A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: Combining in situ Congo Red Staining and Immunohistochemistry

Abstract

Amyloidosis különböző, különbözőképpen megközelíthető betegségek eredménye. Az amiloidlerakódások altípusának meghatározása elengedhetetlen az alapbetegség megállapításához és végül megfelelő kezeléséhez. Az osztályozáshoz a klasszikus kongóvörössel történő festés mellett további eljárásokra, például immunhisztokémiai festésre van szükség. Itt egy pontosabb megközelítést mutatunk be, amely a rutin diagnosztikában könnyen alkalmazható kongóvörös/immunhisztokémiai kettős festést alkalmaz. A kongóvörös festési technika és az immunhisztokémiai eljárások módosítására volt szükség ahhoz, hogy a két festési eljárást egy tárgylemezen lehessen kombinálni. Az értékelés hagyományos fény- és fluoreszcens mikroszkópiával történt. A kongóvörös festési idő 10 másodpercre való lerövidítésével és az endogén peroxidáz blokkolásával kapcsolatos módosítással pontos eredményeket lehetett elérni a kongóvörös/immunhisztokémiai kettős festés fluoreszcens mikroszkópos értékeléséhez. A 4 μm helyett 2 μm vastagságú metszetek jobbak voltak az értékeléshez, mivel növelték a festési specificitást. A kongóvörös és az immunhisztokémia kombinációja in situ kettős festésként egy tárgylemezen megvalósítható megközelítés az amiloidózis diagnózisában. Lehetővé teszi, hogy az immunhisztokémia kiértékelésekor a fluoreszcens kongóvörös-pozitív területekre fókuszáljunk, így elkerülhető a hamis-pozitív eredmények kiírása. Ezenkívül növeli az immunhisztokémiailag festett metszetek jel-zaj arányát a hagyományos mikroszkópián.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Bevezetés

Amyloidosis a rosszul összehajtogatott fehérjék lerakódásának morfológiai leírása, amely számos különböző szövettípusban megtalálható . Az amiloidot alkotó fehérjék rengeteg forrásból származnak, a daganatoktól kezdve, mint a plazmasejtes daganatok vagy a medulláris pajzsmirigy karcinómák, a krónikus fertőzésekig, vagy az öregedés eredményeként jelentkeznek. Ritka esetekben az amiloidózis genetikailag öröklött fehérje-hibás összecsukódási rendellenességekre vezethető vissza . Az amiloidózis klinikai jelentősége a boncolások során véletlenül előforduló lelettől az életveszélyes betegségekig terjed. A szövetminták vizsgálatakor fontos, hogy a patológusok szem előtt tartsák az amiloidlerakódások valószínűségét, mivel ez lehet az első nyom egy még ismeretlen, súlyos alapbetegségre utaló jel. Fontos, hogy bár vannak ígéretes eredmények a magukat az amiloidlerakódásokat célzó terápiák tekintetében , az amiloidózisban alkalmazott kezelési megközelítések még mindig elsősorban az alapbetegségre irányulnak, és az esetek többségében ezt viszont az amiloid szubtipizálása alapján lehet és kell meghatározni.

Az amiloid klasszikus hisztokémiai festése a Bennhold által 1922-ben bevezetett kongóvörös ; a polarizációt alkalmazó jellegzetes “almazöld” kettőstörést 1927-ben írták le először. A kongóvörös festés érzékenységének és specificitásának növelése érdekében számos módszert alkalmaztak, beleértve a kongóvörössel festett metszetek fluoreszcens fénnyel történő értékelését a kongóvörös ismert fluoreszcens tulajdonságai miatt . Nemrégiben javasolták az amiloid kimutatására a digitálisan megerősített hematoxilin-eozin polarizációs technikát alkalmazó megközelítéseket , amelyek különösen hasznosak az amiloid azonosításában olyan esetekben, amikor kevés szövet áll rendelkezésre.

Az amiloid altípusának meghatározására szolgáló arany standard az immunhisztokémia, beleértve számos jól bevált protokollt ; azonban vannak hiányosságai, különösen az amiloidogén könnyűlánc lambda elleni antitestek gyengébb specificitását figyelembe véve. Az amiloidózis különösen ritka változatainak alcsoportosítására szolgáló új megközelítés a tömegspektrometria ; sajnos a költségek és az elérhetőségi problémák miatt ezt az ígéretes módszert eddig nem alkalmazták széles körben, és további hiányossága, hogy nyilvánvalóan korlátozottan alkalmazható olyan esetekben, amikor kevés szövet áll rendelkezésre vagy korlátozott mennyiségű amiloid rakódik le. Egy másik új keletű eredmény a hasi zsíraspirátumok immunelektronmikroszkópiájának alkalmazása az amiloidlerakódások altípusának meghatározására ; ez azonban egy bonyolult módszer.

Más korábbi tanulmányok a fluoreszcencia és az immunhisztokémia kombinációjára összpontosítottak. Itt további bizonyítékokat mutatunk be egy ilyen megközelítés kivitelezhetőségére, és beszámolunk egy olyan, a rutinba könnyen átültethető protokollról, amely lehetővé tette számunkra, hogy pontosan foglalkozzunk az amiloid szubtipizálással formalinban rögzített és paraffinba ágyazott szöveteken. A kongóvörös/immunhisztokémiai kettős festés lehetővé teszi a kongóvörös-pozitív területekre való fókuszálást az immunhisztokémiai kiértékelés során, és növeli az immunhisztokémiailag festett metszetek jel-zaj arányát a hagyományos fénymikroszkópos kiértékelésnél, javítva mind az eljárás specificitását, mind az érzékenységét, valamint csökkentve a diagnosztikához szükséges szövetmennyiséget.

Anyagok és módszerek

Az esetek kiválasztása

Az archívumunkból származó, bizonyítottan amiloidózis diagnózisú mintákat használtuk az új technika megalapozásához. Ezek felsorolása az 1. táblázatban található, beleértve az adott szövet felhasználásának lépéseit is.

Kongóvörös festési módszerek

A kongóvörös festést kezdetben az intézetünkben kialakított protokoll szerint végeztük: A formalinban rögzített és paraffinba ágyazott szöveteket 6μm vastagságú metszetekre vágjuk, deparaffinizáljuk és 30 percig kongóvörössel festjük.5 g kongóvörös (Merck Millipore, Darmstadt, Németország) és 1 g kálium-hidroxid (Merck Millipore) 500 ml 80%-os etanolban feloldva; ezt követően a metszeteket csapvízzel öblítjük, majd 4 percig hematoxilinnal (Merck Millipore) ellenfestjük. A következő lépésben a metszeteket 0,5%-os HCl/etanol oldatba differenciáljuk, majd ismét 10 percig csapvízzel öblítjük, mielőtt dehidratáljuk és montírozzuk őket.

Vizsgálatunkhoz a protokollt módosítottuk a kongóvörös festési idő tekintetében, hogy megnézzük, a rövidebb festési idő milyen hatással lehet a későbbi immunhisztokémiai festésre. A 2 és 4 μm vastagságú metszeteket is teszteltük.

Immunhisztokémiai festés és endogén peroxidáz blokkolás

A különböző amiloid altípusok immunhisztokémiai festési körülményeit a 2. táblázat tartalmazza. A gyártó javaslatának megfelelően két különböző klónt használtunk az amyloidogén kappa és lambda könnyű láncok kimutatására. Az immunhisztokémiát a kongóvörös festési eljárást követően végeztük. Röviden, a deparaffinált és endogén peroxidázzal blokkolt tárgylemezeket (lásd később) normál ló (AA amiloid festéshez) vagy normál kecske szérumban (minden más festéshez)/Tris-pufferelt sóoldatban (TBS) (900 μl szérum/60 ml TBS) inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten (mindkét szérumot a Vector Lab., Burlingame, Calif, USA), majd egy éjszakán át inkubáltuk a primer ellenanyaggal 4°C-on, majd leöblítettük és biotinilált anti-egér IgG (amiloid AA festéshez) vagy biotinilált antinyúl IgG (minden más festési eljáráshoz) oldattal inkubáltuk (300 μl IgG/900 μl normál ló- vagy kecskeszérum/60 ml TBS; mindkét IgG a Vector Lab.) 30 percig szobahőmérsékleten; végül leöblítettük és avidin-biotin-peroxidáz-kittel (Vectastain, Vector Lab.) inkubáltuk 30 percig, majd kromogénként kész 3-amino-9-etil-karbazol (AEC; Dako, Glostrup, Dánia) (10-20 perc azonnali optikai ellenőrzés mellett) és Meyer-féle hematoxilin (Medite, Dietikon, Svájc) alkalmazásával vizualizáltuk. Az AEC-t részesítettük előnyben, mivel korábbi kísérletek jobb jel-zaj arányt mutattak az AEC vizualizáció esetében, mint a diaminobenzidin vizualizáció esetében. Mivel az AEC vízben és alkoholban oldódik, a tárgylemezeket a fedőlapozás előtt 30 percre Medi-Mount (Medite, Burgdorf, Németország) fedőfestékkel fedtük be.

Mivel a szövetek endogén peroxidáz blokkolására szolgáló szokásos kezelés (3%-os H2O2 oldat 70%-os etanolban) a kongóvörös festés befejezése után a kongófília elvesztéséhez vezetett, az endogén peroxidáz blokkolásának további módszereit vizsgáltuk, mint például: e lépés áthelyezése a kongóvörös festés előtt és a 70%-os etanol desztillált vízzel való helyettesítése.

Értékelés

A kongóvörös/immunhisztokémiai kettős festésű metszeteket elsősorban hagyományos fénymikroszkóppal értékeltük, hogy megbecsüljük, hogy az adott immunhisztokémiai kromogéntermék a diagnosztikus rutinfestéshez képest (kongóvörös előfestés nélkül) a várt módon, rosszabbul vagy jobban láthatóvá vált. Ezt követően fluoreszcens mikroszkópot használtunk rodaminszűrővel (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Németország) a kongóvörös festék fluoreszcenciájának értékelésére. A specifikusan intenzív fluoreszcenciát mutató területeket fénymikroszkópiával tovább értékeltük, hogy immunhisztokémiával kimutathatók-e ezeken a területeken az amiloidlerakódások is.

Eredmények

1. lépés: A kongóvörös festési protokoll módosítása

A kongóvörös festék többféle festési idejét teszteltük. Erre azért volt szükség, mert az antitestek antigénkötő képességét a kongóvörös festési eljárás csökkentette, és a teljes intenzitású kongóvörös megnehezítette az egyidejű értékelést, mivel az immunhisztokémiához a kongóvöröshöz hasonló színű vörös kromogént (AEC) használtak. Az eredeti 30 perces festési időt alkalmazva a hagyományos fénymikroszkópián polarizált szűrővel a kettőstörés kimutatható volt az amiloidlerakódások esetében. Amikor a kongóvörös festés csak 5, 10 vagy 20 s-ig tartott, a fluoreszcens mikroszkóp rhodaminszűrőjét használva mindig pozitív jeleket lehetett kimutatni, míg a hagyományos mikroszkópia csak alkalmanként mutatott kongófíliát és kettőstörést a polarizált szűrő használatával (1. ábra). A további elemzéshez a kongóvörös festési időt lehetőleg 10 s-ra csökkentettük a túlfestés elkerülése érdekében; a 10 s-t praktikussági okokból választottuk (5 s-hoz képest könnyebb folyamatosan betartani) a nedves laboratóriumban.

2. lépés: Az immunhisztokémiai protokollok módosítása a kongóvörös és az immunhisztokémiai festés egy tárgylemezen történő kombinálásához

Első lépésben immunhisztokémiai festést végeztünk külön metszeteken az e vizsgálathoz használt szövetek antigénjeinek megerősítése érdekében, amelyek kielégítő festési eredményeket mutattak a 2. táblázatban részletezett, bevált rutin protokollok alkalmazásával.

Az azonos metszeteken végzett kongóvörös festés (10 s kongóvörös festési idő) és immunhisztokémiai festés kombinálásakor azt tapasztaltuk, hogy az immunhisztokémiai eljárások befejezése után a szövetek endogén peroxidáz blokkolásának szokásos kezelésével (3%-os H2O2-oldat 70%-os etanolban) a kongófília eltűnt, mivel a kongóvörös festék kimosódott. Ezért egy harmadik lépésben módosítottuk az endogén peroxidáz blokkolására szolgáló kezelést. Az endogén peroxidáz blokkolás a hagyományos módszerrel, de a kongóvörös festési eljárás előtt, valamint a 70%-os etanol desztillált vízzel való helyettesítése, amikor az endogén peroxidáz blokkolást a kongóvörös festés után végeztük, kielégítő eredményt hozott mind a kongóvörös festés értékelésében, mind az immunhisztokémiai festésnél. Annak érdekében, hogy a lehető legjobban ragaszkodjunk a szokásos nedves laboratóriumi munkafolyamathoz, a továbbiakban az etanolt desztillált vízzel helyettesítő módszert alkalmaztuk. Az endogén peroxidáz blokkolás elhagyásának megkísérlése mérsékelten csökkentette az AEC vizualizáció jel-zaj eredményeit (feltételezve, hogy a nem blokkolt endogén enzimek hasznosították az AEC-t, és egyrészt enyhén háttérfestettek, másrészt megfosztották az ABC-peroxidáz komplexet a megfelelő vizualizációhoz szükséges kromogéntől), ezért a továbbiakban nem használtuk ki. A kongóvörössel történő előfestést követő immunhisztokémiai festés minősége megegyezett a korábbi kongóvörös festés nélküli immunhisztokémiai festés minőségével; így arra a következtetésre jutottunk, hogy a 10 s-ig kongóvörössel előfestett metszeteken végzett immunhisztokémiai vizsgálat nem vezet antigénvesztéshez vagy nem specifikus festési eredményekhez.

3. lépés: A metszetvastagságok módosítása

Végül megvizsgáltuk a különböző metszetvastagságok (2 és 4 μm) szerepét. Általánosságban elmondható, hogy az immunhisztokémiai festés specificitása és értékelhetősége (jel-zaj arány) jobb volt a vékonyabb metszeteken; emellett a festési eljárások során kevesebb volt a szövetek tárgylemezről való leválását érintő artefaktum. Minden esetben ugyanazok az eredmények születtek, mint az amiloidlerakódások kezdeti diagnosztikai altípusba sorolása során.

Példák a leírt megközelítés rutin diagnosztikai eljárásokba történő implementálására

A 2. és 3. ábra két olyan rutin esetet szemléltet, amelyekben az amiloid altípusba sorolása az ebben a tanulmányban javasolt új algoritmus segítségével volt lehetséges; a hagyományos technika kizárólagos alkalmazásával nem kaptunk értelmezhető eredményeket.

Diszkusszió

Itt bemutatunk és validálunk egy kombinált kongóvörös/immunhisztokémiai kettős festési eljárást, amely lehetővé teszi, hogy az immunhisztokémiai értékelés során a kongóvörös-pozitív területekre fókuszáljunk, ezáltal javítva az in situ alapú amiloid szubtipizálás specificitását. Segít továbbá kímélni a szöveteket, ami azért is fontos, mert a biopsziás anyag egyre korlátozottabbá válik a finom tűmagokat és biopsziás forcipiumokat használó, megváltozott diagnosztikai megközelítések miatt.

Egyéb javasolt új értékelési technikákkal ellentétben, amelyek a kifinomult digitalizált képkiértékelésre összpontosítanak , a mi megközelítésünk könnyen beépíthető a rutin diagnosztikába. Az előfeltételek csak a bevált kongóvörös festés módosítását, a rendelkezésre álló amiloid immunhisztokémiát, valamint a rodaminszűrővel ellátott fluoreszcens mikroszkópot foglalják magukban. Ideális esetben olyan mikroszkópokat kell használni, amelyek mind fluoreszcencia-, mind hagyományos fénymikroszkópiára alkalmasak, mivel ez egyszerűsíti az immunhisztokémia kiértékelésekor az amiloid lerakódás ugyanazon (fluoreszcens) területeinek ellenőrzését a fényforrás és a szűrő egyszerű cseréjével. Azonban két különböző mikroszkópot is lehetne használni, mégis nehéz esetekben a könnyebb kiértékelés érdekében javasolt lehet az adott területek fluoreszcencia- és fénymikroszkópos fotózása.

A korábbi vizsgálatokkal egybehangzóan tudtuk kimutatni, hogy a kongóvörös nem zavarja vagy zavarja az immunhisztokémiát . Ezenkívül a legtöbb eddigi tanulmányban használt 4-6 μm-es metszetvastagságokhoz képest , be tudtuk bizonyítani, hogy az immunhisztokémia szempontjából előnyös (jobb jel-zaj arány, kevesebb leválási artefaktum) 2 μm-es vékonyabb metszetek használata is kielégítő eredményekhez vezethet a kongóvörös festés tekintetében, ha fluoreszcens mikroszkóppal olvassuk le.

A közelmúltban több közlemény is propagálta a fluoreszcencia használatát az amiloid lerakódások értékelésére, és bizonyította annak fölényét a polarizált fénymikroszkópiával szemben, mivel specifikusabb és érzékenyebb . Ebben a tanulmányban ezt a megközelítést több szempontból finomítottuk és optimalizáltuk azáltal, hogy a festési idő, a festési eljárások, valamint a szelvényvastagság tekintetében adaptált protokollt dolgoztunk ki. Ezek a változtatások végül lehetővé tették az in situ kettős festés elvégzését az amiloidlerakódások érzékeny és specifikus kimutatására, valamint e lerakódások szubtípusosítására, ami döntő fontosságú az amiloidlerakódásokhoz vezető alapbetegség megkülönböztetéséhez. Kettős festési módszerünk nem csak az amiloid érzékeny kimutatását teszi lehetővé fluoreszcenciával, és ezzel egyidejűleg a lerakódások specifikus kategorizálását, hanem azt is, hogy megkíméljük az anyagot a sorozatmetszések elkerülésétől, amelyeken az olykor apró amiloid lerakódásokat esetleg már levágták. E kettős festés bevezetése óta már több olyan esetben is alkalmaztuk ezt a megközelítést, amikor más módszerekkel nem lehetett végleges diagnózist felállítani. A 2. és 3. ábra két ilyen esetet szemléltet.

Mégis lehet még hely a további tökéletesítésre. Mivel az endogén peroxidáz blokkolást nem igénylő immunalkalin-foszfatáz alapú kimutatási rendszereket jelenleg nem használjuk immunhisztokémiai munkafolyamatainkban, az immunoperoxidáz alapú kimutatási rendszerek helyettesítése az előbbiekkel tovább javíthatja az eredményeket és karcsúsíthatja a laboratóriumi munkafolyamatot.

Végezetül bemutatunk egy optimalizált és finomított megközelítést a kongóvörös/immunhisztokémiai kettős festésre. Ez a megközelítés előnyös a specificitás, a költségek és a szükséges szövetmennyiség tekintetében. Követelményei minimálisak, és lehetővé kell tennie széles körű alkalmazását.

Megköszönések

Thomas Menter munkáját a Nuovo-Soldati Cancer Research Foundation (Vaduz, Liechtenstein) támogatja.

Etikai nyilatkozat

A vizsgálatban csak a bázeli Pathológiai Intézet archív humán anyaga vesz részt, és azt az Északnyugat- és Közép-Svájci Etikai Bizottság jóváhagyta (EKNZ 2014-252). Állatok bevonása nem történt.

Közzétételi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy nem állnak összeférhetetlenségben.

Author Contacts

Cikk / Publikációs adatok

Copyright / Gyógyszeradagolás / Jogi nyilatkozat

Copyright: Minden jog fenntartva. A kiadó írásbeli engedélye nélkül a kiadvány egyetlen része sem fordítható le más nyelvekre, nem reprodukálható vagy hasznosítható semmilyen formában vagy bármilyen elektronikus vagy mechanikus eszközzel, beleértve a fénymásolást, a rögzítést, a mikromásolást, vagy bármilyen információtároló és -kereső rendszerrel.
Drogadagolás: A szerzők és a kiadó minden erőfeszítést megtettek annak érdekében, hogy a szövegben szereplő gyógyszerkiválasztás és adagolás megfeleljen a kiadás időpontjában érvényes ajánlásoknak és gyakorlatnak. Tekintettel azonban a folyamatos kutatásokra, a kormányrendeletek változásaira, valamint a gyógyszerterápiával és a gyógyszerreakciókkal kapcsolatos információk folyamatos áramlására, az olvasót arra kérik, hogy ellenőrizze az egyes gyógyszerek betegtájékoztatóját az indikációk és az adagolás esetleges változásairól, valamint a hozzáadott figyelmeztetésekről és óvintézkedésekről. Ez különösen fontos, ha az ajánlott szer új és/vagy ritkán alkalmazott gyógyszer.
Kizáró nyilatkozat: A jelen kiadványban szereplő kijelentések, vélemények és adatok kizárólag az egyes szerzők és közreműködők, nem pedig a kiadók és a szerkesztő(k) sajátjai. A reklámok és/vagy termékreferenciák megjelenése a kiadványban nem jelent garanciát, jóváhagyást vagy jóváhagyást a reklámozott termékekre vagy szolgáltatásokra, illetve azok hatékonyságára, minőségére vagy biztonságosságára vonatkozóan. A kiadó és a szerkesztő(k) kizárják a felelősséget a tartalomban vagy a hirdetésekben hivatkozott ötletekből, módszerekből, utasításokból vagy termékekből eredő bármilyen személyi vagy vagyoni kárért.