellerek alkotják a citokróm c kötő zsebet, és úgy tűnik, hogy a citokróm c-vel való kölcsönhatást hidrogénkötések és sóhidak stabilizálják . A citokróm c redukált és oxidált formái egyaránt kölcsönhatásba léphetnek az apoptoszómával, hogy közvetítsék annak aktiválását . Érdekes módon úgy tűnik, hogy a citokróm c előnyösen kölcsönhatásba lép a 8 lapátos β-propellerrel, míg a 7 lapátos β-propellerrel korlátozottabb érintkezési felület alakul ki . A citokróm c ~ 6 Å felbontású az új térképeken a helyi mozgás miatt, és a molekula ~ 90°-kal el van forgatva, egy korábbi, molekuláris dokkoláson alapuló modellhez képest egy olyan térképen, ahol a hélixek nem voltak felbontva . Az irányított mutagenezis feltárta a citokróm c-ben az Apaf-1 β-propellerekkel való stabil társuláshoz szükséges kritikus maradékokat, és e maradékok közül néhány (G56, P76, I81) fontos az apoptoszóma kialakulásához és az azt követő kaszpáz aktivációhoz .

A WD-40 ismétlődő régiót nélkülöző csonka Apaf-1 molekulák is összeállhatnak apoptoszómákká, amelyek konstitutívan aktívak, de idővel szétesnek . Ez azt sugallta, hogy a β-propellerek némileg gátolhatják az összeszerelődést, miközben stabilizálják az Apaf-1 apoptoszómát . Az Apaf-1 apoptoszómában a β-propellerek azonban nagy sugárban helyezkednek el, és nem lépnek kölcsönhatásba a szomszédos alegységekkel, sem a monomer más doménekkel, a HD2 kivételével. Ezért a destabilizációs mechanizmus rejtélyes marad. Bár spekulatív, a β-propellerek hiánya a csonka apoptoszómákban gyengítheti a HD2 és a központi hub közötti kölcsönhatásokat, ami időfüggő széteséshez vezethet.

Most már világos, hogy a citokróm c kötődése a β-propeller régió felfelé irányuló forgását okozza, ami megszakítja a kapcsolatot a 7 lapátos β-propeller és az NBD-HD1 pár között az inaktív Apaf-1 monomerben , miközben a 7 lapátos β-propeller a 8 lapátos β-propeller felé forog egy szorító mozgásban . Ezek az események destabilizálják az autoinhibált Apaf-1 konformációt és megkönnyítik a nukleotidcserét azáltal, hogy elősegítik a konformációs változásokat, amelyek feltárják az ADP-kötő zsebet, hogy lehetővé tegyék az ATP/dATP kötést . Ez stabilizálja az Apaf-1 monomert egy kiterjesztett konformációban, így képes kölcsönhatásba lépni a szomszédos protomerekkel. A sáveltolódási kísérletek arra utalnak, hogy a nukleotidcsere és a kapcsolódó konformációs változások az Apaf-1-ben a citokróm c kötődésére válaszul következhetnek be, mivel citokróm c hiányában hozzáadott dATP-vel nem észleltek jelentős változásokat az Apaf-1 konformációjában. Ezek az adatok együttesen egy olyan szekvenciális modellt támasztanak alá, amelyben a citokróm c kötődés a nukleotidcserét megelőzően következik be, hogy megkönnyítse az Apaf-1 zárt konformációjából a kiterjesztett konformációba való átmenetet. Ezen túlmenően ezek az eredmények arra utalnak, hogy a WD40 ismétlődések szenzorként működnek, amelyek a citokróm c megkötésével kiváltják a kezdeti apoptoszóma-összeszerelődést.

A prokaszpáz-9 aktiváció lehetséges mechanizmusai

A prokaszpáz-9-et az apoptoszóma toborozza, hogy egy holoenzimet képezzen, amely növeli katalitikus aktivitását . Oldatban a pc-9 konstitutív monomer, ha nem kötődik az Apaf-1-hez, míg az aktív kaszpázok általában dimerek . Figyelemre méltó, hogy a két pc-9 monomer közötti dimerikus kölcsönhatás kristályrácsban elősegíti az egyik katalitikus alegységen az aktív centrum kialakulását, míg a második alegység inaktív konfigurációban marad (PDB 1JXQ), és hasonló jelenség fordul elő a CED-3 dimereknél nagy koncentrációban . A pc-9 N-terminális CARD-ja kölcsönhatásba lép az Apaf-1 CARD(ok)kal, hogy rekrutálja az apikális prokaszpázt az apoptoszómába, és ez elősegíti a katalitikus domén aktiválódását, amelyet egy hosszú linker választ el a CARD-tól (2a. ábra) . Ezenkívül a katalitikus domén p20 és p10 alegységei szintén egy önhasadásnak kitett linkerrel kapcsolódnak egymáshoz . Így ahhoz, hogy megértsük, hogyan aktiválódik a pc-9, meg kell értenünk a CARD-ok és a pc-9 linkerek szerepét a holo-apoptoszómában.

A pc-9 apoptoszóma általi aktiválódásának mechanizmusát magyarázó különböző modelleket javasoltak . A “proximity-indukált dimerizációs modell” azt jósolja, hogy a pc-9 molekulák rekrutációja az Apaf-1 apoptoszómához elősegítheti a homodimerizációt, ami vélhetően a pc-9 auto-aktiválásához vezet . A közelmúltig azonban semmilyen szerkezeti vagy biokémiai bizonyíték nem bizonyította, hogy a pc-9 homodimer, amikor az apoptoszómához kötődik (lásd alább ). Az “indukált konformációs modell” azt javasolta, hogy az Apaf-1 apoptoszóma egy olyan platform, amely megköti a pc-9-et, hogy elősegítse annak aktív konformációját . A legújabb modellezés azt sugallta, hogy a pc-9 aktiválódását elsősorban az apoptoszóma platform allosztérikus szabályozása közvetíti . Mindezen modellekben az apoptoszóma elsődleges funkciója az Apaf-1 és a pc-9 CARD-ok közötti multimer komplex összeállítása a pc-9 aktiváció elősegítése érdekében a zimogén helyi koncentrációjának növelésével . Ezen túlmenően a módosított pc-9-re vonatkozó adatok, amely oldatban konstitutív dimer, arra utalnak, hogy a CARD és a linkere gátolhatja a katalitikus domének működését . Ezért a CARD heterodimer kialakulása az apoptoszómán feloldhatja ezt a gátlást, azonban ez az elképzelés még tesztelésre vár.

Míg a dimerizáció kulcsszerepet játszhat az aktivációban, az, hogy ez hogyan történik az apoptoszómán, továbbra is megmagyarázatlan, sőt a legújabb adatok egy bonyolultabb aktivációs mechanizmus lehetőségét sugallják, amely magában foglalja mind a pc-9 molekulák homodimerizációját, mind az egyetlen pc-9 katalitikus domén és az Apaf-1 NBD-je közötti heterodimer kialakulását . Érdekes módon az Apaf-1 monomer inaktív konformációja nem zárja ki a pc-9 kötődését a CARD-CARD kölcsönhatásokon keresztül, amint azt a sáveltolódási kísérletek mutatták . Így a pc-9/Apaf-1 heterodimerek rekrutálódhatnak az összeálló apoptoszómához annak aktiválódásának részeként (3. ábra). Továbbra is nyitott kérdés, hogy az Apaf-1 összeszerelődését pc-9 jelenlétében további CARD-ok közötti kölcsönhatások irányítják-e a naszcens lemezben.

A kezdeti kristályszerkezet egy stabil 1:1 komplexet mutatott ki az Apaf-1 és a pc-9 CARD domének között egy komplementer interfésszel (az úgynevezett I. típus), amely nélkülözhetetlen a pc-9 aktiválásához . Később azonban kiderült, hogy ez a stabil 1:1 komplex nem elegendő a pc-9 aktiválásához. Ehelyett az Apaf-1 és a pc-9 CARD-ok magasabb rendű oligomer komplexeket alkotnak, amelyeket elsősorban a három lehetséges interfész közül kettő stabilizál (az úgynevezett I., II. és III. típus), amelyek más halál-domén komplexekben is megtalálhatók . A CARD-CARD lemezben részt vevő kölcsönhatások összehasonlítása a CED-4, Dark és Apaf-1 apoptoszómákban rávilágít a II. és III. típusú interfészek némi konzerváltságára, az I. típusú CARD kölcsönhatások csak a humán apoptoszómában találhatók . Egy nemrégiben 2,1 Å felbontású kristályszerkezet egy heterotrimer komplexet mutatott ki, amely két Apaf-1 CARD-ból és egy közte lévő pc-9 CARD-ból áll . Kimutatták, hogy a pc-9 (Arg36/ Arg65) és az Apaf-1 (Glu78) CARD-ok maradványait érintő II. típusú kölcsönhatások kritikusak a pc-9 aktiválásához, a korábban leírt I. típusú kölcsönhatásokkal együtt. Sőt, egyetlen maradék (Glu41 az Apaf-1 CARD-ban) képes elágazó kölcsönhatást kialakítani a pc-9 CARD-dal egy minimális III. típusú interfészben. Az Apaf-1 CARD-on lévő Lys58 és Lys62 további kölcsönhatásokról szintén kimutatták, hogy szükségesek a pc-9 aktiválásához, és segíthetnek az Apaf-1 CARD-ok pozícionálásában a platformon. Így a heterotrimer CARD-komplex kialakulása lehetőséget biztosít arra, hogy több pc-9 katalitikus domént az apoptoszóma platformhoz kössön .

Az aktív Apaf-1 apoptoszóma két közel atomi felbontású szerkezete feltárta, hogy az Apaf-1 és a pc-9 CARD lemezes elrendezésének általános felépítése egy ferde lemezt hoz létre, amely a központi hub felett helyezkedik el (2. és 3. ábra) . A lemez és a platform közötti szimmetria eltérés a CARD lemez akcentrikus elhelyezkedését eredményezi felülről nézve (3. ábra) . A korongot Apaf-1 és pc-9 CARD párok spiráljaként lehet leírni, ahol négy Apaf-1 CARD alkotja az alsó “réteget”, míg a felső felületen három vagy négy pc-9 CARD található (2b-d. ábra). Ráadásul az Apaf-1 CARD-ok a központi hub felszínétől távolabbra kerülnek, mivel spirálisan balra felfelé haladnak, és így eltérő linker-konformációkat és eltérő kölcsönhatásokat mutatnak a központi hubban lévő rokon NBD-jeikkel. Az Apaf-1 és a pc-9 CARD-párok II-es típusú interfészeken keresztül lépnek kölcsönhatásba, és oldalirányban a spirál körül elsősorban I-es típusú kölcsönhatások révén kapcsolódnak össze. Figyelemre méltó, hogy a hét Apaf-1 CARD közül csak négy lép kölcsönhatásba a pc-9 CARD-okkal a korongban . Ennek az az oka, hogy a fennmaradó három Apaf-1 CARD molekula nem illeszkedik könnyen a spirál alegységkötési mintázatába, és nem tudja folytatni a spirált, mert CARD-NBD linkereik túl rövidek . Az apoptoszóma szomszédos alegységeiből származó Apaf-1 CARD-ok egy varratnál (az 1a és 7a pozíciók között) helyezkednek el, ahol a spirál függőleges irányú megnyúlása megáll (2c, d ábra) . Az Apaf-1/pc-9 CARD-lemez kialakulása szükséges az apoptoszóma aktiválásához, és a pc-9 katalitikus domének rugalmasan kapcsolódnak a CARD-okhoz egy linker segítségével (2a. ábra) . Az egyik szerkezetben egy négy Apaf-1 CARD-ot és három pc-9 CARD-ot tartalmazó korong volt látható, gyenge sűrűséggel, ami arra utal, hogy egy negyedik pc-9 CARD alacsonyabb foglaltsággal kapcsolódhat a helikális spirál tetejéhez . Egy második szerkezetben a korong uralkodó konfigurációja 8 CARD-ot tartalmazott, a spirálban lévő CARD-ok konformációja nagyon hasonló volt a két, egymástól függetlenül megoldott szerkezet között (lásd a 2d. ábra átfedését). A pH és a sókoncentráció változása magyarázhatja a nyolcadik pozíció eltérő foglaltságát. Így az apoptoszóma összeszerelődése elősegíti a pc-9 CARD-ok toborzását és helyi koncentrációját, ami lehetővé teszi egy új, 7 vagy 8 CARD-ot tartalmazó helikális oligomer kialakulását.

A közelmúltban végzett elemzés (MALS és SAXS segítségével) kimutatta, hogy a CARD-komplex képződése koncentrációfüggő, és az Apaf-1 és a pc-9 CARD-ok azonos mennyiségű párként társulnak az erősebb I. típusú határfelületen keresztül, és nagy koncentrációjú oldatban túlnyomórészt 3:3 komplex képződik . Ezt a CARD-komplexet kristályosítottuk, és a szerkezetet 3,0 Å felbontással meghatároztuk, hogy egy három Apaf-1/pc-9 CARD-párból álló baloldali spirált fedezzünk fel, amelynek konformációja hasonló az apoptoszómában megfigyelthez, de néhány eltéréssel (PDB 5WVC; 2e. ábra) . A kristályban lévő környezet azonban egészen más, mint az összeszerelődő apoptoszómán tapasztalt környezet, részben a rácskontaktusok és a CARD-NBD linkerek által előírt korlátozásokkal rendelkező nukleáló felület hiánya miatt. Ez magyarázhatja a helikális CARD-szerkezetek között megfigyelt különbségeket. Ez magában foglalja egy vagy két extra CARD hozzáadását a holo-apoptoszóma korongszerű spiráljához, valamint azt, hogy a korong alapját négy Apaf-1 CARD alkotja, nem pedig három, mint az oldatban és a kristályban talált három. A 8 CARD-os korong és a kristályszerkezetből származó 6 CARD-os spirál optimális összehangolása után a 2p, 3a és 4p pozíciókban lévő CARD-ok között jó egyezést találunk, némi eltéréssel a 6 CARD-os spirál második felében (2f, g ábra). Különösen a 7a pozícióban lévő Apaf-1 CARD függőlegesen egy köztes pozícióba helyeződött el, az 1a pozícióban lévő Apaf-1 CARD hiányában (2g. ábra). Így a platform és a CARD-lemez közötti kölcsönhatások kritikusak az apoptoszómán található nagyobb 7 és 8 CARD spirálok nukleációjához.

A lemez összeszerelése során a spirál nukleációja különböző módon történhet, beleértve egy CARD heterotrimer kialakulását, amely két Apaf-1 CARD-ból és egy pc-9 CARD-ból áll, és egy Apaf-1 CARD található a spirál alján (az 1a pozícióban). Ezt követően két Apaf-1/pc-9 CARD pár hozzáadása következhet be, amelyek az I. típusú interfészükön keresztül lépnek kölcsönhatásba, majd a spirál végső lezárása a 8p pozícióban lévő pc-9 CARD-dal történik egyes esetekben. Az Apaf-1 CARD-NBD linker rugalmas természete miatt azonban más permutációk is lehetségesek, így három Apaf-1/pc-9 CARD “I. típusú” pár egymás után nukleálódhat a központi hubból, egy Apaf-1 CARD hozzáadásával a spirál alján (az 1a pozícióban), az összeszerelés korai szakaszában. Fontos, hogy a korong összerakása kooperatív lehet annak érdekében, hogy a spirál alapját képező négy Apaf-1 CARD megfelelő távolságban maradjon az apoptoszómán .

Az aktív apoptoszóma esetében egy jelentős különbség figyelhető meg a központi hubon, ha összehasonlítjuk a publikált szerkezeteket (3. és 4. ábra) . Röviden, a pc-9 katalitikus doménjeként azonosított sűrűség (p20/p10) a központi hubon helyezkedik el egy nemrégiben készült 3D térképen, és ezt a jellemzőt a komplexek mintegy 50%-ában találták jelen lévőnek . Ezenkívül egy hasonló sűrűség láthatóvá vált a holo-apoptoszóma egy korábbi, alacsonyabb felbontású térképén, amely lehetővé tette a p20/p10 alegységek ésszerű, bár előzetes dokkolását ; így a megfigyelt jellemző reprodukálható. Ez az újszerű sűrűség azonban csak alacsony felbontáson vált láthatóvá, ami a p20/p10 alegységek központi hubhoz való kapcsolódásának bizonyos rugalmasságát tükrözheti. A Yigong Shi csoportja által meghatározott, közel atomi felbontású térképen egy további sarló alakú sűrűséget oldottak fel ~ 7 Å felbontásban a központi hubon, a CARD lemez szomszédságában. Ez a sűrűség egyértelműen tartalmaz egy további pc-9 CARD-ot a középpontban, amely kölcsönhatásba lép a két oldalán elhelyezkedő két Apaf-1 CARD-dal, a két kristályszerkezetben megfigyelthez hasonló módon. Ezt a heterotrimer konfigurációt azonban csak a részecskék ~ 10%-ában sikerült felbontani . Úgy tűnik tehát, hogy a minta előkészítése és a rácsfagyasztás során a kísérleti körülmények befolyásolhatják azt, hogy a pc-9 hogyan lép kölcsönhatásba a központi hubon lévő potenciális kötőhelyekkel, beleértve a változó számú pc-9 CARD-okkal rendelkező korongszerű spirál kialakulását és az akcentrikus korong mellett elhelyezkedő kötőhelyek használatában. Ha a holo-apoptoszóma két újabb aszimmetrikus szerkezetét a CARD korongok alapján igazítjuk egymáshoz, a központi hubon elhelyezkedő újszerű sűrűségcsúcsok egészen eltérő helyeken találhatók (4. ábra). Míg a pc-9 katalitikus domén (p20/p10) két pozícióban is elhelyezkedhet (a legvalószínűbbet a 4c. ábra mutatja) , a három CARD-sűrűség elfordul és oldalról nézve (nem látható) más profillal rendelkezik, mint a pc-9 katalitikus domén (4b., d. ábra). Az Apaf-1 CARD-NBD linker sűrűségének mintázata lehetővé teszi az összes releváns CARD-NBD linker pontos feltérképezését a három CARD-os holo-apoptoszómában, hat rendezett Apaf-1 CARD-dal (4d. ábra) . Kritikusan fontos, hogy a linkerek hossza (~ 25-30 Å) és a linkerek relatív helyzete kizárhatja a három CARD modul kötődését a központi hub 1-es vagy 2-es pozíciójához. Így úgy tűnik, hogy a központi hubon több olyan hely van, amelyek különböző módon használhatók egy pc-9 CARD vagy egy katalitikus domén kötéséhez.

A becslések szerint a procaszpáz-9 7 Apaf-1 molekulára 2-5 zimogén közötti arányban kötődik az apoptoszómához , így úgy tűnik, hogy az apoptoszómához kötött pc-9 molekulák pontos száma az összeszerelés során a körülményektől függően változhat, ami e proteolitikus gépezet dinamikus természetét tükrözheti. Tágabb értelemben egyértelműnek tűnik, hogy egy hatodik vagy hetedik pc-9 CARD-ot nem kötnek meg Apaf-1 társaik, az apoptoszómán már dokumentált helyekhez képest, ami vagy sztérikus korlátozást, vagy a nagyobb oligomer szükségességét tükrözheti a kötött pc-9 CARD-ok stabilizálásához. Fontos, hogy néhány pc-9 katalitikus domén nem látható a jelenlegi krio-EM sűrűségtérképeken, a hosszú CARD-p20 linkereken keresztül történő rugalmas rögzítésük miatt, ami megnehezíti az aktiválás pontos mechanizmusainak megfejtését és megértését, miközben rávilágít a további egymolekulás vizsgálatok szükségességére.

Az apoptoszóma elsődleges funkciója a pc-9 aktiválása, hogy az apoptózist hajthasson végre. Míg a szerkezeti vizsgálatok betekintést nyújtottak a pc-9 aktiválásának rekrutációjába és követelményeibe, egy sor biokémiai vizsgálat mostanra kimutatta, hogy mind a közelség-indukált dimerizáció, mind a monomer pc-9 alloszterikus szabályozása kritikus fontosságú az apoptoszóma működésének szabályozásában, és az apoptoszóma aktivitásának időtartamát is meghatározhatja. Először is, a pc-9 rekrutációja az apoptoszóma által megnöveli a helyi koncentrációját, hogy lehetővé tegye a homodimerizációt, ami növeli a komplexhez való affinitását . Érdekes módon a nem tisztítható pc-9 nagyobb hajlamot mutat a homodimerizációra, és az apoptoszómán belül fokozott proteáz aktivitást mutat (kaszpáz-3 hasítás), mint a hasított kaszpáz-9 . Ennek következtében a katalitikus domén p20/p10 alegységek közötti linkerének hasadása csökkenti a pc-9 affinitását az apoptoszómához, és a feldolgozást követően a kaszpáz-9 felszabadul, és nem kötődik újra az apoptoszómához. Fontos, hogy ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a pc-9 homodimerizációja az aktiváláshoz szükséges kulcsfontosságú esemény, és hogy az apoptoszóma ezt az eseményt elősegíti. Ez összhangban van más CARD kaszpázok, például a kaszpáz-2 és a Dronc biokémiai vizsgálataival, ahol a kezdeti aktiváláshoz dimerizációra van szükség, nem pedig a zimogén hasítására . A pc-9 apoptoszómához való kötődésének stabilizálása nemcsak CARD-CARD kölcsönhatásokat igényel, hanem a pc-9 kis alegység (p10) GCFNF404 motívumán keresztül történő kölcsönhatásait is, hogy homo- és heterodimereket képezzen . Egyelőre nem világos, hogy a pc-9 homodimerképződés hogyan befolyásolja a CARD-CARD lemez stabilitását, mivel a katalitikus domén dimerek meglehetősen rugalmasnak tűnnek, mivel helyirányított trombinolízissel kioldhatók a holo-apoptoszómából, és a szimmetria nélkül finomított krio-EM térképeken nem oldódnak fel . A pc-9-ben lévő GCFNF motívum szintén kölcsönhatásba lép egy Apaf-1 NOD-dal, hogy pc-9/Apaf-1 heterodimert képezzen, amely hatékonyan hasítja a kaszpáz-3-at . Ezek az adatok arra utalnak, hogy a pc-9 katalitikus doménje, amely közvetlenül kölcsönhatásba lép az apoptoszómával, aktív lehet. A kaszpáz-3 hasításának ez a feltételezett aktív helye megfelelhet a központi hubon megfigyelt újszerű sűrűségnek, amelyet p20/p10 molekulaként értelmeztek, és további vizsgálatok szükségesek ezen a ponton. Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a pc-9-nek két különböző aktív konformációja lehet az apoptoszómán belül: egy vagy esetleg két homodimer kötődik a CARD lemezhez, és egy pc-9/Apaf-1 heterodimer kötődik a központi hubhoz. Ha a központi hubhoz kötött három CARD-modullal rendelkező holo-apoptoszómákat is figyelembe vesszük, akkor legalább hat permutáció lehetséges a három-öt pc-9 katalitikus domén elrendezésére (5. ábra). Így a lehetséges aktív pc-9 katalitikus domének száma (homodimerek és heterodimerek formájában) az apoptoszómába rekrutált pc-9 molekulák számától függően változik, mivel azok az Apaf-1 CARD-ok által közvetített lehetséges kötőhelyeket töltik ki.

Végezetül a pc-9 kaszpáz-3 általi teljes hasítása eltávolítja az alegységek közötti linkert és visszaállítja a teljes kaszpáz-9 aktivitást, ami arra utal, hogy a kaszpáz-3 proteolitikus visszacsatolással is rendelkezik a pc-9-re, ami felerősítheti az apoptotikus jelet . Hasonló mechanizmust javasoltak a kaszpáz-2 esetében is . Ezek a biokémiai vizsgálatok továbbá bemutattak egy molekuláris időzítő modellt, amelyben a kaszpáz-9 apoptoszómából való disszociációjának sebességét a p20-p10 linker kezdeti hasadása határozza meg, ami csökkenti az apoptoszóma kötési affinitását . A hasított kaszpáz-9 teljes disszociációjához a holo-apoptoszómából azonban a CARD-jának a lemez vagy a három CARD modulból való felszabadulása szükséges. Így az aktív kaszpáz-9 molekulák felszabadulásának lehet egy hierarchiája, amely a CARD-ok helyi környezetétől függ. A CARD korong kialakítása, amelyben az összes pc-9 CARD a felső felületen helyezkedik el, szintén megkönnyítheti a kaszpáz-9 felszabadulását.