A specifikus antitestek specifikus validálást igényelnek
A különböző antitestek specifikus teszteket igényelnek, a célpont biológiájától függően.Credit: MOLEKUUL/SCIENCE PHOTO LIBRARY/Getty Images
A monoklonális antitest az orvosbiológiai kutatás egyik leghasznosabb eszköze. Ezek a fehérjék képesek bármilyen kívánt célpontot megkeresni és ahhoz kötődni, és felhasználhatók sejtek képalkotására, sejtválogatásra, immunvizsgálatokra és számos más alkalmazásra.
De ezek a laboratóriumi munkagépek nem mindig futnak rendesen. A célpont jellegétől függően egy antitest bizonyos tesztekben inkonzisztens lehet – például nem a megfelelő célponthoz kötődve hamis pozitív eredményt adhat. Tekintettel a kutatási antitestek használatának elterjedtségére, ez potenciálisan milliárdos problémát jelent.
A fő cél az antitestek validálási stratégiáinak kidolgozása, hogy a kutatók biztosak lehessenek abban, hogy egy antitest megfelel az adott igényeiknek – és hogy az eredményeik reprodukálhatóak lesznek.
A Thermo Fisher Scientific kifejlesztett egy kétrészes antitest validálási platformot, amellyel nemcsak az InvitrogenTM antitestek specifitását (hogy a megfelelő célponthoz kötődnek-e), hanem a különböző alkalmazásokhoz való alkalmasságukat is teszteli. Azonban nem minden antitest esetében ugyanaz a teszt megfelelő: A Thermo Fisher minden egyes fehérjecélponthoz megfelelő tesztet használ, annak biológiai funkciójától függően. Bizonyos antitesteket a CRISPR-Cas9 segítségével a célfehérjét kódoló gén kiiktatásával lehet a legjobban tesztelni, és ellenőrizni, hogy az antitest már nem kötődik-e semmihez. Más antitesteket immunprecipitációval, majd tömegspektrometriával lehet tesztelni annak ellenőrzésére, hogy a megfelelő célpontokhoz kötődnek-e.
A Thermo Fisher a célantigén biológiai funkciója alapján fejleszti és finomítja az antitestek validálási tesztjeit. Íme két esettanulmány specifikus fehérjékről és azok specificitási tesztjeiről.
Knock-outok a rákhoz
Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) egy jól tanulmányozott fehérje: az EGFR útvonalának diszregulációja számos rákos megbetegedésben szerepet játszik. Annak tesztelésére, hogy az antitestek specifikusak-e az EGFR-re vagy annak valamelyik downstream célpontjára, a kutatók kiiktathatják az EGFR-útvonal kritikus fehérjéit, és megnézhetik, hogyan változik az antitest-kötő jel.
Az elmúlt években a CRISPR-Cas9 rendszer úgy vált ismertté, mint a legmegbízhatóbb és leghatékonyabb módja egy gén kiiktatásának. Ez teszi ideális eszközzé az antitestspecifikusság vizsgálatára egy jelkaszkádon belül. A Thermo Fisher kutatói egy standard humán karcinóma vonalat (A-431) vettek, és western blotot használtak a kötődési jel alapvonalának meghatározásához. Ezután CRISPR-Cas9 segítségével eltávolították a célgént, és EGFR knockout géneket hoztak létre. Az ezekből a knockout sejtekből kivont fehérje Western blotja azt mutatta, hogy a célfehérje számára már nem volt jel (1. ábra).
A további vizsgálatok megerősítették az eredményt. Az EGFR után következő jelátviteli kaszkád olyan fehérjéket foglal magában, mint a RAS, a RAF, a MEK és az ERK. Az EGFR epidermális növekedési faktor (EGF) általi aktiválása ezeknek a downstream fehérjéknek a foszforilációjához vezet, ami más, ezeket a foszforilált állapotokat felismerő antitestekkel kimutatható. EGF hozzáadása az EGFR-knockout sejtekhez azonban nem eredményezhet semmilyen downstream foszforilációt. Ugyanazon antitestek hozzáadása, amelyek felismerik a foszforilált célpontokat, nem eredményezett jeleket. Így a Thermo Fisher kutatói biztosak abban, hogy az anti-EGFR antitest célpont-specifikus.
Az A-431 sejtvonalból kiindulva a CRISPR-Cas9 segítségével kiiktatták az epidermális növekedési faktor receptort (EGFR). A western blot azt mutatja, hogy az EGFR elleni antitestek (kat. sz. MA5-13269, 1 μg/mL) kötődnek a kontroll sejtekhez, de az EGFR KO sejtekhez nem. A tubulin fehérjét terhelő kontrollként használtuk.
Módosulások sorozata
A sejtmagban a DNS szorosan csomagolva – hisztonfehérjék köré tekeredve alkotja a kromatint. A hisztonok tanulmányozása nehéz feladat, mivel számos kémiai változás, úgynevezett poszttranszlációs módosítás (PTM) érheti őket. Például a hiszton maradékai egy vagy több metil-, acetil- vagy foszforilcsoportot kaphatnak, amelyek mindegyike hatással van a sejtfunkcióra.
Egyes technikák, mint például a kromatin immunprecipitáció (ChIP), a western blotting, az immunfluoreszcencia és az immunhisztokémia, specifikus hiszton PTM-ek elleni antitesteket használnak a hiszton állapotának és kötődésének megértéséhez. Azonban számos hisztonmódosulásnak hasonló DNS-kötési mintázata van; egy olyan antitest, amelyet nem teszteltek szigorúan az összes hiszton PTM ellen, rossz típushoz kötődhet, és hamis pozitív eredményt adhat.
A Thermo Fisher a hiszton PTM-specifikus antitestjeit különböző PTM-eket tartalmazó peptidek egy sorával tesztelte. Ha egy antitest valóban specifikus egy PTM-re, akkor csak azokhoz a foltokhoz kötődik, amelyek az adott PTM-et hordozzák. A Thermo Fisher kutatói a jeleket egy specificitási faktor segítségével mérték: az adott PTM-et tartalmazó összes folt átlagos intenzitása osztva az azt nem tartalmazó összes folt átlagos intenzitásával (2. ábra). Az antitestek 4-190-szer nagyobb specificitási faktort mutattak a cél-PTM állapotukra, mint a nem célállapotokra, ami bizonyosságot ad arra, hogy nagymértékben szelektívek.
Az antitestre azért van szükség, hogy megkülönböztessük egy adott lizinmaradványon a metiláció típusát. Egy antitestjelöltet teszteltünk egy olyan peptidtömb ellen, amelynek foltjai mono-, di- vagy tri-metilált lizinmaradványokat hordoznak. A specificitási tényező azt mutatta, hogy az antitest (Cat. No. 710795) csak a metiláció egy típusát ismerte fel, vagyis nagyon szelektív.
A Thermo Fisher a genetikai knock out és a peptidtömbökön kívül hét más specificitási tesztet is végez. Ezek közé tartozik az RNAi alkalmazása a génexpresszió kiütésére, a differenciálisan felszaporított antitest a célzás független ellenőrzésére, valamint a természetesen előforduló változó expresszió a specificitás megerősítésére. Csak ilyen gondos és szigorú teszteléssel lehetnek biztosak a kutatók abban, hogy laboratóriumi munkagépeik megfelelnek a célnak – és hogy munkájuk a legszorosabb vizsgálatnak is megállja a helyét.
Az Invitrogen antitestekkel kapcsolatos alkalmazási jegyzeteket és a Thermo Fisher Scientific két részből álló tesztelési megközelítéséről többet itt talál.