A Sanglong Pingchuan főzet antiasztmatikus hatása a kiegyensúlyozott Th1/Th2 immunválasz kiváltása révén

Abstract

Cél. A Sanglong pingchuan főzet (SLPCD) antiasztmatikus hatásainak vizsgálata és hatásmechanizmusainak feltárása. Módszerek. OVA-indukált allergiás asztmás egerek szérumát, bronchoalveoláris mosófolyadékát (BALF) és tüdőszövetét gyűjtöttük 24 órával az utolsó adagolás után. A tüdő patológiai elváltozásait H&E festéssel figyeltük meg. A BALF-ban lévő gyulladásos sejteket áramlási citometriával számoltuk meg. A teljes IgE szintjét a szérumban és a citokinek szintjét a BALF-ban ELISA-val határoztuk meg. A citokin mRNS expressziós szintjét a tüdőben qRT-PCR segítségével vizsgáltuk. Eredmények. Az SLPCD szignifikánsan gátolta a légúti gyulladást, csökkentette a gyulladásos sejtek számát a BALF-ban, csökkentette a teljes IgE szintjét a szérumban és a Th2 citokinek (IL-10 és IL-13) szintjét a BALF-ban, és lefelé szabályozta a Th2 citokinek (IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13) mRNS expressziós szintjét asztmás egerek tüdejében. Az SLPCD azonban jelentősen megemelte a Th1 citokin IFN-γ szintjét a BALF-ben, és felszabályozta a Th1 citokinek (IL-2 és IFN-γ) mRNS-expressziós szintjét az asztmás egerek tüdejében. Következtetés. Az SLPCD mérsékelheti a légúti gyulladást és enyhítheti az asztmás egerek patogenezisét a kiegyensúlyozott Th1/Th2 válasz indukálásán keresztül, és hatékony gyógyszerként működhet az asztma kezelésében.

1. Bevezetés

Az asztma egy komplex, krónikus légúti betegség, amelyet a hörgők hiperreaktivitása, a légúti gyulladás és átalakulás, a légáramlás elzáródása, valamint a citokinek és más mediátorok által indukált különböző gyulladásos sejtek beszivárgása jellemez . Az asztmát környezeti tényezők, például allergének, vírusok és foglalkozási expozíciók okozzák a genetikailag hajlamos egyéneknél; a végleges oka azonban nem tisztázott . Az asztma előfordulása világszerte jelentősen megnőtt, különösen a kisgyermekek körében, és az egyik leggyakoribb légzőszervi betegséggé vált . Becslések szerint a különböző országokban 300 millió embert érint az asztma .

Jelenleg a kortikoszteroidok a leghatékonyabb gyógyszerek az asztma kezelésére . Bár ezek a gyógyszerek javíthatják az asztma tüneteit, nem gyógyítják ezt a betegséget . Ezeknek a szereknek súlyos mellékhatásaik is vannak, különösen gyermekeknél, beleértve az immunszupressziót, másodlagos fertőzéseket, izomsorvadást, csontritkulást, csontritkulást, szürkehályogot és zöldhályogot . Ezért az új, biztonságos és hatékony gyógyszerek folyamatos keresése rendkívül fontos.

Sok hagyományos kínai gyógyszert évszázadok óta használnak az asztma kezelésére, és az ázsiai országokban még mindig széles körben alkalmazzák . A közelmúltban számos, az allergiás asztma kezelésére használt növényi formula hatásmechanizmusáról számoltak be . Különböző gyulladáscsökkentő tulajdonságokkal rendelkező növényi eredetű természetes termékeket is átvilágítottak az asztma kezelésében való lehetséges alkalmazás szempontjából .

A Sanglong pingchuan főzet (SLPCD) egy kórházi készítmény, amelyet Qing Chang professzor, a hagyományos kínai orvoslás nemzeti veterán orvosa, a hagyományos kínai orvoslás örökölt stúdió mentora írt fel a Shaoxing Hagyományos Kínai Orvosi Kórházban. Az SLPCD a Shegan Mahuang Tangból származik összeadással és kivonással. A Shegan Mahuang Tang egy jól ismert hagyományos kínai vényköteles gyógyszer, amelyet először a Jin Kui Yao Lve című könyvben említettek. A Shegan Mahuang Tang a hideg eloszlatásának, a külső szindróma enyhítésének, a tüdő felmelegítésének, a váladék eltávolításának és az asztma enyhítésének reprezentatív készítményeként széles körben használják asztma, gyermekkori hörghurut, hörgőasztma, tüdőgyulladás, időskori akut és krónikus hörghurut, tüdőtágulás és allergiás nátha kezelésére. Az SLPCD képlete az 1. táblázatban felsorolt tizenhárom hagyományos kínai gyógyszerből állt. Egy randomizált vizsgálat kimutatta, hogy az SLPCD hatékony az asztma kezelésében, különösen az exacerbációs arány csökkentésében. Az SLPCD hatékonyságát azonban nem bizonyították ellenőrzött kísérletekkel.

A jelen vizsgálatban az SLPCD klinikai alkalmazásának kísérleti megalapozása az asztma kezelésében és hatásmechanizmusának feltárása céljából OVA-indukált allergiás asztma egérmodell segítségével, az SLPCD gyulladáscsökkentő hatását szövettani vizsgálattal, az immunsejtek számbavételével a bronchoalveoláris mosófolyadékban (BALF), a teljes IgE mennyiségi meghatározásával a szérumban, a citokin mennyiségével a BALF-ban és a citokin mRNS-expressziójával a tüdőszövetekben vizsgáltuk.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Növényi anyagok és reagensek

Cortex Mori (tételszám: 140901), Pheretima Aspergillum (tételszám: 150406), mézzel feldolgozott Herba Ephedrae (tételszám: 150302), Rhizoma Belamcandae (tételszám: 141213), Semen Armeniacae Amarum (tételszám: 150312), kevergetve sütött Fructus Perillae (tételszám: 150115), Scorpio (tételszám: 150126), Semen Descurainiae (tételszám: 150208), mézben sült Flos Farfarae (tételszám: 150301), Herba Houttyniae (tételszám: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (tételszám: 150308), Radix Angelicae Sinensis (tételszám: 150213) és a Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (tételszám: 140917) a Shaoxing Kínai Orvosi Kórházból származik, és a Shaoxing Institute for Food and Drug Control, Zhejiang, Kína, Yonghai Jiang professzor hitelesítette őket. A klorogénsav és a rutin standardjait a Zhejiang Institute for Food and Drug Controltól vásároltuk, Hangzhou, Kína, és mindkét vegyület tisztasága több mint 98% volt.

Ovalbumin (OVA) a Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA; egér IL-10, IL-13 és IFN-γ detektáló ELISA-készleteket a Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd., Hubei, Kína; az egér IgE ELISA kit a RayBiotech Inc., Norcross, GA, USA-tól, a magzati borjúszérum (FCS) a Gibco, Grand Island, NY, USA-tól származott. A tisztított anti-egér CD16/CD32 (Fc-receptor blokk), Ly-6G-FITC (klón: RB6-8C5), F4/80 antigén PE-Cy5 (klón: BM8), Ly-6C-APC (klón HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alfa (FceR1)-APC (klón: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, klón: 2B8) és siglec-F-PE (klón: E50-2440) antitesteket az eBioscience, Inc. cégtől vásároltuk, San Diego, CA, USA. A Trizol reagens az Invitrogen, Carlsbad, CA, USA-tól származott; a revert Aid™ M-MLV reverz transzkriptáz a Fermentas, Amherst, NY, USA-tól; a ribonukleáz inhibitor és az oligo(dT)18 a Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Kína; a FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) a Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA-tól. Az alumínium-hidroxid gélt (Alum) a China Animal Husbandry Industry Co., Ltd., Peking, Kína; a dexametazon (Dex) a Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, Kína.

2.2. A Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, Kína. SLPCD előállítása

A vényköteles SLPCD gyógyszereket (440 g) 8 aliquot desztillált vízben 30 percig maceráltuk, majd 1 órán keresztül vizet forralva főztük. Az első főzet után a főzetet 6 aliquot desztillált vízben további 30 percig főztük. A kétszeres főzetből nyert felülúszót steril gézen átszűrtük, és rotavaporral (Buchi, Svájc) csökkentett nyomáson, 65°C-on 1,1 g nyers hatóanyag/ml végkoncentrációig koncentráltuk. A koncentrált főzetet -20°C-on tároltuk, majd a felhasználás előtt desztillált vízzel több különböző koncentrációra hígítottuk.

2.3. A koncentrált főzetet -20°C-on tároltuk. Az SLPCD nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) elemzése

A HPLC-elemzést Diamon C18 oszlop (250 mm × 5 mm, 5 μm) és Waters 2996 PDA detektor segítségével végeztük a Water 600E HPLC műszeren. A mobilfázis acetonitril (A) és 0,1%-os foszforsav (B) keveréke volt. A lineáris gradiens elúciót a következőképpen végeztük: 0-8 perc 2%-os A mellett, 8-35 perc 6%-os A mellett, 35-40 perc 8%-os A mellett, 40-45 perc 13%-os A mellett, 45-70 perc 14%-os A mellett, 70-80 perc 17%-os A mellett és 80-90 perc 17-2%-os A mellett. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt, az injektálási térfogat 10 μl. A kolonna hőmérsékletét folyamatosan 30°C-on tartottuk. A standardok (klorogénsav és rutin) és a minták HPLC-analízisét a fent említett, meghatározott kísérleti körülmények között végeztük.

2.4. Kísérleti állatok

5 hetes nőstény BALB/c egereket vásároltunk a Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kína (SCXK 2007-0005 számú tanúsítvány). Az egereket a felhasználás előtt 1 hétig akklimatizálták. A rágcsáló laboratóriumi takarmányt és csapvizet ad libitum biztosítottuk, és ellenőrzött körülmények között tartottuk őket, 24 ± 1°C hőmérsékleten, 50 ± 10% páratartalom mellett, 12/12 órás világos/sötét ciklusban. Minden eljárás szigorúan megfelelt a laboratóriumi állatok felhasználásáról és gondozásáról szóló kínai törvényeknek, valamint a Zhejiang Egyetem Kísérleti Állatok Intézete által meghatározott irányelveknek, és az egyetemi állatkísérleti bizottság jóváhagyta.

2.5. Egerek érzékenyítése, kihívása és kezelése

A nőstény BALB/c egereket hat csoportra osztottuk: normál kontroll csoport (NC), modell kontroll csoport (MC), pozitív kontroll csoport (Dex-szel kezelve, 2 mg/kg) és SLPCD csoportok (5,5, 11 és 22 g/kg). Minden csoport tíz egérből állt. Az egerek légúti gyulladását OVA-val indukálták. Az állatokat 50 μg OVA-t és 200 μg alumínium-hidroxidot tartalmazó oldat intraperitoneális injekciójával immunizálták 3 napon keresztül. A 14. napon fokozó szenzibilizációt adtak. Egy héttel az utolsó szenzibilizálás után az egereket PARI TurboBOY N (1205) porlasztóval (PARI GmbH, Németország) napi 1 órán keresztül, 8 napon keresztül naponta 1 órán keresztül aeroszolizált 2% OVA-nak tették ki. Négy nappal a kihívás előtt a szenzibilizált egereknek szájon át SLPCD-t adtak 5,5, 11 és 22 g/kg dózisban, vagy intraperitoneálisan 2 mg/kg dexametazon (Dex) injekciót adtak 12 napon keresztül minden nap. A modell-kontrollcsoportok ugyanolyan mennyiségű sóoldatot kaptak. A dózis mennyisége 0,2 ml/10 g testtömeg volt. Tíz egeret, mint a normál kontrollcsoportot, csak szenzibilizáltak és sóoldattal provokáltak. Az OVA-szenzitizációhoz és a kihíváshoz, valamint az SLPCD-vel történő kezeléshez alkalmazott eljárásokat az 1. ábra mutatja.

1. ábra

Kísérleti protokoll az OVA-indukált asztmás modellhez és a kezelési folyamatokhoz. Tüdőhisztopatológia

A tüdőszöveteket 24 órával az utolsó beadást követően gyűjtöttük, majd 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, paraffinba ágyaztuk és 5 μm vastagságban metszettük. A mikroszelvények sorozatát hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festették meg a szövettani értékeléshez.

2.7. Bronchoalveoláris lavázsfolyadék (BALF) gyűjtése és áramlási citometria

A BALF gyűjtése a tüdő foszfátpufferes oldattal (PBS) történő átmosásával történt, amelyet endotracheális katéteren keresztül adtak be 24 órával az utolsó beadást követően. A BALF-et 5 percig centrifugáltuk, majd a sejteket jéghideg, 2% FCS-t tartalmazó PBS-szel mostuk. A sejteket 0,5 μg tisztított anti-egér CD16/CD32 (FcR blokk) ellenanyaggal 10 percig jégen blokkoltuk a nem specifikus festődés gátlása érdekében, majd az anti-egér Ly-6G-FITC, F4/80 antigén-PE-Cy5 és Ly-6C-APC, vagy FceR1-APC, CD117-FITC és Siglec-F-PE antitestek kombinációjával festettük szobahőmérsékleten, 30 percig sötétben. A festett sejteket jéghideg PBS-szel mostuk és PBS-ben reszuszpendáltuk. Kezelésenként százezer életképes sejtet elemeztünk BD FACScan áramlási citométerrel, CellQuest szoftverrel.

2.8. Az összes IgE antitest mérése a szérumban

A szérumot 24 órával az utolsó beadást követően gyűjtöttük. A teljes IgE antitestet az egyes szérummintákban a RayBio® egér IgE ELISA kit segítségével mutattuk ki. Az 1:1250 arányban hígított szérummintákat vagy az IgE standardot specifikus egér anti-IgE ellenanyaggal bevont 96 lyukú lemezekhez adtuk. A lemezeket 2,5 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd négyszer mostuk. A detektáló antitestet minden egyes lyukba hozzáadtuk. A lemezeket szobahőmérsékleten inkubáltuk 1 órán át, mielőtt hozzáadtuk a torma-peroxidázzal konjugált ABC-t. A 45 perces inkubációt követően a lemezeket mostuk, majd TMB-vel 30 percig szobahőmérsékleten fejlesztettük. A reakciót 20 μl stop-oldat hozzáadásával állítottuk le. Az abszorbanciát az ELISA olvasón (BIO-RAD 680) 450 nm-en mértük.

2.9. A citokinek mérése a BALF-ban

A Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13) és Th1 (IFN-γ és IL-2) citokinek koncentrációját a BALF-ban kereskedelmi ELISA-készletekkel mutattuk ki, a korábbiak szerint.

2.10. Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

A Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13) és Th1 (IFN-γ és IL-2) citokinek mRNS-expressziós szintjét a tüdőszövetekben qRT-PCR segítségével határoztuk meg. A teljes RNS-t homogenizált tüdőszövetekből izoláltuk Trizol reagenssel a gyártói protokoll szerint, és a reverz transzkripciót a korábbiak szerint végeztük. Ezután az amplifikációt 20 μl-es reakcióban végeztük FastStart Universal SYBR Green Master segítségével. A valós idejű PCR-t ABI 7400 Real-Time PCR rendszerrel végeztük. A qRT-PCR-hez használt primereket a Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. szintetizálta. (Kína) gyártotta, és a szekvenciákat a 2. táblázat tartalmazza. A qPCR ciklust a következőképpen végeztük: kezdeti denaturálás 95°C-on 10 percig, majd 40 ciklus denaturálás 95°C-on 10 s-ig, lágyítás 60°C-on 1 percig. Endogén kontrollként a GAPDH-t használtuk. A primerek amplifikációs hatékonyságát és specificitását minden egyes primercsoport esetében ellenőriztük. A vizsgált gének GAPDH-hoz viszonyított expressziós szintjét a módszerrel és a fold indukcióban határoztuk meg.

Gén Primer szekvencia Produkt mérete (bp) GAPDH 5′- GAPDH .AGCCTCGTCCCCGTAGACAA-3′ 104 5′-AATCTCCACTTTGCCACTGC-3′ IL-2 5′-CCCAAGCAGCAGGCCACACAGAATTGAAA-3′ 81 5′-AGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3′ IFN-γ 5′- TCTTGAAAGACAATCAGGCCATCA -3′ 233 5′- GAATCAGCAGCGACTCCTTTTCC -3′ IL-4 5′-CAAACGTCCTCACAGCAACAACG-3′ 203 5′-CTTGGACTCATTCATCATGGTGC-3′ IL-5 5′- GCTGGCCTCAAACTGGTAATGTA – -3′ 100 5′- GGCAATGGTGCATGTCTGTAACCTC -3′ IL-10 5′- GCTCTTACTGACTGGCATGAG- -3′ 105 5′- CGCAGCTCTAGGAGCATGTG -3′ IL-13 5′- GCTTGCCTTGGTGGTCTCGCC -3′ 175 5′- GGGCTACACAGAACCCGCCA -3′

2. táblázat

A qRT-PCR-hez használt primer szekvenciák.

2.11. Statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± standard eltérés (SD) értékben fejeztük ki, és a különbségek statisztikai szignifikanciáját ANOVA és Tukey post hoc teszt segítségével vizsgáltuk. A 0,05-nél kisebb értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

3. Eredmények

3.1. Az eredmények

3. Az SLPCD HPLC-profilja

Az SLPCD klorogénsav- és rutin-tartalmát HPLC-vel elemeztük. A standard referencia vegyületekkel összehasonlítva a klorogénsavat és a rutint azonosították és meghatározták (2. ábra). A standardok kalibrációs görbéjének regressziós egyenletei A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) és A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) voltak a klorogénsav és a rutin esetében. A klorogénsav és a rutin koncentrációja az SLPCD-ben 1,4 mg/g, illetve 0,15 mg/g volt.

(a)

(b)

(a)
(b)

2. ábra

Az SLPCD HPLC kromatogramjai. A standard referencia vegyületek (a) és az SLPCD (b) reprezentatív kromatogramjai láthatóak. ① Klorogénsav és ② rutin.

3.2. Az SLPCD mérsékelte a légúti gyulladást asztmás egerekben

Az SLPCD hatását az OVA által kiváltott asztmás egerek tüdőgyulladására H&E festéssel figyeltük meg, és az eredményeket a 3. ábra mutatja. Az asztmás modell egerek súlyosabb intersticiális, peribronchioláris és perivascularis gyulladásos sejtinfiltrációt mutattak a tüdőben, mint a normál kontroll egerek. Pozitív kontrollként a Dex jelentősen enyhítette a tüdő intersticiális, peribronchioláris és perivascularis gyulladásos sejtek infiltrációját az asztmás egerekben. Az OVA-val megfertőzött egerek tüdejében a gyulladásos infiltrátumokat az SLPCD szintén jelentősen mérsékelte a modellkontrollhoz képest.

(a)

(b)

(c)

.

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

3. ábra

Az SLPCD-kezelés hatása a tüdő szövettani változásaira. A tüdőmetszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük. Az ábrázolt fénymikroszkópos felvételek csoportonként tíz egérből származó tüdőmetszetek reprezentatív felvételei. (a) Normál kontroll (NC); (b) modellkontroll (MC); (c) dexametazon (Dex, pozitív kontroll); (d) SLPCD (5,5 g/kg); (e) SLPCD (11 g/kg); és (f) SLPCD (11 g/kg).

3,3. Az SLPCD csökkentette a gyulladásos sejtek számát az asztmás egerek BALF-jában

Megállapítani az SLPCD hatását az OVA-indukált asztmás egerek tüdejében a gyulladásos sejtek beszivárgására, a gyulladásos sejtek, köztük az eozinofilek (Sigilec F+), bazofilek (CD117+), neutrofilek (Ly-6C+y-6), makrofágok (F4/), monociták (Ly6G-Ly6C+) és hízósejtek (FcER1+) számolását a BALF-ben áramlási citometriával végeztük. Amint a 4. ábra mutatja, az asztmás egerek BALF-jában az eozinofilek (1756-szoros), makrofágok (114-szeres), neutrofilek (110-szeres), bazofilok (91,7-szeres), monociták (45,8-szeres) és hízósejtek (6,9-szeres) száma jelentősen megemelkedett a normál kontroll egerekhez képest. A Dex jelentősen csökkentette az asztmás egerek BALF-jában vizsgált különböző gyulladásos sejtek számát (), majdnem közel a normál egerek szintjéhez. Ezeknek a gyulladásos sejteknek a számát az asztmás egerek BALF-jában az SLPCD szignifikánsan dózisfüggően csökkentette a modell-kontrollcsoporthoz képest (, , vagy ).

4. ábra

A SLPCD hatása a gyulladásos sejtek BALF-be történő toborzására OVA-indukált asztmás egerekben. A BALF-ot 24 órával az utolsó adagolás után gyűjtöttük, és a sejtösszetételt a szövegben leírt FACS-elemzéssel vizsgáltuk. Az értékeket átlag ± SD () értékekben adtuk meg. Az asztmás modell kontrollcsoportjához (MC) viszonyított szignifikáns különbségeket , , és jelöljük. Dex: dexametazon (pozitív kontroll), NC: normál kontrollcsoport.

3.4. Az SLPCD csökkentette az asztmás egerek szérum összes IgE-szintjét

Az SLPCD hatását az asztmás egerek szérum összes IgE-szintjére az 5. ábra mutatja. Az asztmás egerek szérum összes IgE antitest szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a normál kontroll egereké (). Pozitív gyógyszerként a Dex szignifikánsan csökkentette a szérum összes IgE antitest szintjét az OVA-indukált asztmás egerekben (). Az asztmás egerek szérum összes IgE antitest szintjét az SLPCD szignifikánsan dózisfüggően csökkentette a modell kontrollcsoporthoz képest ().

5. ábra

Az SLPCD hatása az OVA-indukált asztmás egerek szérumának összes IgE szintjére. A szérumot 24 órával az utolsó beadást követően gyűjtöttük, és az összes IgE szintjét a szövegben leírt ELISA-készletekkel mértük. Az értékeket átlag ± SD () értékekben adtuk meg. Az asztmás modell kontrollcsoportjához (MC) viszonyított szignifikáns különbségeket . Dex: dexametazon (pozitív kontroll) és NC: normál kontrollcsoport.

3.5. Az SLPCD modulálta a citokinek szintjét az asztmás egerek BALF-jában

A Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13) és Th1 (IFN-γ és IL-2) citokinek szintjét a BALF-ban ELISA-val mértük. Amint az a 6. ábrán látható, az OVA-kihívás az IL-10 és az IL-13 szintjének szignifikáns növekedéséhez és az IFN-γ szintjének csökkenéséhez vezetett az asztmás egerek BALF-jában a normál kontrollcsoporthoz képest ( vagy ). Ugyanakkor az IL-4, IL-5 és IL-2 tartalma a modellkontroll egerek BALF-ében nagyon alacsonynak és a kimutatási határ közelében lévőnek bizonyult. Az SLPCD három dózisban és a Dex adása jelentősen csökkentette az IL-13 és az IL-10 szintjét, valamint jelentősen megemelte az IFN-γ szintjét az OVA által kiváltott asztmás egerek BALF-jában a modellkontroll egerekhez képest ( vagy ) (6. ábra).

6. ábra

A SLPCD hatása a citokinek szintjére OVA-indukált asztmás egerek BALF-jában. A BALF-et 24 órával az utolsó beadást követően gyűjtöttük. A Th1 (IL-10 és IL-13) és Th1 (IFN-γ) citokinek szintjét a BALF-ban a szövegben leírt ELISA-készletekkel mértük. Az értékeket átlag ± SD () értékekben adtuk meg. Az asztmás modell kontrollcsoportjához (MC) viszonyított szignifikáns különbségeket és jelöljük. Dex: dexametazon (pozitív kontroll) és NC: normál kontrollcsoport.

3.6. Az SLPCD szabályozta a citokinek mRNS-expressziós szintjét az asztmás egerek tüdőszöveteiben

Az SLPCD hatását a Th1 és Th2 típusú citokinek mRNS-expressziójára az OVA-indukált asztmás egerek tüdőszöveteiben qRT-PCR segítségével mutattuk ki, és az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. A normál kontroll egerekhez képest a Th2 citokin mRNS-ek (IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13) expressziós szintje jelentősen felfelé, a Th1 citokin mRNS-ek (IL-2 és IFN-γ) expressziós szintje pedig jelentősen lefelé szabályozott volt az asztmás egerek tüdőszöveteiben (P < 0,001). Az SLPCD három dózisban és Dex adása a Th2 citokinek IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13 mRNS expressziós szintjének szignifikáns downregulációját és a Th1 citokinek IL-2 és IFN-γ mRNS szintjének upregulációját eredményezte az asztmás egerek tüdőszöveteiben az asztmás modellcsoportokhoz képest (P < 0,05, P < 0,01, vagy P < 0,001).

Group Dose IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 IL-2 IFN-γ NC – 1.00±0.14 1.00±0.23 1.00±0.19 1.00±0.31 1.00±0.19 1.00±0.13 MC – 38.91±2.96 5.22±0.64 7.49±0.23 142.3±14.6 0.73±0.13 0.59±0.15 CTX (mg/kg) 50 19.08±2.62 2.56±0.42 5.07±0.67 44.00±7.74 1.20±0.20 2.14±0.34 SLPCD (g/kg) 5.5 21.70±4.64 4.06±0.38 6.68±0.68 71.26±10.62 1.28±0.20 1.12±0.20 11 21.30±3.71 3.74±0.37 6.21±0.44 65.4±11.99 1.33±0.26 1.53±0.21 22 23.09±3.27 3.07±0.34 6.03±0.65 61.51±8.77 1.49±0.34 1.71±0,23

A tüdőszöveteket 24 órával az utolsó beadást követően gyűjtöttük, és a GAPDH és a citokinek mRNS-expressziós szintjét qRT-PCR segítségével, specifikus primerek használatával detektáltuk. A GAPDH háztartási gént endogén kontrollként használtuk. Az értékeket átlag ± SD () értékekben adtuk meg. Az asztmás modell kontrollcsoportjához (MC) viszonyított szignifikáns különbségeket , , és jelöljük. Dex: dexametazon (pozitív kontroll) és NC: normál kontrollcsoport.

3. táblázat

A SLPCD hatása a citokinek mRNS-expressziós szintjére OVA-indukált asztmás egerek tüdőszöveteiben.

4. Megbeszélés

Az asztma világszerte közegészségügyi problémává vált, különösen a fejlett országokban . A glükokortikoidok az asztma kezelésének és kontrolljának első vonalbeli terápiája. Bár ezek a gyógyszerek javíthatják az asztmás tüneteket, súlyos mellékhatásaik miatt szigorúan ellenőrizték tartós alkalmazásukat . Ezért új asztmás terápiás megközelítésekre van szükség. Számos hagyományos kínai gyógyszer különböző biológiai aktivitást mutat, beleértve az antibakteriális, gombaellenes, gyulladáscsökkentő, anafilaxiaellenes és immunmoduláló hatásokat, amelyek potenciálisan alkalmasak az asztma kezelésére. Az allergiás bronchopulmonális gyulladás különböző modelljeit írták le kísérleti egerekben. Az OVA-indukált allergiás asztma egérmodell a humán asztma számos jellemzőjét reprodukálja, amely széles körű elfogadottságot nyert. Ezért megvizsgáltuk az SLPCD antiasztmatikus hatásait és feltártuk molekuláris mechanizmusait e modell segítségével.

Az SLPCD 13 hagyományos kínai gyógyszerből áll. A Cortex Mori, a Pheretima Aspergillum és a Herba Ephedrae az elsődleges összetevő, amely szétszórja a tüdőt és enyhíti az asztmát. A Semen Armeniacae Amarum, a kevergetve sütött Fructus Perillae, a Semen Descurainiae és a mézben sült Flos Farfarae kiegészítő összetevők, amelyek csökkentik a váladékot, enyhítik a köhögést és az asztmát. A segédkomponensek közé tartozik a Rhizoma Belamcandae, a Herba Houttyniae és a Rhizoma Fagopyri Dibotrydis, amelyek megtisztítják a hőgonoszt és kiűzik a felszíni gonoszságokat, valamint a Scorpio és a Radix Angelicae Sinensis, amelyek eloszlatják a vér pangását, kotyvasztják a mellékvizeket, görcsoldó hatásúak és megállítják az asztmát. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmonizál minden gyógyszert. Együttesen az összes összetevő kiegészíti egymást, hogy elérjék a tüdő szétszórásának, a Qi leereszkedésének, valamint a köhögés és az asztma enyhítésének eredményeit. Az ebben a vizsgálatban használt SLPCD minőségellenőrzését HPLC-vel végezték, és két referenciakémiai anyagot (klorogénsav és rutin) azonosítottak fő indexkomponensként (2. ábra).

Az allergiás asztma meghatározása szerint a légutak akut-on-krónikus gyulladásos betegsége jellegzetes eozinofil rekrutációval, a goblet sejtek hiperpláziájával, nyálka hipersekrécióval, kollagénlerakódással, simaizomsejt hipertrófiával és szubepithelialis fibrózissal . Ebben a vizsgálatban az SLPCD-kezelés hatását a tüdőgyulladásra OVA-kihívású asztmás egerekben H&E festéssel vizsgálták. Asztmás modellegerek tüdőszöveteiben megfigyelték a gyulladásos sejtek tipikus allergiás felhalmozódását és beszivárgását. Az SLPCD kezelése csökkentette a gyulladásos infiltrátumokat az asztmás egerek tüdőszöveteiben (3. ábra), ami arra utal, hogy az SLPCD jelentősen enyhítette a légúti gyulladást.

A gyulladásos immunsejtek kulcsszerepet játszanak az asztma patogenezisében és súlyosságában. A regionális nyirokcsomókból a légutakba toborzott gyulladásos sejtek citokineket és kemokineket szekretálhatnak, ami légúti hiperreaktivitást eredményez . A légutakban lévő gyulladásos sejtek csökkentése hatékony módja az asztma kezelésének . Annak megerősítése érdekében, hogy az SLPCD képes gátolni a gyulladásos sejtek beszivárgását, tovább számoltuk az eozinofileket, makrofágokat, neutrofileket, bazofilokat, monocitákat és hízósejteket a BALF-ben. Az OVA belégzése e hatféle gyulladásos sejt számának jelentős növekedéséhez vezetett a BALF-ben (4. ábra). A növekedés mértéke 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 és 6,9-szeres volt az eozinofilek, makrofágok, neutrofilek, bazofilok, monociták és hízósejtek esetében, ami az exacerbált asztma modell kielégítő létrehozását jelzi ebben a vizsgálatban. Az SLPCD-vel történő kezelés jelentősen és dózisfüggően csökkentette ezen gyulladásos sejtek, különösen az eozinofilek számát a BALF-ban az asztmás egerekhez képest (4. ábra). Ezek az eredmények azt sugallták, hogy az SLPCD csökkentette a gyulladásos sejtek beszivárgását a tüdőbe az OVA-indukált asztmás egerekben, ami összhangban van a szövettani megfigyelés eredményeivel.

Ez jól ismert, hogy az IgE antitest szintjének emelkedése összefüggésbe hozható a légutak allergiás gyulladásával és a hörgők hiperreaktivitásával az asztma modell egerekben . Coyle és munkatársai arról számoltak be, hogy az anti-IgE antitestek csillapították az eozinofil légúti gyulladást és a hörgők hiperreaktivitását asztmás egerekben. Az allergén által kiváltott IgE az eozinofileket, a bazofilokat és a hízósejteket IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13 citokinek szekréciójára késztette . Ezért megvizsgáltuk a szérum teljes IgE-szintjét, és azt találtuk, hogy az SLPCD szignifikánsan csökkentette a szérum teljes IgE-szintjét az OVA-kihívott asztmás egerekben (5. ábra).

A Th1/Th2 sejtek egyensúlyhiányát tartják az asztma immunológiai okának . Asztmában a Th1 sejtek aktivitása csökken, míg a Th2 sejtek aktivitása aktiválódik, ami a Th2 típusú citokinek növekedését és a Th1 citokinek csökkenését eredményezi . A tüdőbe vándorolt Th2 sejtek szekretálják a prototipikus Th2 típusú IL-4, IL-5 és IL-13 citokineket, ami a légutakban göbörsejt-hyperpláziát, bronchokonstrikciót és eozinofíliát eredményez . In vitro az IL-13 közvetítheti az IgE termelődését, és kulcsszerepet játszhat az IgE által közvetített allergiás betegségek patogenezisében . Az IL-13 fokozhatja az eozinofilek túlélését is, és hozzájárulhat e sejtek patológiás tevékenységéhez az asztmában . Az IL-13-at túlexpresszáló egerek az asztma számos jellemzőjét reprodukálják, beleértve a tüdő eozinofíliát, epithelialis hiperpláziát, légúti obstrukciót és a kolinergre adott hiperreakciót.

A Th2 citokinek termelésének elnyomása hasznosnak bizonyulna az allergén immunterápiában . Másrészt a Th1-aktivált sejtek gátolhatják az asztmás légutak gyulladását . A Th1 citokinek, mint például az IFN-γ, gátolják az allergén által kiváltott eozinofil rekrutációt és IgE felszabadulást a GATA-3, IL-4 és IL-5 expressziójának downregulálásán keresztül az asztmás modell tüdőszöveteiben . Ebben a vizsgálatban megbecsültük az SLPCD hatását a citokinek szintjére az asztmás egerek BALF-jában. Az eredmények azt mutatták, hogy az SLPCD dózisfüggően nemcsak az IL-13 és IL-10 szintjét csökkentette, hanem az IFN-γ szintjét is megemelte az asztmás egerek BALF-ében (6. ábra). Az SLPCD kezelés Th2 citokinek termelését gátló hatása összhangban volt a szérumban lévő összes IgE szintjére gyakorolt hatásával.

Az IL-5-ről azt jelentették, hogy fontos szerepet játszik az eozinofilek proliferációjában, differenciálódásában, érésében és szöveti helyekre történő migrációjában . Az IL-5 mRNS expressziós szintje az asztmásokból származó bronchiális biopsziákban felszabályozott volt a nem asztmás kontrollokhoz képest . Az IL-5 mRNS expressziós szintje korrelált az asztma klinikai súlyosságával . A halmozódó allergén provokáció felszabályozta az IL-4 mRNS expresszióját a BALF sejtekben és a perifériás CD4+ és CD8+ T-sejtekben . Az IL-10 is jelezte, hogy részt vesz az asztmában . Az IL-13 transzkriptumok felregulációja az enyhe asztmás betegek BAL sejtjeiben az alacsony dózisú allergén provokáció után összhangban van az IL-13 mRNS magasabb expressziós szintjével a hörgőnyálkahártyában . Az SLPCD-kezelés hatását a citokinek mRNS-expressziós szintjére az asztmás egerek tüdőszöveteiben qRT-PCR segítségével tovább határoztuk meg. Az SLPCD-kezelés jelentősen lefelé szabályozta a Th2 citokinek (IL-4, IL-5, IL-10 és IL-13) mRNS-expressziós szintjét, és felfelé szabályozta a Th1 citokinek (IL-2 és IFN-γ) mRNS-expressziós szintjét az asztmás egerek tüdejében. Ezek az eredmények megerősítették az SLPCD kezelés szabályozó hatását a Th1 és Th2 citokin válaszokra az asztmás egerek tüdőszöveteiben.

Összefoglalva, az SLPCD jelentősen gátolhatja a légúti gyulladást, csökkentheti a gyulladásos sejteket a BALF-ben, csökkentheti a szérum teljes IgE szintjét, és módosíthatja a citokinek tartalmát a BALF-ben és a citokinek mRNS expresszióját az asztmás egerek tüdejében. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy az SLPCD képes csillapítani a légúti gyulladást és enyhíteni a patogenezist az asztma egérmodelljében egy kiegyensúlyozott Th1/Th2 válasz kiváltásán keresztül, és validálja klinikai alkalmazását, mint hatékony gyógyszert az asztma kezelésében.

Közzététel

Binnian Zhu jelenlegi címe ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd., Hangzhou 310030, Kína.

Érdekütközések

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek érdekellentétek.

A szerzők hozzájárulása

Binnian Zhu és Jun Dong egyenlő mértékben járultak hozzá a kutatómunkához.

A köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Shaoxing Science and Technology Project Grant-in-Aid (no. 2014B700722) támogatta.