A HIV-1 restrikció szerkezeti alapjainak megértése a teljes hosszúságú kettős domén által…domain APOBEC3G

Overall structural features of the fl rA3G

A fl kettős domén APOBEC fehérjék szerkezeti vizsgálatainak egyik fő akadálya a gyenge oldhatóság volt – a vad típusú formák gyakran nem homogén oligomerek vagy nagy aggregátumok formájában tisztulnak meg nagyobb koncentrációban. Annak érdekében, hogy jól viselkedő fl A3G-t kapjunk a szerkezeti meghatározáshoz, különböző főemlős fajokból származó A3G homológokat vizsgáltunk, és azt találtuk, hogy a rhesus majomból származó A3G (rA3G) jobb oldhatósággal rendelkezik. Két fl rA3G mutációs konstrukció (FKL és E/Q néven) jól viselkedő fehérjéket és kristályokat eredményezett különböző körülmények között (1. kiegészítő táblázat), amelyek 2,47 és 2,40 Å-ig diffraktáltak (1. és 2. kiegészítő táblázat, 1. kiegészítő ábra). További változtatások e két konstrukcióban javították az rA3G oldhatóságát és hozamát, beleértve a CD1 8 gyökös 8-as hurokjának a hA3G-CD2-ből származó 4 gyökös 8-as hurokkal való helyettesítését (mint az E/Q és FLK konstrukciókban is, 1. kiegészítő táblázat, Kiegészítő ábra. 1), további mutációkat F126Y a CD1 7-es hurokban, K180S/L184S a CD1 h6-on, és a CD2 3 hurok 8 gyökös delécióját (mint az FKL konstrukcióban, 1. kiegészítő táblázat, 1B. kiegészítő ábra). Meg kell jegyezni, hogy az rA3G K128-ja, amely a fajok közötti átvitel gátjaként működik, aszparaginsav-maradékká (D128) mutálódott, mint a humán A3G-ben (hA3G)36 . A konstrukciók katalitikus E259-Q/A mutációt is tartalmaznak a rekombináns fehérje expressziója során fellépő potenciális toxicitás elkerülése érdekében. A mutált maradékokat és a szerkezeten való elhelyezkedésüket az 1B. kiegészítő ábra mutatja. Mindkét szerkezetben a CD1 és a CD2 önálló doménekké hajtogatódik, amelyeket egy rövid, 5 maradékból álló linker köt össze (R194-D198 maradékok) (1a, b ábra). A két szerkezet az általános szerkezeti hasonlóság ellenére (1a., b. ábra) nyilvánvaló különbségeket mutat a CD2 konformációjában és a CD1 és CD2 közötti pakolási orientációban (1c. ábra, 2A. kiegészítő ábra).

Az rA3G FKL és E/Q szerkezetek mindegyike ugyanazt a kanonikus CD1 szerkezetet mutatja, és jól szuperponálnak egymásra (2B. kiegészítő ábra, rmsd 0,445 Å). Az egyes CD2 domének sokkal nagyobb konformációs különbségei 0,862 Å rmsd-t eredményeznek a szuperpozícióban. Az FKL és E/Q szerkezetek CD1 doménjükön keresztüli összehangolásakor az E/Q szerkezet CD2 doménje ~29°-os elfordulást mutat az FKL szerkezet CD2-jéhez képest, aminek következtében az E/Q CD2 doménje ~15 Å-vel lefelé és ~8 Å-vel a CD1 felé tolódik, és sokkal szorosabb pakolási kölcsönhatást eredményez a CD1-gyel (Kiegészítő 2. ábra A). A teljes CD1-CD2 pakolási határfelület eltemetett felülete ~623 Å2 az FKL szerkezet esetében és ~700 Å2 az E/Q szerkezet esetében. A szorosabb CD1-CD2 pakolás az E/Q szerkezetben csak valamivel nagyobb eltemetett felületet eredményez, mint az FKL szerkezetben, valószínűleg az újrahajtás és a CD2 határfelületet lokalizáló szerkezeti elemeinek (h2-hurok3) hiányzó sűrűsége miatt.

Kétféle CD1 és CD2 domén kölcsönhatás

Míg az FKL szerkezet a CD2 doménjének kanonikus hajtását mutatja (2C. kiegészítő ábra), addig az E/Q szerkezet jelentős változást mutat a CD2 konformációjában (2D. kiegészítő ábra), jelentős változásokkal a 2-es hélixen (h2), a 3-as hurokon, a 4-es hurokon és a Zn-aktív központon. A CD2 hosszú h2-je az FKL szerkezetben (Kiegészítő ábra 2C) az E/Q szerkezetben (Kiegészítő ábra 2D) rövid 310-es hélixszé (h2′) változott, ami egy rendezetlen, a 3. hurok és a h2 egyes részeit (A246-tól E259-ig terjedő 14 reziduumos szakaszhoz vezet (Kiegészítő ábra 1A). A rövid 310 h2 és a kiterjesztett véletlenszerű tekercsszerkezet felé történő elmozdulás szükséges az ütközés elkerülése érdekében ebben a szoros csomagolású konformációban (1e. ábra). Ez azonban megzavarja a CD2 Zn-aktív centrumának konformációját is a h2 és a 3. hurok rendezetlenné váló régióiban, ami nem eredményez Zn-koordinációt (Kiegészítő ábra 2D). A Zn-koordináció hiánya csak egyetlen másik APOBEC, az APOBEC3F (A3F) CD2 szerkezetében figyelhető meg46,47. A Zn-tartalmú vagy hiányzó A3F-CD2 szerkezetek azonban lényegében azonosak, amelyek több más APOBEC szerkezethez is jól illeszkednek (2E. kiegészítő ábra), míg az E/Q CD2 egyedi az újrahajtott 3. és 4. h2-hurok és a Zn-központú konformáció tekintetében (2E. kiegészítő ábra). 2E, F).

Míg lehetséges, hogy a Zn elvesztése és a CD2 újrahajtása az E/Q szerkezetben a konstrukcióban lévő mutációk eredménye, megvizsgáltuk, hogy az E/Q variánsnak van-e hibás katalízisaktivitása. Az E/Q konstrukcióban az E259Q visszafordítása a WT katalitikus E259-re (E/Q* konstrukció) visszaadta a variáns teljes aktivitását a HEK293T sejtek expressziós lizátjait használó deaminációs tesztben (3. kiegészítő ábra). Ezenkívül az F126Y, K180S/L184S vagy CD2Δloop3 (mint az FKL szerkezetben) egyedi mutációkat hordozó E/Q* mind aktív, bár a kombinált mutációkkal rendelkező FKL* konstrukció (E259A visszafordítva E259-re) aktivitása kisebb, mint az E/Q* és a WT esetében. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy bár a kristályosított E/Q szerkezet, amelyből hiányzik a Zn a CD2 doménből, katalitikusan inaktív A3G szerkezeti állapotot képvisel, a katalitikus maradék E259-re való visszafordítása teljes mértékben helyreállíthatja a WT-hez hasonló deamináz aktivitást. Az FKL kombinált mutációi részben befolyásolják a katalitikus aktivitást.

Az FKL és az E/Q struktúrákban az egyes domének közötti pakolás relatív forgási szöge közötti ~29°-os különbség miatt a CD1 és CD2 közötti részletes molekuláris kölcsönhatások különböznek a két struktúrában. A CD1 és CD2 domének az FKL szerkezetben elsősorban a CD1 h3, h4 és a 7-es hurokon, valamint a CD2 h1, h2, β2 és a 3. hurokon keresztül lépnek kölcsönhatásba egymással (1a, d ábra). Az E/Q szerkezetben a két domén elsősorban a CD1 h3, h4 és h6 hurokján keresztül lép kölcsönhatásba a CD2 h2′, β2, 4-es hurokján és 10-es hurokján keresztül (1b, e ábra). Ennek eredményeként a CD1 és a CD2 közötti kölcsönhatásban lévő maradékok mintegy 40%-a különbözik a két szerkezetben (a kölcsönhatásban lévő maradékok teljes listáját lásd a 4. kiegészítő ábrán), és még ha ugyanazok a maradékok vesznek is részt ebben a kölcsönhatásban, a két domén közötti pakolási szög megváltozása miatt gyakran eltérő kötési kapcsolatokat létesítenek. A CD1 és CD2 domének különböző szögekkel és maradék kölcsönhatásokkal történő pakolásának képessége a fl A3G domén elrendeződésének bizonyos fokú plaszticitására utal.

Teljes hosszúságú rA3G dimer és a dimerizációs terület jellemzői

Az E/Q konstrukciót különböző pH és só körülmények között kristályosítottuk (1. kiegészítő táblázat), de következetesen ugyanazt a szerkezetet és dimerizációt mutatta a CD1-CD1 kölcsönhatásokon keresztül (1. ábra). 2a, b), elsősorban a h6-on (K180, L184, A187), az 1. hurok (I26) és a 7. hurok (F126, W127) több maradékának közvetlen pakolása révén mindkét alegységből (Kiegészítő 5A, B ábra). Érdekes módon ezek a kölcsönhatások megegyeznek azokkal, amelyeket korábban csak az rA3G-CD1 doménre vonatkozóan jelentettek18 , annak ellenére, hogy a K128D mutációt is tartalmazzák, amely kritikus ahhoz, hogy az rA3G a HIV-1 Vif-érzékenyből degradációra érzékennyé váljon. Érdemes megjegyezni, hogy a fl rA3G ilyen dimerizációja csak a legnagyobb dimenzió kis mértékű növekedéséhez vezet, a monomer 85 Å-járól a dimer 95 Å-jára (2a, b ábra).

A dimer határfelület két oldalán elhelyezkedő maradékok részletes vizsgálata két kiemelkedő jellemzőt mutat. Először is, összesen 18 pozitív/poláris és hidrofób maradék sorakozik az rA3G dimer kapcsolódási pontja körül, olyan módon, amely alkalmas az egyszálú nukleinsavakkal, például az RNS-szel való kölcsönhatásra (2. ábra B inset). Ez a 18 maradék két halmazba rendeződött, az első halmaz az óramutató járásával megegyező irányban a felső monomertől (zöld színben) indulva: R24, H181, N177, N176, K180, majd az alsó monomerig (világoskék színben) W127, Y125, Y124 és S28, majd ugyanezen maradékok tükrözött halmazával. Másodszor, a dimerizáció révén az egyes monomerek R24 és a közeli pozitív maradékok K180 és H181 szorosan helyezkednek el térben, a két R24 maradék között körülbelül 7 Å távolság van. Ez a térbeli elrendeződés jelentősen megnöveli a helyi elektrosztatikus potenciálokat (EP), monomerként körülbelül +1,9 kT/e-ről dimerként +8,3 kT/e-re (2c. ábra és Inset C, 2d. ábra és Inset D). Az egyszálú nukleinsavak kötésére alkalmas, jól igazodó maradékok jelenléte, valamint a megfigyelt dimer csomópont körüli fokozott pozitív EP (PEP) erősen arra utal, hogy ez a terület dimerként kötheti az RNS-t, és arra utal, hogy ennek az A3G dimerizációs határfelületnek a megszakítása hatással lehet az RNS-kötésre azáltal, hogy a fokozott PEP (2c. ábra) a monomer formához hasonlóan alacsony PEP-re változik (2c. ábra). 2d).

Dimer mutáció hatása az RNS-asszociációra és a multimerizációra

A korábbi, csak a CD1 doménen végzett vizsgálatunk azt sugallta, hogy a dimer-interfész FWKL (F126, W127, K180, L184) maradékai részt vehetnek mind a dimerizációban, mind az RNS-kötésben, akár az RNS-szel való közvetlen kölcsönhatáson keresztül, akár közvetve, a dimerizáción keresztül egy RNS-kötő felület létrehozásával18. A fl rA3G dimer szerkezetének vizsgálata azt mutatja, hogy míg az FWKLA maradékok (F126, W127, K180, L184, A187) közvetlenül részt vesznek a dimerizációs kölcsönhatásokban (Kiegészítő 5A ábra), csak a W127 érhető el a pi-stacking vagy a nukleinsav-bázissal való hidrogénkötés számára, ami arra utal, hogy a W127 az, amely a dimerizációban és/vagy az RNS-kötésben kritikus kettős szerepet játszik, amit korábbi mutációs vizsgálatok is sugalltak15,18,40,48 .

A rA3G 7-es hurokja a dimerizációs interfész közelében található, és egy sor hidrofób maradékot tartalmaz (Y124, Y125 és F126), amelyek a W127-hez pakolnak és valószínűleg stabilizálják azt (5B kiegészítő ábra). Annak vizsgálatára, hogy szükséges-e a dimerizáció az RNS-asszociációhoz, és hogy figyelembe vegyük a W127 lehetséges kettős szerepét is, olyan rA3G dimer-felületi mutánsokat terveztünk, amelyek a 7-es hurkot változatlanul hagyták (3. kiegészítő táblázat, 5A, B kiegészítő ábra). Így csak a 7-es hurokon kívüli, eltemetett interfész-maradványokat mutáltuk, létrehozva az rM10, rM11 és rM15 mutánsokat (3. kiegészítő táblázat). Kontrollként egy olyan rM9 mutánst is bevontunk, amely a CD1 7-es és h6-os hurokján is tartalmazott változásokat (F126A-W127A-A187Y), amely várhatóan hasonló fenotípust eredményez, mint a CD1 korábban bejelentett FWKL mutánsa egyedül18; azaz mind a dimerizáció, mind az RNS-asszociáció megszakadását. Egy közel vad típusú rA3G (WT), amely a CD1 8-as hurokján szolubilitást fokozó hurokkapcsolással rendelkezik, és a megfelelő katalitikusan inaktív mutáns (konstrukció E/Q) is szerepelt (3. kiegészítő táblázat). E mutánsok RNS-asszociációját és oligomerizációs állapotát vizsgáltuk E. coliban történő rekombináns expresszió után.

Az E. coli sejtlízátokból végzett affinitási oszlopos tisztítást követően a sumo-rA3G fúziós fehérje RNS-asszociációját denaturáló karbamid-PAGE segítségével elemeztük (3a-c. ábra). Míg a WT és az E/Q mutáns (7., 8. sáv a 3b., c. ábrán) hasonló RNS-asszociációt mutatott, addig az összes dimer-interfész mutáns (rM10, rM11, rM15 a 2., 3., 5. sáv a 3b., c. ábrán) hasonló RNS-asszociációt mutatott. 3b, c) RNS-asszociációja (7. sáv) jelentősen csökkent az RNáz A kezelés előtt vagy után, az rM10 (T183D-L184D-A187Y), az rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) és a kontroll mutáns rM9 pedig alig mutatott kimutatható RNS-t, miután ugyanezen tisztítási folyamaton mentek keresztül (1., 2., 5. sáv). A méretkizárásos kromatográfia (SEC) kimutatta, hogy az rM10 és az rM15, valamint a kontroll mutáns rM9 túlnyomórészt monomerként eluálódott az RNáz A kezelés előtt és után (3d. ábra, e; 6A, B kiegészítő ábra), ami megerősíti a dimerizáció/multimerizáció megszakadását. Ezek az eredmények tehát arra utalnak, hogy a kísérleti körülmények között a határfelületen belül eltemetett maradékok mutációja nemcsak a dimerizációt szakítja meg, hanem az RNS-asszociációt is befolyásolja, még akkor is, ha a 7-es hurok változatlan marad, valószínűleg a dimer felbomlásából eredő fokozott PEP elvesztése miatt (2c, d ábra).

Mivel a humán A3G (hA3G) rossz oldhatósága miatt nem tudtunk hasonló típusú biokémiai vizsgálatot végezni a hasonló mutánsok értékelésére, létrehoztunk egy rA3G-hA3G kiméra mutánst (h6 kiméra), amelyben az rA3G CD1 h6-ot hA3G CD1 h6-ra cseréltük (lásd a 3. kiegészítő táblázatot). Ez a h6 kiméra a tisztítás során hasonlóan viselkedett, mint az rA3G WT a dimer/multimerizáció tekintetében RNáz A kezelés előtt vagy után (7A, B kiegészítő ábra), valamint az RNS asszociáció tekintetében, különösen RNáz A kezelés után (7C, D kiegészítő ábra). Érdemes megjegyezni, hogy amint az a 7A, B kiegészítő ábrán látható, míg a H6 kiméra fehérje szintén eltolódott a dimer (D) és monomer (M) frakciókba RNáz A kezelés után (SDS-PAGE gél a kiegészítő ábrán. 7D), SEC-profilja heterogénebb csúcsokat mutat, mint az rA3G WT-é, valószínűleg azért, mert a kiméra fehérje három olyan hA3G-maradékot (Y181, I183, I187) tartalmaz, amelyek hidrofóbabbak, mint az rA3G-ben (H181, T183, A187), és így kevésbé stabilak/oldékonyak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CD1 h6 felcserélhető lehet az rA3G és a hA3G között, ami azt eredményezi, hogy mindkét fehérjén lényegében azonos felszíni maradékokat tartalmazó PEP-terület van jelen.

PEP-mutáció hatása az RNS-asszociációra és multimerizációra

Ezután megvizsgáltuk, hogy a dimer-összeköttetés körül kialakuló fokozott PEP-felület (2. ábra. Inset b) fontos-e az RNS-asszociáció szempontjából. Az R24 körüli négy pozitív/poláris maradékot mutáltuk, hogy létrehozzuk az rM12-t (R24T-S28A-N176A-N177D, 3. kiegészítő táblázat). Egy olyan mutáns is szerepelt, amely csak R24T-t tartalmazott. Az rM12 RNS-asszociációja csökkent az R24T-hez és a WT-hez képest (4., 6., 7. sáv a 3b., c. ábrán), ami arra utal, hogy ezek a PEP területen belüli maradékok szerepet játszanak az RNS-kötés fokozásában. Az rM9-hez (F126A/W127A/A187Y) képest azonban az rM12 még mindig jelentős mennyiségű RNS-asszociációt mutatott az RNáz-A kezelés előtt és után (1., 4. sáv a 3b., c. ábrán), ami valószínűleg az RNS-kötés részleges megszakadásának köszönhető a PEP-területhez, de nem az rA3G más területeihez. Váratlanul a SEC-elemzés kimutatta, hogy az rM12-nek már az RNáz A kezelés előtt is volt egy jelentős monomerikus csúcsa (3d., e. ábra, 6A, B kiegészítő ábra), ami a dimerizáció/multimerizáció megszakítására utal a dimerizációs interfész közvetlen mutációja nélkül. A PEP-mutációnak ezt a negatív hatását az RNS-asszociációra és a dimerizációra/multimerizációra további két további PEP-mutációt tartalmazó rA3G mutáns, az rM13 és az rM14 is megerősítette (3. kiegészítő táblázat, 7. kiegészítő ábra). Ez a két mutáns az RNS asszociáció (7A. kiegészítő ábra) és a dimerizáció/multimerizáció különböző mértékű zavarát mutatta még RNáz A kezelés előtt is a vizsgált körülmények között (SEC profilok és gélek a 7C. kiegészítő ábrán).

Interjesztő módon, bár az R24T egyetlen mutáns és a WT hasonló mennyiségű asszociált RNS-t mutatott, amelyet az RNS gélekkel detektáltak az 7C. ábrán. 3b, c), a SEC-csúcsfrakcióik részletes SDS-PAGE-elemzése az RNáz A kezelés előtt kimutatta, hogy az R24T fehérje nagy része a monomer csúcs (M) helye körül elterülő frakciókban oszlott el (Kiegészítő 6A. ábra), ami ellentétben áll a WT-vel, amely főként az üres térfogat (V) frakciókban oszlik el. Ezek az eredmények az RNS asszociációs és multimerizációs viselkedésének megváltozására utalnak egyetlen R24T mutációval a PEP területen belül, ami összhangban van az R24A mutációkkal kapcsolatos korábbi vizsgálatokkal14,30,38,40. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy ezen vizsgálati körülmények között a dimer-összeköttetés fokozott PEP-területén belüli maradékok (R24/S28/N176/N177) fontos szerepet játszanak az RNS-asszociáció közvetítésében, és az RNS-asszociáció ezeken a maradékokon keresztül fordítva szükséges a dimerizáció stabilizálásához és az azt követő magasabb rendű multimerizációhoz.

A PEP/dimer mutációk hatása az in vitro RNS/DNS kötődésre

A fl rA3G szerkezetek további pozitív töltésű maradékokat tartalmazó területeket mutatnak a fokozott PEP területen kívül, amint az a 2c. ábrán látható. Bár ezek a PEP-területen kívüli pozitív töltésű maradékok nem játszanak jelentős szerepet a stabil A3G-RNS-komplexek kialakításában, ahogy azt E. coli sejtlizátumokban megfigyelték, mégis hozzájárulhatnak a meghatározott ssRNS és ssDNS szubsztrátok megkötéséhez. Ennek tesztelésére minden egyes tisztított fehérjemintát kiterjedt RNáz-kezelésnek vetettünk alá, hogy a lehető legtöbb megkötött RNS-t eltávolítsuk, és az 50 nt ssRNS vagy ssDNS oligomerekhez való kötődési affinitást géleltolódási próbával vizsgáltuk. Minden mutáns mutatott kötődést 50 nt ssRNS-hez vagy ssDNS-hez, és a becsült disszociációs állandók (Kd, 3. kiegészítő táblázat) azt mutatták, hogy a legtöbb mutánsnak csökkent a kötődése a WT-hez és az E/Q-hoz képest. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy ebben a rekonstruált rendszerben, ahol magas fehérje- és nukleinsav-koncentrációk voltak jelen, ezek a különböző rA3G dimer-felületi és PEP-terület mutánsok még mindig képesek RNS-hez és ssDNS-hez kötődni a dimer-összeköttetés PEP-területén kívüli más maradékokon keresztül.

A mutánsok kötődésének csökkenése összességében súlyosabb az ssDNS-kötés, mint az RNS-kötés esetében. Érdekes módon az ezen rA3G mutánsok (rM9-rM12 és rM15) tisztított fehérjéivel végzett deamináz-teszt kimutatta, hogy ezek a dimer-felületi mutánsok és az RNS-kötő mutánsok mind csökkent deamináz-aktivitást mutattak a WT-hez képest (8. kiegészítő ábra). E mutánsok alacsonyabb ssDNS-kötődése legalább részben magyarázhatja a deamináz-aktivitás különböző mértékű csökkenését. Úgy tűnik azonban, hogy a csökkent ssDNS-kötés mértéke nincs szoros korrelációban a deamináz-aktivitás zavarának szintjével. Például az rM12 mutatta a legalacsonyabb ssDNS-kötést (3. kiegészítő táblázat), de nem a legalacsonyabb deamináz-aktivitású (8. kiegészítő ábra).

A PEP/dimer-interface mutációk hatása a HIV-restrikcióra

A humán A3G (hA3G) W127A mutációjáról ismert, hogy megzavarja a víruscsomagolást és ezáltal a HIV-restrikciót, valószínűleg az e maradék által közvetített RNS-kötés megszüntetésével. Azonban azok a vizsgálatok, amelyek a hA3G W127 mutánsok csomagolását Vpr peptidfúzióval indukálták, hiányosságokat azonosítottak a HIV-restrikcióban15. Annak érdekében, hogy további betekintést nyerjünk a HIV-1 hA3G általi korlátozásának mechanizmusába, további hA3G mutánsokat terveztünk az rA3G szerkezete és a mutációs adatok alapján. E hA3G mutációk (4. kiegészítő táblázat) célja az volt, hogy megzavarják az intramolekuláris CD1-CD2 kölcsönhatásokat (M2, M3, M4) (9A, B kiegészítő ábra), megzavarják az RNS-kötést a dimer csomópont körül a poláris/töltött maradékok növekvő számú mutációjával (M12, M13, M14), vagy megzavarják a fehérje-fehérje dimer kölcsönhatásokat az eltemetett maradékok növekvő számú mutációjával (M6, M10, M11) (9A, B kiegészítő ábra). 9C).

Amint az várható volt, a WT hA3G nem mutatott HIV-1-restrikciós aktivitást Vif jelenlétében, de teljesen korlátozta a HIV-1-et Vif hiányában, a Vif-rezisztens M1 (D128K) konstrukció pedig teljesen korlátozta a HIV-fertőzést Vif-fel vagy anélkül (4a-c. ábra). Ezzel szemben a W127A-t tartalmazó M9 mutáns (F126A/W127A/I187Y mutációkkal, 9C. kiegészítő ábra), amelyről ismert, hogy mind az RNS-kötést, mind a dimerizációt megzavarja, nem mutatott restrikciós aktivitást a Vif jelenlététől függetlenül (4a-c. ábra). Ez összhangban van a korábbi irodalommal, amely szerint a W127 fontos a HIV restrikciós aktivitásában, mivel RNS-kötő képessége szükséges a hA3G víruscsomagoláshoz és a reverz transzkripció dezamináció-független korlátozásához14,15. Valóban, annak ellenére, hogy a Vif-degradációval szembeni érzékenysége csökkentnek tűnt (10A kiegészítő ábra), ~5-10-szer kevesebb M9 mutáns fehérje csomagolódott virionba Vif jelenlétében vagy hiányában, mint a WT hA3G (4a, b ábra). Ezek az eredmények a hA3G M1 és M9 WT és kontroll mutánsainak teljes aktivitását vagy aktivitáshiányát mutatták vizsgálatunkban.

Az intramolekuláris CD1-CD2 kölcsönhatások befolyásolására tervezett mutánsok esetében az M2 és M3 esetében a CD2 oldalon a domének közötti interfész közelében vagy azon belül, az M4 esetében pedig a CD1 oldalon több maradékot mutáltunk (9A, B kiegészítő ábra). Az M2 és az M3 is jelentősen alacsonyabb HIV-1 restrikciós aktivitást mutatott Vif hiányában (4c. ábra). A CD2 1. és 3. hurokján a CD1-gyel való interfész körül mutációkat hordozó M2 katalitikus aktivitásának teljes elvesztését mutatta (4e. ábra), valószínűleg azért, mert néhány ilyen mutált maradék, mint például a H216, fontos az ssDNS-szubsztrát kölcsönhatás szempontjából49. A CD2 és a CD1 közötti CD2 interfészen az R194/H195 linker maradékoktól kezdődően mutációkat hordozó M3 (9A, B kiegészítő ábra) csak ~10%-os WT deamináz aktivitást mutatott (4e. ábra), valószínűleg a CD2 és a CD1 közötti megfelelő kölcsönhatás elvesztése miatt, ami befolyásolja a hatékony katalitikus aktivitáshoz szükséges koordinált ssDNS-szubsztrátkötést. A CD1 inter-domain interfész körüli többszörös mutációt hordozó M4 a WT-hez hasonló tulajdonságokat mutatott, ami azt jelzi, hogy ezek a mutációknak nincs nyilvánvaló hatása a restrikciós képességre. Érdekes módon ez a mutáció teljes katalitikus aktivitással rendelkezett (4e. ábra), ami bizonyos plaszticitásra utal a CD1-CD2 interfész kölcsönhatásai között a funkciók szempontjából.

A M12 és M13 úgy lett kialakítva, hogy csak az RNS kötődést zavarja a PEP területhez a dimer-összeköttetésnél, és az M14 tartalmazza az M12 és M13 mutációinak nagy részét, valamint négy további R/K maradékot (K52/K63/R69/K76), hogy megszüntesse az A3G-CD1 maradék egyetlen pozitív töltésű felületét (9C. kiegészítő ábra). Meglepő módon ezek a mutánsok mind ~70%-os HIV-1 restrikciós aktivitást mutattak Vif hiányában (4c. ábra). Bár a Vif-érzékenységet nehéz volt számszerűsíteni az M12, M13 és M14 tartósan alacsony expressziós szintje miatt a Vif-érzékenységi tesztben (10A. kiegészítő ábra), mindhárom mutáns a WT-hez hasonlóan nem mutatott HIV-restrikciós aktivitást Vif jelenlétében (4c. ábra), ami arra utal, hogy valójában még mindig kellően érzékenyek a Vif által közvetített degradációra. Az M12-14 csak 70%-os HIV-1 restrikciós aktivitásának oka nem a HEK293T sejtlizátumokban detektált alacsonyabb stabil állapotú fehérjeszintjük (4a, b ábra) volt, mivel az M12-M14-hez hasonló sejtszintű expressziós szintek elérése érdekében kevesebb WT expressziós plazmid transzfekciója még mindig ~4-szer nagyobb HIV-1 restrikciót eredményezett a WT-hez képest (10B kiegészítő ábra). Ez összhangban van a deamináció-független restrikciós aktivitással, mivel e három mutáns dezaminációs aktivitása megszakadt (4d, e ábra). Különösen az M14 esetében a deamináz-aktivitás teljesen elveszett (4e. ábra). Ezzel összhangban volt az M14 háttérmutációs aránya a provirális DNS-szekvenálási eredmények alapján (5. kiegészítő táblázat). Ennek ellenére ~70%-os HIV-1 restrikciós aktivitást mutatott. Ezek az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy az M12-14-ben mutált, a CD1 PEP és közeli területein az RNS-kötést megzavaró maradékok csak részleges hibát mutattak a HIV korlátozásában, ami azt jelzi, hogy megtartották a virionkapszidáció és a HIV-1 korlátozás bizonyos szintjét, ami ellentétben áll az M9 mutánsban a W127-et tartalmazó mutációkon keresztül közvetített RNS-kötés szerepével, amely kritikus a virioncsomagolás és a HIV-korlátozás szempontjából (ábra. 4a-c).

A kizárólag a fehérje-fehérje dimer kölcsönhatások megszakítására szánt mutánsok a mutációk számának növekedésével az M6-tól az M11-ig terjednek (4. kiegészítő táblázat, 9C. kiegészítő ábra). Az M6 és az M7 csak részleges restrikciós aktivitásvesztést mutatott Vif hiányában, annak ellenére, hogy az M7 esetében a CD2 további három mutációja miatt a katalitikus aktivitás 95%-ban elveszett (4e. ábra). Ezért az M6 és M7 mutációi nem kritikusak a HIV-restrikció szempontjából. Az M10 súlyosabb fenotípust mutatott a HIV-1 restrikcióban Vif hiányában, annak ellenére, hogy megtartott némi katalitikus aktivitást (4e. ábra), ami arra utal, hogy az M10-en lévő mutációk fontosak a virioncsomagolás és a HIV-restrikció szempontjából. Az M11 az M10-hez hasonló deamináz aktivitással rendelkezik, de kevésbé súlyos fenotípussal a restrikciós aktivitás és az integráció tekintetében (4c, d ábra). Lehetséges, hogy az M11 több RNS-kötő képességet őrzött meg, mint az M10 (az rA3G mutánsok rM10-11 elemzéséből, 3a-e. ábra), ami kevésbé súlyos fenotípust eredményezett. Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy az eltemetett fehérje-fehérje dimer interfészen belüli maradékok mutációja önmagában még mindig megtartotta a HIV-restrikciós aktivitást csökkentett szinten (4c. ábra), és e mutánsok deamináz-aktivitásának megszakadása (4e. ábra) részben magyarázhatja a HIV-restrikciós aktivitás csökkenését. Ez ismét ellentétben áll az M9 mutánssal, amely nem mutatott HIV-restrikciós aktivitást (4a-c. ábra).