A baicalin és természetes analógjai oxigén- és glükózhiányos neuronokra gyakorolt hatásának összehasonlító vizsgálata a TLR2/TNF𝛼

Abstract

A munka célja a baicalin és három analógjának vizsgálata, baicalin, wogonoside és wogonin, a neuronok oxigén-glükózmegvonással (OGD) szembeni védőhatását és a toll-like receptor 2 (TLR2) expresszióját az OGD károsodásában. Az eredmények azt mutatták, hogy a baicalin és három analógja valóban megvédte a neuronokat az OGD károsodástól és lefelé szabályozta a TLR2 fehérjeszintjét. A szerkezet 7-es helyén lévő D-glükopiranosziduronsav játszotta e flavonoid analógok citotoxicitásának magját. A szerkezet 8. szénatomján lévő metoxilcsoportnak kapcsolata volt a TLR2 fehérje expressziójával, valamint a gyulladáscsökkentéssel. Ezenkívül kimutattuk a kaszpáz3 és az antioxidációs képességet, hogy megvizsgáljuk a négy analóg hatását a sejt apoptózisára és a teljes antioxidációs kompetenciára OGD modellben.

1. Bevezetés

Scutellariae radix, egy kínai gyógyszer, különböző farmakológiai hatásokkal rendelkezik, mint például antibakteriális, vírusellenes, gyulladáscsökkentő, antioxidációs és antistroke a klinikumban . Hatóanyaga egyfajta flavonok, amelyek baicalinból, baicaleinből, wogoninból és wogonisidból állnak röviden (1. ábra) . Arról számoltak be, hogy a Scutellariae radix védi az idegsejteket az iszkémia és a reperfúzió okozta sérüléstől . A baicalin, a flavonok fő összetevője, megerősítette az iszkémia és a reperfúzió által okozott károsodás neuroprotektív hatását és a központi idegrendszerre gyakorolt hatását . A közelmúltban a baicaleint több helyen is vizsgálták ígéretes idegrendszeri hatásával. Azonban egyetlen jelentés sem mutatta be a baicalin és a TLR2 expresszió hatását az idegsejtekre. Néhány kutatás arról számolt be, hogy a wogonin és a wogonosid hatott a neuronokra . A baicalint és a baicaleint antioxidánsként vizsgálták; néhány modellben a baicalein még a baicalinnál is erősebb volt több szabad redialis csökkentésében . Összehasonlítva őket, a baicalein és a baicalin jelentősen mérsékelte a hidrogén-peroxid által kiváltott sejtsérülést, de a wogonin és a wogonosid gyengébben hatott . Ez azt sugallja, hogy a wogonin és a wogonozid neuroprotektív hatásának más mechanizmusai is lehetnek.

1. ábra

A baicalin és természetes analógjai, a baicalein, a wogonozid és a wogonin kémiai szerkezete.

Amint a baicalin és a baicalein gyulladáscsökkentő hatását megerősítették, a veleszületett immunválaszra vonatkozó kutatásokat agyi iszkémiás reperfúzióban tanulmányozták, és bemutatták az okot, részben miért a baicalin és a baicalein gyulladáscsökkentő hatása volt az agy iszkémiás reperfúziós károsodással szembeni védelmének egyik fő próbája . A glia iszkémiás reperfúziós károsodásának kulcsfontosságú célpontjaiként számos receptort jelöltek meg, mint például az útdíjszerű receptorok (TLR-ek) és a NOD-ok (nukleotidkötő oligomerizációs domén) . Korábbi kísérletünk azt mutatta, hogy a baicalin mérsékelte a NOD2 és a TNFα expresszióját az iszkémiás és reperfúziós károsodással járó neuronokban in vivo és in vitro . A wogonozidról a lipopoliszacharid által indukált angiogenezis gátlásáról számoltak be a 4. toll-szerű receptor (TLR4) jelátvitelén keresztül . A TLR2-t azonban nem vizsgálták a baicalin és természetes analógjai.

A korábban említett információk alapján megvizsgáltuk a baicalin és analógjai szabályozási viselkedését egyfajta neuronsejt PC12-n keresztül, hogy feltárjuk a baicalin és analógjai lehetséges célpontjait a veleszületett immunreakciókban az oxigén- és glükózmegvonás (OGD) során, valamint a kémiai szerkezet és a hatás közötti kapcsolatokat a baicalin és természetes analógjai között. Mivel a TLR2 a veleszületett immunitás egyik kezdeti receptora, és a gyulladásos aktivációt, valamint a TNFα-t a baicalin gátolni tudja a tüdősejtekben , a TLR2 és a TNFα fehérjeexpresszióját vizsgáltuk, hogy kiderítsük a baicalin és analógjai szerepét ebben az idegsérülési modellben. Eközben a kaszpáz3 az apoptózis jól ismert mutatója, és számos tanulmány arról számolt be, hogy néhány flavon képes kiváltani a gyulladásos sejtek apoptózisát , ezért kimutattuk a kaszpáz3 fehérje expresszióját. Ezenkívül a négy analóg hatását a sejtek teljes antioxidációs képességére az OGD modellben is kimutattuk ebben a tanulmányban, amely tovább hasonlította össze ezen flavonok teljes kompetenciáját .

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vegyszerek és anyagok

A baicalint (tisztasága 98% volt) Dr. Lujun Zhang, a Tsinghua Egyetem Gyógyszerészeti Tudományok Laboratóriumának munkatársa mutatta be. A wogonozidot (tisztasága 98% volt) Dr. Xiuwei Yang, School of Pharmaceutical Science, Pekingi Egyetem mutatta be. A 98%-os tisztaságú baicaleint és wogonint (tételszám: 111595-200604 és 111514-200403) a Kínai Nemzeti Gyógyszerészeti és Biológiai Termékeket Ellenőrző Intézettől vásárolták. A kísérlet során végig deionizált vizet használtunk. A többi szerves oldószer és reagens analitikai-reagens minőségű volt. A pH7,4-es PBS puffert laboratóriumunkban állítottuk elő. A PC12 sejteket a Kínai Orvosi Tudományos Akadémia Alapgyógyászati Intézetének sejtbankja (Peking, Kína) biztosította. A magzati szarvasmarha szérumot (FBS) és az RPMI 1640 táptalajt a GIBCO-tól vásároltuk. Az anti-TLR2/TNFα/caspase3/β-aktin antitesteket a Santa Cruz Company-tól (USA) vásároltuk. A másodlagos ellenanyagot a Zhongshan Company-tól (Peking, Kína) vásároltuk. A teljes antioxidációs képesség (T-AOC) kimutatására szolgáló készletet a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) vásároltuk.

2.2. Az antioxidációs képesség kimutatására szolgáló készletet a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) szereztük be. Sejtkultúra

APC12 sejteket kb. 1 × 106 sejt/ml-re állítottuk be, 2 ml-t beoltva 6 lyukú lemezek (Costar) minden egyes lyukába, 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS) és 5% lószérummal és penicillinnel/streptomicinnel (egyenként 100 U/ml) kiegészített RPMI 1640-ben. A sejteket párásított inkubátorban (5% CO2) (Sanyo, Japán) 37°C-on tenyésztettük, és legalább 48 órán keresztül hagytuk, hogy rögzüljenek.

2.3. In vitro citotoxicitási vizsgálatok

A baicalin és három analógjának a sejtek számára biztonságos dózisát MTT (metil-tiazol-tetrazolium) teszttel értékeltük in vitro. A 96 lyukú lemezekben 24 órás sejtinkubáció után baicalint és analógjait 10 mg/ml és 0,001 mg/ml közötti dózisban adtuk hozzá. A vegyületek hozzáadása után 24 órával a 96 lyukú lemezekben lévő táptalajt MTT-vel (5 mg/ml, 200 μL/lyuk) inkubáltuk 37°C-on 4 órán keresztül, majd a táptalajt óvatosan leszívtuk, és lyukanként 200 μL dimetilszulfoxidot (DMSO) adtunk a kék formazántermékek feloldásához. A 490 nm-en mért abszorbancia értékeket mikrolemez olvasóval (Model 550，Bio-Rad，USA) mértük. A tesztgödrök abszorbanciaeredményeit élő sejtként fejeztük ki. Az 50%-os citotoxicitási koncentrációt (CC50) kiszámítottuk .

2,4. Sejtek oxigén-glükózmegvonásra

Az oxigén-glükózmegvonáshoz (OGD) a növekedési táptalajt glükózmentes táptalajra cseréltük (2 ml/lyuk) és a lemezeket egy 95% N2/5% CO2-t tartalmazó inkubátorba (YCP-30Q, Changsha, Kína) helyeztük 37°C-on 120 percre. Ezután a sejteket visszahelyeztük a normál tápközegbe, és normál körülmények között, 37°C-on (Sanyo, Japán) inkubáltuk a későbbi kísérletekhez meghatározott ideig. Az oxigéntől és glükóztól nem megfosztott kontroll sejtkultúrákat normál körülmények között, glükózt tartalmazó tápfolyadékban inkubáltuk.

A vegyületek OGD-károsodástól védő hatására a sejtélettani vizsgálatot a korábban leírtak szerint végeztük. A 96 lyukú lemezekben történő 24 órás sejtinkubáció után baicalint és analógjait adtuk hozzá a 10 mg/ml és 0,001 mg/ml közötti dózisokban. A vegyületek hozzáadása után 24 órával a 96-lyukú lemezekben lévő táptalajt MTT-vel (5 mg/ml, 200 μL/lyuk) inkubáltuk 37°C-on 4 órán át. A táptalajt óvatosan leszívtuk, és 200 μL DMSO-t adtunk hozzá lyukanként a kék formazántermékek feloldásához. A 490 nm-en mért abszorbanciaértékeket mikrolemez-olvasóval mértük. A tesztgödrök abszorbanciaeredményeit élő sejtként fejeztük ki. Kiszámítottuk az 50%-os hatásos koncentrációt (EC50). A vegyületek citotoxicitásával (CC50) kombinálva a biztonsági indexeket (SI) az EC50/CC50 értékkel számoltuk ki .

A TLR2/TNFα és kaszpáz3 vizsgálathoz a baicalin és analógjainak minimális biztonsági koncentrációját 10 μg/ml-ben rendeltük el. Ezeket a vegyületeket (10 μg/ml) akkor adtuk hozzá, amikor a táptalajt glükózoldatra cseréltük, és a sejteket normál körülmények között tenyésztettük. A sejteket a baicalin és analógjai hozzáadását követő meghatározott reperfúziós időben (0,5, 1, 1, 3, 6 óra) vettük fel a fehérjekísérlethez. A kontrollban hordozóként médiumot használtunk, és a sejteket a 6 órás reperfúziós időben vettük fel.

2.5. A minták elkészítése

Kontrollként két gyógyszer nélküli csoportot alkalmaztunk. A sejtek egy csoportját normál növekedési táptalajjal ellátott táptalajba ültettük a teljes kísérleti folyamat alatt, oxigén-glükózmegvonás nélkül. A második csoportot oxigén-glükózmegvonásos folyamatot tartalmazó tápfolyadékba vetettük, mint modellkontrollt. Minden egyes időpontban a sejtmintát az előzőekben leírtak szerint készítettük el. A tápfolyadékot minden egyes lyukból kivettük, és a sejteket háromszor mostuk hideg PBS-szel (pH 7,4), majd 100 μL RIPA-t használtunk a teljes fehérje összegyűjtéséhez a Western blottinghoz.

2.6. Western Blot

Western blot vizsgálat a β-aktin, a TLR2, a TNFα és a kaszpáz3 fehérjeexpressziójára a következőképpen hivatkoztunk minimális módosítással: a mintákat a gélbe töltöttük (10%), a marker (a Fermentas Republic of Lithuania-tól vásárolt) és a gél végére ment. Az átvitelnek 60 percig félszáraznak kell lennie 12 volton és 280 mA-en. Ezután a membránt 10%-os tejjel PBST-ben (1 × PBS + 0,1% Tween20) 60 percig szobahőmérsékleten lassan rázva blokkoltuk. A membránt 1 mL PBST-be helyeztük 1 : 1000 hígítású ellenanyaggal, 60 percig szobahőmérsékleten rázógépen inkubáltuk, majd az elsődleges ellenanyag inkubálása után 3-szor mostuk PBST-vel. Ezt követően a membránt 60 percig PBST-ben inkubáltuk az 1 : 3000 koncentrációjú másodlagos ellenanyaggal. A membránt 3-szor mostuk PBST-vel utoljára.

2,7. Teljes antioxidációs képesség kimutatása

A kísérlet elve a Fe3+ Fe2+ -ra történő redukcióját követő színváltozás kimutatása volt a mintákban lévő redukáló komponensek által. A redukáló komponensek közé tartozhatnak az enzimes és nem enzimatikus molekulák, mint például a lipidoldékony antioxidáns E-vitamin és a vízoldékony antioxidáns C-vitamin, a bilirubin és a húgysav. Ezután az optikai sűrűséget 520 nm-en mértük mikrolemez olvasóval . A sejtmintát az előző leírással megegyező módon készítettük el, és a baicalin és analógjai hozzáadása után a meghatározott reperfúziós időben (6 óra) vettük fel. A tápfolyadékot minden egyes lyukból kivettük, és a sejteket háromszor mostuk hideg PBS-szel (pH 7,4). Ezeket a lemezben lévő sejteket többszöri fagyasztással és felolvasztással PBS-szel (1 ml/lyuk) oldottuk fel. A felülúszót 12 000 rpm/perc centrifugálás után gyűjtöttük a T-AOC vizsgálathoz.

2.8. Adatelemzés

Minden értéket átlag ± S.D. Az adatokat ANOVA-val elemeztük statisztikailag. Adott esetben a Newman-Keuls-összehasonlításokat használtuk a szignifikáns különbségek forrásának meghatározására. A 0,05 alatti P-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették. A CC50 és EC50 kiszámításához a CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) szoftvert alkalmaztuk.

3. Eredmények

3.1. Sejtnövekedési profil

A sejteket a 10% FBS-t tartalmazó tápfolyadékkal ellátott lemezekbe vetettük 48 órán keresztül. A sejteket addig nem használtuk fel a kísérletekhez, amíg jól meg nem nőttek és szorosan nem kapcsolódtak egymáshoz a multiwell lemezek lapjában.

3.2. A citotoxicitás MTT-vizsgálata

A baicalin és analógjai citotoxicitásának vizsgálata és a biztonságos dózisok meghatározása érdekében PC12 sejteken in vitro MTT-vizsgálatot végeztünk. A kísérletek alapján a baicalin és a wogonozid 10 μg/ml koncentrációja volt a legnagyobb biztonsági koncentráció normál PC12 sejteken, és a baicalin és a wogonozid 1 μg/ml koncentrációja volt a legnagyobb biztonsági koncentráció normál PC12 sejteken (2. ábra).

(a)

(b)

.
(a)
(b)

2. ábra

A baicalin citotoxicitása, wogonozid, baicalein és wogonin hatása normál PC12 sejtekben (MTT-teszt). A 96 lyukú lemezekben történő 24 órás sejtinkubáció után a vegyszereket 10 mg/ml és 0,001 mg/ml közötti dózisban adtuk hozzá. *𝑃<0,05 a normál kontrollhoz képest. Az adatokat hét független kísérlet átlaga ± S.D. értékeként adtuk meg.

Az oxigén-glükózmegvonással kezelt PC12 sejtekben a normál kontrollhoz képest (𝑃<0,05) csak kevesebb mint 40 % sejt maradt életben. A modellkontrollal összehasonlítva a baicalin és a wogonin minimális hatásos koncentrációja (MEC) 10 μg/ml volt, míg a wogonosid és a baicalein MEC-je 1 μg/ml volt. A baicalin és a woronin maximális hatásos koncentrációja (MAXEC) 1 mg/ml volt, ami azt jelenti, hogy biztonságosságuk azonos. A wogonozid MAXEC értéke 1 mg/ml volt, de a baikalein MAXEC értéke csak 10 μg/ml volt. Ez azt sugallta, hogy a baicalein citotoxikusabb, mint a wogonozid. Mindezek a vegyületek nem mutattak koncentrációfüggő módon egyértelműen (3. ábra).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

3. ábra

A baicalin védelme, wogonozid, baicalein és wogonin hatása PC12 sejtekben oxigén-glükózmegvonással (OGD) (MTT-teszt). A 96 lyukú lemezekben történő 24 órás sejtinkubáció és 2 órás oxigén-glükózmegvonás után a vegyületeket 1 mg/ml és 0,001 mg/ml közötti dózisban adtuk hozzá. #𝑃<0,05 a normál kontrollhoz képest. *𝑃<0,05 a modellhez képest. Az adatokat hét független kísérlet átlaga ± S.D. értékeként adtuk meg.

A baicalin CC50-je (188,4 μg/mL vagy 0,422 mmol/l) nagy különbségeket mutatott a másik három vegyülethez képest. A baicalein nagyobb sejttoxicitást mutatott, a CC50 8,9 μg/mL (0,0329 mmol/L-nek felel meg). A wogonin és a wogonozid hasonló toxicitást mutatott, CC50 10,6 μg/mL (egyenlő 0,0373 mmol/L) és 13,7 μg/mL (egyenlő 0,0298 mmol/L). A baicalein azonban hatékonyabban védte a sejteket az OGD károsodástól. A baicalein minimálisan hatékony dózisa 1 μg/ml (0,0037 mmol/l) volt. A baicalin EC50-értéke 1,2 μg/mL volt (0,0027 mmol/L-nek felel meg), a wogonin és a wogonozid EC50-értéke pedig 4 volt.3 μg/ml (0,0151 mmol/l) és 7,4 μg/ml (0,0161 mmol/l). A toxicitás és a hatás összehasonlítása során a négy vegyület biztonsági indexe 156 (baicalin), 8,89 (baicalein), 2,47 (wogonin) és 1,85 (wogonosid) volt (1. táblázat).

3.3. táblázat. Hatás a TLR2, a TNFα és a kaszpáz3 kifejeződésére

Az OGD által sérült sejtekben a TLR2 és a TNFα fehérjék egyértelműen kifejeződtek, ami azt jelenti, hogy az OGD serkentette a veleszületett immunreakciót, gyulladást okozva. A kaszpáz3 fehérje az OGD modellben bizonyos mértékben felszabályozódott, de nem volt szignifikáns statisztikai érték (4. ábra). A baicalin 3 órával a beadás után mérsékelte a TLR2 és a TNFα fehérje expresszióját. Amikor a baicalin 0,5 órán keresztül fejtette ki hatását, a TLR2 expressziója statisztikai szignifikanciát mutatott, függetlenül attól, hogy a normálishoz képest vagy a modellel összehasonlítva (𝑃<0,05), és az 1 órás TLR2 expressziója nőtt (a normálishoz képest, 𝑃<0,05); azonban a 3 órás vagy 6 órás expressziója nem mutatott nyilvánvaló különbséget a normálishoz képest (a modellel összehasonlítva, 𝑃<0,05). A TNFα 0,5 h kifejeződése még mindig magasabb volt, mint a kontroll (𝑃<0,05), és az 1 h, 3 h és 6 h kifejeződése nyilvánvalóan lecsökkent, ami szignifikáns különbséget mutatott a modell szintjéhez képest (𝑃<0,05). A baicalin nyilvánvalóan nem befolyásolta a fehérje kaszpáz3 expresszióját, amit a 4. a) ábra mutat.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

4. ábra

A négy analóg hatása a TLR2 fehérje expressziójára, TNFα és a kaszpáz3 expressziójára PC12 sejtekben oxigén-glükózmegvonás (OGD) hatására. A fehérjeszintet Western blot segítségével mértük. A modell oxigén-glükózmegvonással történő kezelést jelent. A 0,5, 1, 3 és 6 óra az OGD utáni reperfúziós folyamat idejét jelenti. (a) a baicalin hatását jelenti; (b) a wogonosid hatását jelenti; (c) a baicalein hatását jelenti; (d) a wogonin hatását jelenti. A baicalint, a wogonosidot és a wogonint 10 μg/ml koncentrációban, a baicaleint pedig 1 μg/ml koncentrációban használtuk. *𝑃<0,05 a normál kontrollhoz képest. #𝑃<0,05 a modellcsoporttal szemben. Az adatokat három független kísérlet átlaga ± SD értékeként adtuk meg.

A wogonozid (10 μg/mL) hozzáadása után a TLR2 és a TNFα nyilvánvalóan downregulálódott. A TLR2 expressziója jóval alacsonyabb volt, mint a modellben, még a normál szintnél is (𝑃<0,05). Ennek megfelelően a TNFα expresszióját a wogonozid láthatóan gátolta a beadást követő 0,5 órától a 6 órás időpontig (𝑃<0,05). A wogonozid nem mutatott nyilvánvaló hatást a kaszpáz3 expressziójára sem (4. ábra (b)).

A baicalein beadása után a TLR2 még 0,5 órával és 1 órával a baicalein hozzáadása után is szignifikánsan szabályozott volt (𝑃<0,05), majd 3 órára és 6 órára a normál értékre csökkent. A modellel összehasonlítva a TNFα 0,5 órakor szabályozott volt, majd később fokozatosan csökkent. A TLR2-hez hasonlóan 3 órakor és 6 órakor a normális szintre csökkent a kifejeződése (4. ábra (c)).

A wogonin csoportban a két faktor nyilvánvalóan csökkent. A TLR2 a wogonin hozzáadása után 0,5 órával a normális szintre csökkent (összehasonlítva a modellel, 𝑃<0,05), és a kísérlet folyamán alacsonyabb szinten maradt. A 0,5 órás és 1 órás időpontokban a TNFα a normálisnál nagyobb mértékben (𝑃<0,05), de a modellnél kisebb mértékben (𝑃<0,05) fejeződött ki, 3 és 6 órakor pedig a TLR2-expresszióhoz hasonlóan megközelítette a normális szintet (4. ábra (d)).

A baicalin és a wogonozid csoportokhoz hasonlóan a kaszpáz3 expressziója nem mutatott jelentős változást a baicalein és a wogonin csoportokban (4(c) és 4(d) ábra).

3.4. A teljes antioxidációs kompetencia (T-AOC)

A T-AOC-kitet felhasználva megállapítottuk, hogy a normál sejtek antioxidációs kompetenciája körülbelül 2,5 U/mg volt, és az egyik oxigén-glükózmegvonással kezelt sejteké messze 0,5 U/mg alatt volt. A baicalin csoportban a kimutatási érték 1,8 U/mL volt, ami jelentős különbséget mutat, függetlenül a normál vagy az OGD modellel való összehasonlítástól. A wogonozid, baicalein és wogonin csoportokban az értékek 1,6, 0,8, illetve 0,6 U/mg voltak, amelyek mind szignifikáns különbséget mutattak a normál vagy a modellel összehasonlítva (5. ábra).

5. ábra

A baicalin és három analógjának hatása az oxigén-glükózmegvonással kezelt PC12 sejtek teljes antioxidációs kompetenciájára. A modell oxigén-glükózmegvonással történő kezelést jelent. A baicalint, a wogonozidot és a wogonint 10 μg/ml koncentrációban, a baicalint 1 μg/ml koncentrációban használtuk. **𝑃<0,01 a normál kontrollhoz képest. ##𝑃<0,01 a modellcsoporthoz képest. $$𝑃<0,01 a baicalin és a wogonosid csoporttal szemben. Az adatokat nyolc független kísérlet átlaga ± S.D. értékben adtuk meg.

4. Megbeszélések

A baicalin a baicaleinből származó glikozilált vegyület, és a baicalein 7. helyén D-glükopiranosziduronsav funkciós csoportot tartalmaz (1. ábra), így több biológiai funkciót mutat. A baicalin alapszerkezete benzopiránból áll, amelynek 5., 6. és 7. helyén három hidroxilcsoport található, a benzopirán másik oldalán pedig egy fenilcsoport (2. hely). A bazikalin a benzopirángyűrűn egy enolszerkezetet is tartalmaz a konjugáció fenntartása érdekében. A baicalin és a wogonin közötti két különbség a wogonin 8. szénatomján lévő metoxilcsoportban és a baicalin 6. szénatomján lévő hidroxilcsoportban rejlik. A baicalin három hidroxilcsoportja a hidrofilebb tulajdonságokért felelős lehet. Ezenkívül a wogonozid a wogonin glikozilált formája a D-glükopiranosziduronsavval a 7. szénatomon. Mind a négy vegyület szénváza hasonló, benzopirán szerkezetű, és az 5. szénatomon hidroxilcsoportot is tartalmaz; a baicaleinnek és a baicalinnak van hidroxilcsoportja a 6. szénatomon, míg a wogonin és a wogonozid nem; a baikaleinnek és a wogoninnak van hidroxilcsoportja a 7. szénatomon, míg a wogonozid és a baicalin mindkettő glikozilált a 7. helyen lévő hidroxilcsoporton; végül a wogonin és a wogonozid metoxilcsoporttal rendelkezik a 8. szénatomon, de a baikaleinnek és a baicalinnak nincs ilyen funkcionális csoportja.

A citotoxicitás és a neuroprotektivitás eredménye szerint a D-glükopiranosziduronsav a 7. helyen fontos volt a citotoxicitás csökkentésében, amelyben a baicalin kevésbé volt citotoxikus, mint a baicalein és a wogonosid kevésbé volt citotoxikus, mint a wogonin. A 8-as szénatomon lévő metoxilcsoport és a 6-os szénatomon lévő hidroxilcsoport volt a neuroprotektív hatást befolyásoló fő tényező, amely által a baicalin és a baicalein EC50 értéke kisebb volt, mint a wogonosidé és a wogoniné (1. ábra és 1. táblázat), miután beadták őket.

Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a TLR2 erősen expresszálódott az oxigén- és glükózmegvonás (OGD) károsodása során a PC12 sejtekben, ami arra utalt, hogy a receptor aktiválódott a károsodott neuronokban (4. ábra). A TLR2-t az immunválaszok és gyulladásos reakciók kulcsfontosságú közvetítőjeként azonosították, és a TNFα aktiválásán keresztül proinflammatorikus válaszokat közvetített. A receptor a normális szinthez képest jelentősen felszabályozott volt, ami azt jelzi, hogy csatlakozott az OGD által kiváltott neuronsérüléshez.

A kutatási irodalom alapján a TLR2 a központi idegrendszerben (CNS) a károsító jel közvetlen forrásaként és fontos potenciális terápiás célpontként ismerik fel . Eredményeink szerint a TLR2 és a TNFα expressziója nyilvánvalóan csökkent néhány órával a vegyületek hozzáadása után. Ugyanebben a profilban a TLR2 és a TNFα expressziója a wogoninnal és a wogonoziddal jobban gátolt volt, mint a baicalinnal és a baicaleinnel. Az expresszió gátlása 0,5 órával a wogonin és a wogonozid beadása után kezdődött; a TLR2 és a TNFα expressziójának gátlása azonban később, 3 órával a baicalin és a baicalein beadása után jelentkezett. Ezért a wogonin és a wogonozid a TLR2-vel szembeni preferenciát valósította meg. Kémiai szerkezetükkel kombinálva minden eredmény arra utalt, hogy a szerkezetben a 8. szénatomon lévő metoxilcsoport a TLR2 gátlás hatásának farmakofór hipotézise, amely a gyulladásgátlással kapcsolatos.

A TLR2 és TNFα túlnyomását feltételezve ezen analógok által, kimutattuk a kaszpáz3-at, hogy megerősítsük, hogy létezett-e apoptózis az analógok hozzáadásával. A normálishoz képest az OGD modellben a kaszpáz3 fehérje expressziója valóban megnövekedett bizonyos mértékben, de nem mutatott statisztikai különbséget. A négy analóg beadásával a kaszpáz3 fehérje szintje nem mutatott nyilvánvaló változást, bár a 6 órás időpontban csökkenő tendenciát mutatott, és közel volt a normál kontrollhoz (összehasonlítva a normál vagy a modellel, 𝑃>0,05). A fenti eredmények azt sugallták, hogy a sérült PC12 sejtek az OGD modellben nem mutattak nyilvánvaló apoptózist, és a négy analóg szintén nem tudott apoptózist indukálni a sérült PC12 sejtekben. A szakirodalom szerint a baicalin enyhítette a globális agyi iszkémiás reperfúziós sérülést a futóegérben antioxidatív és antiapoptotikus útvonalakon keresztül, és a baicalein és a wogonin egyaránt képes volt apoptózist indukálni az emberi hasnyálmirigyrákos sejtekben és a HL-60 leukémiás sejtekben. Ezért az e vegyületek által okozott apoptózissal kapcsolatos eredményeinket tovább kell tanulmányozni.

A T-AOC kimutatására hivatkozva megállapítottuk, hogy a teljes antioxidációs képesség szekvenciája baicalin és wogonosid > baicalein és wogonin volt, ami azt jelzi, hogy a baicalin és a wogonosid 2. helyén lévő glikozilált forma kulcsszerepet játszott a teljes antioxidációban.

Összességében a baicalin és három analógja átfogóan mutatta be a neuronsejtek védelmét az OGD károsodással szemben, valamint a TLR2 expresszió és a TNFα (a downstream faktor) gátlását, ami arra utal, hogy ezeket a vegyületeket a TLR2, az agyi károsodás egyik fő mechanizmusának megcélzásával a stroke terápiájában lehet felhasználni. Struktúra-aktivitás kapcsolat van közöttük a TLR2-t célzó gyógyszerek biztonságosságával, hatékonyságával és specificitásával. Ez az első alkalom, hogy a baicalint és természetes analógjait a TLR2 és a TNFα, valamint a T-AOC molekuláris célpontjain vizsgáljuk. Mindezek előnyösek lesznek az új gyógyszerek felderítésében és fejlesztésében.

A szerzők hozzájárulása

Az első két szerző egyenlő mértékben járult hozzá.

Köszönet

A szerző köszönetet mond laboratóriumuk minden tagjának. A tanulmányt részben támogatta a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (30801523, 81073092), a Kínai Nemzeti S&T Major Special Project for New Drug R&D (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008 és 2011ZX099101-002-11), valamint a Tsinghua Egyetem Laboratóriumának Speciális Alapítványa (LF 20103579).