A HPV genotípusok és a külső anogenitális szemölcsök kapcsolata: keresztmetszeti vizsgálat
A vizsgálat felépítése és résztvevői
Nem valószínűségi mintát használó keresztmetszeti vizsgálatot végeztünk. A vizsgálatba a Farwania Health District Area bőrgyógyászati klinikáira járó betegeket 2016 novembere és 2017 májusa között egymás után toborozták. A krioterápiás vagy lézeres kezelésre tervezett, külső anogenitális szemölcsök korábbi klinikai diagnózisával rendelkező immunkompetens betegeket a bőrgyógyász szóbeli, részvételüket kérő magyarázatát követően felkérték a beleegyező nyilatkozat aláírására. A mintavételkor a szemölcsmintákat univerzális szállítóközegbe (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Olaszország) gyűjtötték, és – 80 °C-on tárolták. Az etikai jóváhagyást az Egészségügyi Tudományos Központ Etikai Bizottsága (száma: VDR/EC/2310) és az Egészségügyi Minisztérium adta meg.
A demográfiai és klinikai adatokat minden betegtől felvették, többek között: A betegeknél a következő adatokat vették fel: életkor (év), nem (férfi, nő), nemzetiség (kuvaiti, nem kuvaiti), szemölcsök száma (egy, kettőtől négyig, és legalább öt), a szemölcsök jelenlétének időtartama (< egy hónap, egytől hat hónapig, héttől 12 hónapig, és több mint 12 hónap), az egyes szemölcsök mérete (centiméterben) (< egy, egy, egy és kettő között, kettőnél több), a partnerek szemölcsösek (igen, nem), és ha a szemölcsök korábbi kezelés alatt álltak (igen, nem). A résztvevők egyike sem részesült HPV-vakcinációban, mivel a HPV-vakcinációt Kuvaitban még nem vezették be, bár annak bevezetéséről jelenleg tárgyalnak az Egészségügyi Minisztériumban.
DNS-nyerés és kontrollok
A kapott szövetmintákat -80 °C-on tárolták. A beérkezett minták nagy száma miatt betegenként az összes szemölcsöt együtt darálták fel, és egy DNS-izolálásnak vetették alá. A szövetet steril ollóval és csipesszel Petri-csészén daráltuk fel, és körülbelül 25 mg szövetet mértünk le. A szövetet foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) mostuk, és 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe töltöttük. A szövetmintákból a genomi DNS-t a QIAmp DNA Mini kit (Qiagen, USA) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően.
A PCR-kísérletekben kontrollként HPV 2-es, HPV 1-es és HPV 16-os típusú vektorokat (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) használtunk.
Real time PCR
A valós idejű PCR-vizsgálatot a HPV DNS szűrésére végeztük a genitális szemölcsökben. Öt mikroliter (5μl) extrahált DNS-t 12,5μl 2X Syber Green master mixszel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), amely ROX-ot tartalmazott passzív referenciaként, valamint 10 pmol előre- és fordított primerrel (10-uM, lásd alább) egyesítettük. A primerek minden készletét a Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) állította elő egyedi módon. Az elegyet 25 μl térfogatúvá tettük nukleázmentes vízzel (Ambion, Austin, TX, USA). A hamis pozitív vagy negatív eredmények számának csökkentése érdekében a mintákat 96 optikai lyukú reakciólemezen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) két példányban elemeztük. Minden egyes amplifikációs tételben pozitív és negatív kontrollok szerepeltek. A mintákban lévő HPV mennyiségi meghatározásához az ismert pozitív kontroll DNS öt-tízszeres sorozathígítását végeztük el a minták mellett. A valós idejű PCR-amplifikációt ABI 7500 valós idejű PCR-ben (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük.
A valós idejű PCR-vizsgálatot három különböző lemezen végeztük. Az első lemezt a cél-DNS integritásának meghatározására használtuk β-globin PCR-teszttel, egy 268 bp-os célfragment felerősítésével, ahogyan azt korábban Lum és Le Marchand 1998-ban leírta . A β-globin primerek nukleotidszekvenciája a következő: β-globin forward PCR-primer: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. β-globin reverz PCR-primer: 5′-AACAGCATCAGGAGGAGTGGACAGAT-3′.A PCR-amplifikációt 95 °C-on indítottuk el tíz percig, majd 45 amplifikációs ciklussal (denaturálás 95 °C-on 15 másodpercig, lágyítás 55 °C-on 45 másodpercig és hosszabbítás 65 °C-on egy percig) fejeztük be.
A második lemezen a HPV-fertőzés jelenlétének szűrésére használtuk a HPV L1 ORF-ből származó MY11/GP6 primereket. A MY11/GP6 primerek nukleotidszekvenciái a következők: MY11 forward primer: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ és GP6 reverse primer: 5′- GAAAAAAATAAACTGTAAATCATATATTC-3′. Az amplifikált fragmentum várható mérete 185 bp. A PCR-amplifikációt 95 °C-on indítottuk el tíz percig, és 45 amplifikációs ciklussal fejeztük be (denaturálás 95 °C-on 15 másodpercig, lágyítás 45 °C-on 45 másodpercig és hosszabbítás 65 °C-on egy percig).
A harmadik lemezen a HPV L1 ORF-ből származó HVP2/B5 primereket használtunk a HPV fertőzés jelenlétének szűrésére. A HVP2/B5 primerek nukleotidszekvenciái a következők: HVP2 forward primer: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 reverse primer: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Az amplifikált fragmentum várható mérete 650 bp. A PCR-amplifikációt 95 °C-on indítottuk el tíz percig, és 45 amplifikációs ciklussal fejeztük be (denaturálás 95 °C-on 15 másodpercig, lágyítás 50 °C-on 45 másodpercig és hosszabbítás 65 °C-on egy percig).
A fluoreszcencia-spektrumokat minden PCR-ciklus elongációs fázisában rögzítettük. Az ABI 7500 valós idejű PCR szoftvert (Sequence Detection Software, SDS v1.7) használtuk az egyes reakciók amplifikációs görbéjének elkészítéséhez. A specifikus és nem specifikus amplikonok megkülönböztetése érdekében minden reakció után disszociációs görbét készítettünk. Az amplifikációs görbe alapján minden olyan mintát kiválasztottak az elemzéshez, amelynek HPV-amplifikációja bármelyik ciklusban kezdődött, egészen a 40. ciklusszámig (0,2-es cut-off vonallal). Csak a 70 °C és 80 °C közötti disszociációs görbével és 0,100-0,500 közötti derivált értékkel rendelkező mintákat tekintettük HPV-DNS-pozitívnak.
Sanger-szekvenálás
A szemölcsökben lévő HPV-DNS-t a szekvenálás előtt nested PCR-rel amplifikáltuk, az AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével Az első PCR-ben HVP2/B5 primereket, a második PCR-ben pedig CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R és C4F/C4R primereket használtunk. Az első PCR-amplifikációt 95 °C-on indítottuk el tíz percig, és 35 amplifikációs ciklussal fejeztük be (denaturálás 95 °C-on 15 másodpercig, lágyítás 50 °C-on 45 másodpercig és hosszabbítás 68 °C-on egy percig). A második PCR-amplifikációt az első PCR-termék 3 μl-ének felhasználásával és ugyanazokkal a ciklikus körülményekkel végeztük el. A HVP2/B5 és a CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R és C4F/C4R primerek használatával a bőrszemölcsökből várhatóan kimutatható széles spektrumú HPV genotípusok közé tartoznak az alfa nemzetségek HPV típusai (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 és 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 és 88), mu (HPV 1 és 63) és nu (HPV 41) .
A PCR-termékeket a gyártó utasításai szerint PCR-tisztító kit (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Németország) segítségével tisztítottuk. Ezt követően Sanger-szekvenálási reakciót végeztünk rajtuk BigDye terminator v3.1 ciklusszekvenáló keverék (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és a fent leírt nested PCR primerek felhasználásával. A szekvenálás utáni PCR-tisztításokat a nem kötött fluoreszcens festék dezoxi terminátorok eltávolítására BigDye XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével végeztük. A mintákat 2 percig 95 °C-on denaturáltuk, majd azonnal jégen hűtve feltöltöttük az ABI 3100 Genetic Analyzerre (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A mintákat egy 50 cm-es kapilláris tömbön elektroforizáltuk POP 6 polimer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) mint elválasztó közeg használatával.
A mintákat a Sequencing Analysis szoftver v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével elemeztük. A HPV-szekvenciák összehangolását a GenBank adatbázisban bemutatott szekvenciákkal végeztük el a BLASTn szoftver (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) és a Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV adatbázis (https://pave.niaid.nih.gov/) segítségével.
Ahol a kapott szekvenciák a PCR-termék alacsony hozama miatt gyenge minőségűek voltak, a PCR-termékeket a Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit (Promega) segítségével történő tisztítást követően pGEM-T Easy Vectorba (Promega, Madison, WI) klónoztuk, és az inzertek szekvenálását M13 forward és reverse primerek használatával végeztük.
Statisztikai elemzés
A klinikai diagnózis, a demográfiai adatok és a virológiai elemzés adatait az SPSS statisztikai szoftver “Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0” (IBM Corp, Armonk, NY, USA) segítségével táblázatba foglaltuk és elemeztük. Leíró statisztikákat: gyakoriságokat/százalékokat, közép- és szórásértékeket számoltunk. Az átlagok egyenlőségének vizsgálatára a kétmintás t-tesztet alkalmaztuk minden folytonos változó esetében, ha a normalitás fennállt, egyébként a Mann Whitney U-tesztet használtuk. Három csoport átlagainak összehasonlítására a varianciaanalízist vagy a Kruskal-Wallis-tesztet alkalmazták, attól függően, hogy a feltételezések teljesültek. Két kategorikus változó közötti összefüggések vizsgálatára a Pearson-féle chi-négyzet tesztet vagy a Fisher-féle egzakt tesztet alkalmazták, ha a feltételezések teljesültek. A bináris kimenetel és a kovariánsok együttesének modellezésére logisztikus regressziót alkalmaztak, és becsülték a nyers és kiigazított esélyhányadosokat és azok 95%-os konfidenciaintervallumait. Minden teszt kétfarkú volt, és az 5%-nál kisebb P-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.