A laterális áramlási csík arany nanorészecskéken alapuló 6-monoacetilmorfin kimutatására szájfolyadékban

Bevezetés

Az utóbbi években drámaian megnőtt az opioidokkal való visszaélés, ami a megbetegedések és a halálozás egyik fő oka. Az ENSZ Kábítószer- és Bűnügyi Hivatala által közzétett 2017. évi kábítószer-világjelentés szerint az opiátok és a vényköteles opioidok használata talán nem olyan elterjedt, mint a kannabiszé, de az opioidok továbbra is jelentős kábítószerek, amelyek potenciális ártalmakkal és egészségügyi következményekkel járnak . Ezért az opioidok könnyű és gyors felderítése sürgős szükséglet.

Az illegális heroinnal való visszaélés az opioidfüggőség egyik leggyakoribb formája. A heroin (diacetilmorfin, diamorfin vagy Diagesil®) egy félszintetikus morfinszármazék és erős opioid fájdalomcsillapító . A heroin anyagcseréjét az 1. ábra szemlélteti. A heroin gyorsan hidrolizálódik 6-monoacetilmorfinná (6-MAM) és végül morfinná. Mivel a heroin a beadást követően gyorsan hidrolizálódik, metabolitjait általában a használat igazolására használják. Ezenkívül a 6-MAM az egyetlen specifikus mutatója a közelmúltbeli heroin-visszaélésnek a morfinnal szemben, és nagy érdeklődést váltott ki a kutatóközösségből.

A 6-MAM kimutatására több módszert is leírtak, amelyek a következő kategóriákba sorolhatók: (1) kromatográfiás elemzés, beleértve a gázkromatográfiát és a nagyteljesítményű folyadékkromatográfiát ; (2) spektroszkópiai elemzés, mint a Ramen spektroszkópia, infravörös spektroszkópia, kemilumineszcencia , stb; (3) kapilláris elektroforézis ; és (4) immunoassay módszerek (antigén-antitest) . Az összetett műszeres technikák óriási nyomást gyakorolnak az alapszintű gyógyszerszűrésre, mivel kifinomult berendezésekre és professzionális kezelőkre van szükség. A laboratórium néha zárva van vagy messze van. Még a rendőrőrsök sem tudják elhelyezni ezeket a bonyolult és drága berendezéseket. A rendőrnek azonban azonnal meg kell ítélnie, hogy egy gyanús anyag heroint tartalmaz-e vagy sem, és gyorsan kell reagálnia. Ezért sürgősen szükség van specifikus, megbízható és egyszerű módszerek kifejlesztésére a tiltott kábítószerek biológiai mintákban történő kimutatására .

A gyors kimutatási módszerek közül a kolloidális arany nanorészecskék (AuNP) alapú laterális áramlási csíkokat (LFS) az AuNP-k méret- és távolságfüggő optikai tulajdonsága miatt széles körben elfogadták a gyors szűrésre, az első jelentést Mirkin és munkatársai tették . A félkvantitatív laterális áramlási vizsgálatok elve az, hogy az AuNP-k vörös színe szabad szemmel is látható az antigén-antitest kombinációból néhány perc alatt . A heroinnal való visszaélés kimutatására különböző kereskedelmi tesztkészletek állnak rendelkezésre, többek között a NovaBios és a Wondfo cégek termékei. A legtöbb heroinszűrő készlet azonban csak a morfint méri, a 6-MAM-ot nem, mivel a 6-MAM és a morfium között nehéz különbséget tenni. A morfium metabolizálódhatott más kábítószerekből, vagy fel is írhatták. A 6-MAM egyértelműen a heroinra vezethető vissza.

A minták közé tartozik a vér, a plazma, a vizelet, a haj, a szájnedvek, valamint a lehelet, az izzadság, az anyatej, a fogak stb . A tiltott heroin vizsgálatához leggyakrabban használt minták a vér, a vizelet és a szájüregi folyadékok. Ezek közül a vérvizsgálat a legpontosabb és legmegbízhatóbb, de invazív is. A vizeletvizsgálat a legkényelmesebb és legszélesebb körben használt a kábítószerrel való visszaélés szűrésében. A szájüregi folyadékokat egyre gyakrabban használják az ellátási helyeken történő teszteléshez – ezeket könnyű nyilvánosan gyűjteni. A szájfolyadékok azonban nagyon viszkózusak, és alacsony célkoncentrációjúak; ezért a legtöbb teszt a vizeletet használja a 6-MAM vizsgálatához. A szájon át történő folyadéktesztek fejlesztése során ugyanazzal a problémával kell szembenézni a mintavétel és az érzékenység javítása terén. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a 6-MAM gyakran kimutatható a szájfolyadékban. Az LFS-ek kimutatási standardja a 6-MAM szájfolyadékban 4 ng ml-1 . Itt egy laterális áramlási tesztet fejlesztettünk ki a heroin kimutatására szájfolyadékmintákban.

Felfedeztük az AuNP-ket mint antitest-jelölőket egy laterális áramlási tesztben a 6-MAM gyors és érzékeny kimutatására egy kolorimetrikus jel segítségével. Először szintetizáltuk a 6-MAM-ot, majd szarvasmarha-szérumalbuminhoz (BSA) konjugáltuk, hogy lehetővé tegyük a T-vonalra történő bevonását. Ezenkívül a szájüregi folyadékminták kezelésével kapcsolatos nehézségek leküzdése érdekében a nitrocellulóz (NC) membránok típusait, a mintapárna oldatformuláját és a szivacsos adszorbens párnát úgy választottuk ki, hogy a szájüregi folyadékok LFS-éhez a legjobb feltételeket keressük. Végül a 6-MAM LFS-t validálták, és kimutatták, hogy kiemelkedő érzékenységgel és specificitással rendelkezik.

Kísérleti

2.1. Anyagok

A 6-MAM elleni antitesteket a Bioventure (Sanghaj) biztosította. A BSA-t és a polivinil-pirrolidont (PVP) a Sigmától (Barcelona, Spanyolország) vásároltuk. A Triton X-100, a Tetronic 1307 (S9), az Ohodasurf On-870 (S17) és a STANDAPOL ES-1 (S7) a BASF-től (Németország) származott. A desztillált vizet (fajlagos ellenállás 18,2 MΩ cm-1) a RephiLe PURIST UV Ultrapure water rendszerrel (Kína) készítettük. A Reel diszperziós rendszer a Doyesgo-tól (Kína) származott. A Vion IMS Q-Tof tömegspektrométer a Waters-től (USA) származott. Minden standard anyagot, például a 6-MAM-ot és a morfint a Nemzeti Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézettől (Kína) szereztük be. A mikroszkóp a Motic AE2000-től (Xiamen, Kína) származott. Minden más, itt nem részletezett kémiai és immunológiai reagens analitikai/reagens minőségű, szabványos kereskedelmi termék volt.

2.2. Az összes többi kémiai és immunológiai reagenst analitikai/reagens minőségben használtuk. Az oldalsó áramlási csík összetevői

A LFS-ek egy műanyag hátlapból, egy szivacsos adszorbens csíkból (szivacsbetét), egy mintabetétből, egy konjugált betétből, NC membránokból és egy abszorbens betétből állnak. A szivacsos adszorbens csíkot kifejezetten szájüregi folyadékgyűjtéshez tervezték, és gyorsan szállítja a szájüregi folyadékot a mintapárnába. A mintatampon pufferrendszert és néhány felületaktív anyagot tartalmaz. Az antitest-AuNP konjugátumokat a konjugált párnára permeteztük, hogy reagáljanak a mintával, majd a párnából felszabadulva a T vonalon 6-MAM-BSA-val, a C vonalon pedig kecske antinyúl antitestekkel bevont NC membránba kerüljenek. Az abszorbens párna egy szűrőpapír, amely a csík végén található; ez tartja fenn a kapilláris áramlást. Az LFS-t csak a szájba kell helyezni, vagy be kell helyezni egy szájüregi folyadékmintás pohárba. Az LFS sematikus ábrája a 2. ábrán látható. A 6-MAM kimutatására szolgáló LFS sematikus ábrája a 3. ábrán látható.

2.3. A 6-monoacetilmorfin-szarvasmarha-szérumalbumin konjugátum szintézise

A 6-MAM-ot a korábban a kutatómunkákban leírtak szerint állítottuk elő . Röviden, a morfint először heroin lúgos hidrolízissel állították elő. Ezután egy N-hidroxiszukcinimid (NHS) észtercsoportot adtak a 6-MAM molekulához, hogy azt a hordozófehérjékhez konjugálják (4. ábra). Az aktivált 6-MAM-ot egy Waters® Vion IMS Q-Tof tömegspektrométerrel biztosítottuk. Ezután a szintézist a leírtak szerint végeztük (5. ábra), néhány módosítással. Először 80 mg BSA-t 6 ml 50 mM kálium-foszfát pufferben (pH = 7,5) hagytunk 0°C-ra lehűlni. Ezután 0°C-on cseppenként 20 mg aktivált 6-MAM-ot adtunk hozzá 1 ml vízmentes dimetil-formamidban (DMF). Az elegyet szobahőmérsékletre melegítettük és egy éjszakán át kevertettük. Az így kapott 6-MAM-BSA konjugátumot 50 mM kálium-foszfát pufferrel (pH = 7,5) szemben dializáltuk, hat puffercserével (egyenként legalább 6 óra 4°C-on).

2.4. Arany nanorészecskék-antitest konjugátumok előállítása

A 20 nm-es AuNP-ket citrát redukciós módszerrel állítottuk elő . Itt 100 ml forrásban lévő vízhez erőteljes keverés mellett 2 ml 1%-os HAuCl4 oldatot adtunk, majd azonnal hozzáadtunk 2 ml 1%-os nátrium-citrát oldatot. Amikor az oldat vörösre színeződött, további 15 percig forraljuk. Az oldatot szobahőmérsékletre hűtöttük és 4°C-on tároltuk a további felhasználásig.

Az AuNPs oldat pH-értékének 0,1 M K2CO3 segítségével 9,0-ra történő beállítása után 30 µg 6-MAM antitestet adtunk 10 ml AuNPs oldathoz és 30 percig inkubáltuk. Ezt követően 20 µl 100,0 g l-1 BSA-t adtunk hozzá 15 percig a reaktív helyek blokkolásához. Az oldatot 15 percig 3740 g-nél centrifugáltuk, majd a felülúszót 12 100 g-nél további 30 percig újracentrifugáltuk. Az összes aranycsapadékot összekevertük, és UV-látható spektroszkópiával megmértük a maximális abszorbancia meghatározásához. Ezt követően 4°C-on tároltuk a további felhasználásig.

Az AuNP-ket ugyanezzel a módszerrel konjugáltuk nyúl IgG antitestekhez. A konjugált pad készítésekor az antitest-konjugátumokat pufferrel (0,05 M Tris-HCl, amely 10,0 g l-1 BSA-t, 0,4% Triton X-100-at, 5% trehalózt, 10% szacharózt tartalmaz, pH 8,2) hígítottuk ötös abszorbanciáig. Végül 500 µl kevert AuNPs-antitest konjugátumot permeteztünk 20 mm2 -es üvegszálra, majd 37°C-on egy éjszakán át szárítottuk.

2.5. Bevont nitrocellulóz membrán készítése

A laterális áramlási tesztcsík elkészítéséhez 6-MAM-BSA antigéneket (0,6 mg ml-1) adagoltunk az NC membránokra tesztvonalként (T vonal). A kontrollvonalakat (C vonal) kecske antinyúl poliklonális antitestekkel (0,15 mg ml-1) vontuk be. A bevont NC-membránokat 37 °C-on egy éjszakán át szárítottuk. Négy cég kilenc kereskedelmi NC-membránját értékeltük: Millipore (HF90, HF135 és HF180), GE-Whatman (FF120HP és AE100), Sartorius (CN95 és CN150) és Pall (Vivid90 és Vivid170).

2.6. Érzékenység és specificitás

A csík kompetitív vizsgálat, és mindkét pozícióban 6-MAM csíkok voltak. Ha a minta 6-MAM-ot tartalmaz, akkor az kötődik a konjugált padon lévő nanogolddal jelölt antitesthez. A felesleges antitestek a kapilláris hatás következtében tovább haladnak a kromatográfiás irányban, majd a T-vonalon lévő 6-MAM antigénhez kötődnek. A T-vonal jelintenzitása közvetlen kapcsolatban áll a minta 6-MAM-koncentrációjával. A sötétebb szín alacsonyabb 6-MAM-koncentrációt jelez.

Negatív szájfolyadékot gyűjtöttünk hat személytől, és 6-MAM-mal (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) spicceltük az érzékenység kimutatásához. Tíz általánosan használt kábítószert használtak az LFS specificitásának ellenőrzésére. Ezek a kábítószerek a következők voltak: morfium (MOP, 100 µg ml-1), kodein (COD, 100 µg ml-1), tetrahidrokannabinol (THC, 10 µg ml-1), metilén-dioxid-metamfetamin (MDMA, 100 µg ml-1), ketamin (KET, 100 µg ml-1), metil-amfetamin (MET, 100 µg ml-1), kokain (COC, 100 µg ml-1), metadon (MTD, 100 µg ml-1), efedrin (EPH, 100 µg ml-1) és pszeudoefedrin (PEPH, 100 µg ml-1).

Eredmények és megbeszélés

3.1. A 6-monoacetilmorfin-szarvasmarha szérumalbumin konjugátum szintézise

Az NC membránokat az antitest konjugálása előtt általában először egy hordozófehérjével vonják be. Linkereket használnak a szerkezeti specificitás fenntartására. Itt először egy NHS észtercsoportot adtak a 6-MAM molekulához, mint a hordozófehérje linkerét. Ezt egy Waters® Vion IMS Q-Tof tömegspektrométerrel validáltuk. Az aktivált 6-MAM ultrateljesítményű folyadékkromatográfiás (UPLC) kromatogramjain 8,8 percnél széles csúcsot találtunk, amelynek m/z értéke 706,27645 (6. ábra), szemben az előre jelzett 706,2758 m/z értékkel. Ez azt jelzi, hogy a linker sikeresen kapcsolódott a 6-MAM-hoz. A pontos szintézis jelentősége magától értetődő, mivel csak a szerkezetet tudjuk helyesen megállapítani, és ez vezethet a 6-MAM antitestekkel való párosításhoz.

Nem használtunk gradiens dimetilszulfoxid-dialízist, mivel a termék oldható, és a korábbi konjugációs protokoll túl bonyolult. A BSA-nak több csúcsa volt az UPLC-kromatogramban (az adatok nem láthatóak) a különböző analógok miatt. Ez különböző konjugációs arányokat eredményezett. Ezért az UPLC-kromatogramban különböző csúcsok voltak a különböző konjugálási arányoknak megfelelően. A konjugációs eredményeket hatékonyabban lehetett megerősíteni az antigén-antitest párosításon keresztül, mint a konjugáló arányon keresztül.

3.2. A konjugációs arányt az antigén-antitest párosítással lehetett megerősíteni. A nitrocellulózmembrán kiválasztásának típusai

Az NC-membránok a fehérjéket elektrosztatikusan kötik meg a nitrátészter erős dipólusának a fehérje peptidkötéseinek erős dipólusával való kölcsönhatásán keresztül. A tulajdonságokat, köztük a kapilláris áramlási sebességet, a jelintenzitást és a hátteret értékeltük, mivel ezek befolyásolhatják az LFS végső teljesítményét. Továbbá az áramlási sebességre nagyobb figyelmet fordítottunk, mert ez befolyásolhatja a fehérjeadszorpciós kapacitást, sőt az érzékenységet is. A membrán áramlási sebessége a porózus szerkezetek aggregált tulajdonságaitól függ, mint például a pórusméret, a pórusméret-eloszlás és a porozitás. A nagyobb pórusméret gyengébb fehérjeadszorpcióhoz vezet.

Kilenc NC membránt hasonlítottunk össze (1. táblázat). Minden vizsgálatot háromszor ismételtünk meg, és az átlagos eredményt rögzítettük. Az LFS eredményeket 3 perc alatt mértük, és a legjobb mintaáramlási sebesség 20 s cm-1 alatt volt. A T-vonalnál a jelintenzitásra is a normál szinten volt szükség. A mélyebb háttérszín akadályozta a pontosságot. A mintaáramlási sebesség, a T-vonalon mért jelintenzitás és a háttérszín átfogó mérlegelése után a HF135 Millipore membrán volt a legjobb választás a 6-MAM-hez.

3.3. A mintatömb

A mintatömb kezelésére szolgáló oldat nagyon fontos a vizsgálat szempontjából, mert ez szolgált a reakció pufferrendszereként, amikor a szájfolyadékminták rehidratálják a tömböt. Az oldat általában megfelelő ionerősségű és pH-értékű pufferrendszert tartalmaz; egyes blokkoló anyagok és felületaktív anyagok felgyorsíthatják a szájfolyadék áramlási sebességét a membránon. A mintapárna kezeli a szájfolyadék mátrixhatásainak összetettségét, és kompatibilissé teszi azt az NC-membránnal. Ezenkívül a pufferrendszer biztosítja az analitok felszabadulását és stabilizálja az áramlási sebességet, mivel a szájfolyadék túl viszkózus.

Négy különböző formulát vettünk figyelembe. Az oldatformulákat a 2. táblázat tartalmazza. Az eredmények azt mutatták, hogy a 4. pufferrendszer a STANDAPOL ES-1 (S7) felületaktív anyaggal a legjobb teljesítményt nyújtotta 17 s cm-1 mintaáramlási sebesség mellett, normál jelintenzitással és fehér háttérrel. Az S7 felületaktív anyag egy erős anionos felületaktív anyag, amely erősebb mosási képességet biztosít, mint az S17 és az S9.

3.4. Orális folyadékok gyűjtése

Az orális folyadékokat a nagy viszkozitásuk miatt nehezebb összegyűjteni, mint a vizeletet. Sokféle szájnedvgyűjtő eszköz létezik: vattapamacsok, szivacsok, műanyag csövek és poharak. Egyes módszerek a szájnedveket ecettel, szájvizekkel, cukorkákkal stb. stimulálják. Az ilyen stimuláció azonban megváltoztathatja a szájfolyadékban lévő analitok koncentrációját, és bonyolultabb és időigényesebb. Végül a szájfolyadékot közvetlenül a szájból szivacsos adszorbenssel (ESSENTRA, UK) gyűjtöttük, amely megfelelő pórusmérettel rendelkező polimer szálak keveréke.

Kétféle szivacsos adszorbens (K1 és K2) egyedi tervezésű volt, és mindkét szivacsbetét szerkezete a 7. ábrán látható. A K2 sokkal lazább és szabályosabb volt a K1-hez képest. Mindkettőt a folyadékkezelési teljesítmény vizsgálatával értékeltük, beleértve a víznek a szivacspárnára való csepegtetését, a kész LFS negatív kálium-foszfát pufferbe (pH = 7,0) helyezését és a kész LFS szájba helyezését. A K2 szivacs kétszer olyan gyors mintaáramlási sebességgel rendelkezett (átlagosan 20 s cm-1), mint a K1 szivacs víz, PBS puffer vagy valódi szájüregi folyadékok esetében. Ez nagyon fontos kérdés a szájfolyadékok vizsgálatánál. Összefoglalva, a K2-t a szájfolyadékminták kezelésében nyújtott kiemelkedő teljesítménye miatt választottuk.

3.5. Érzékenység és specificitás

A kis molekulákat általában kompetitív assay-vel detektálják az LFS-ben. Itt a T-vonalban nincs jel (piros vonal). Ez azt jelentette, hogy a 6-MAM koncentrációja a mintában a határérték felett van. A szájvízzel történő vizsgálat érzékenységének sokkal nagyobbnak kell lennie, mint a vizeletvizsgálatnak, mivel a szájvízben a kábítószer-metabolitok koncentrációja alacsony. Itt sikeresen elkészítettünk egy minőségi LFS-t a 6-MAM-ra 4 ng ml-1 érzékenységgel, ami megfelel az általános orális folyadék kimutatási határértékekre vonatkozó követelményeknek . Az eredményeket a 8. ábra mutatja. Ezenkívül a 9. ábra mutatja a specificitást az általánosan használt kábítószerekkel szemben. A 6-MAM LFS specifikus volt a 6-MAM-ra, különösen a morfinnal vagy a kodeinnel nem mutatott keresztreakciót.

Következtetés

A 6-MAM a heroin specifikus metabolitja. Itt számolunk be a 6-MAM LFA-járól egy speciális, specifikus antitesttel párosított konjugátumon keresztül. Olyan konjugátumot készítettünk, amely a 6-MAM-ot a C3-pozícióban lévő NHS-észtercsoporton keresztül kötötte a hordozófehérjéhez (10. ábra). Itt az antitest a 6-MAM acetilcsoportját azonosította. Ez a 6-MAM specifikusságának előfeltétele. Végül egy nagyon érzékeny LFS-tesztet készítettünk, amely nem mutatott keresztreakciót 10 általánosan használt kábítószerrel, köztük morfinnal és kodeinnel. Meghatároztuk a megfelelő NC-membránokat, mintatampont, pórusméretet és szivacsadszorbenseket egy olyan teszt elkészítéséhez, amely a szájüregi folyadékokat használja az ellátás helyén.

A fenti előnyökkel a 6-MAM LFS szájüregi folyadékmintához mind kutatási, mind ipari felhasználásra alkalmazható. Segíthet a rendőrségnek, hogy az előzetes szűrés során munkaerőt és időt/költséget takarítson meg. Az orális folyadékok kényelmesek és kevésbé invazívak, és alkalmasak a közlekedési szűrésre. Összefoglalva, a 6-MAM-ot célzó, a heroinnal való visszaélésre szolgáló orális folyadék LFS ígéretes termék a kábítószeres vezetés elleni küzdelemben.

Etika

A heroinminták kutatásra történő felhasználását a Kínai Közbiztonsági Minisztérium Harmadik Kutatóintézete felügyelte. Minden szerző kijelenti, hogy megfelel az etikai előírásoknak.

Adatok hozzáférhetősége

Az adatok a Dryad Digital Repositoryban vannak letétbe helyezve: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

A szerzők hozzájárulása

L.Z. tervezte ezt a tanulmányt, X.H. és J.Z. pedig segített a 4. és 5. ábrán látható kísérletek végrehajtásában. F.C. és Y.Z. végezte a 6. ábrán látható vizsgálatokat. J.L. elemezte az adatokat és írta a tanulmányt. Minden szerző véglegesen jóváhagyta a publikálást.

Kompetitív érdekek

Kijelentjük, hogy nincsenek konkurens érdekeink.

Finanszírozás

Ezzel a cikkel kapcsolatban nem kaptunk támogatást.

Kizáró nyilatkozat

Az itt kifejtett vélemények, megállapítások és következtetések vagy ajánlások a szerzők sajátjai.

Lábjegyzetek

A cikket a Royal Society of Chemistry szerkesztette, beleértve a megbízást, a szakértői értékelés folyamatát és a szerkesztési szempontokat az elfogadásig.

Google Scholar .