ADAR

C enzim-szubsztrát felismerés

Keveset tudunk arról, hogy az ADAR-ok hogyan lépnek kölcsönhatásba specifikus szubsztrátjaikkal, és hogyan működnek együtt az RNS-kötő domének és a katalitikus domén a szerkesztési reakció során. A C-to-U RNS-szerkesztő gépezettel ellentétben, amely a szubsztrátfelismerés kritikus meghatározójaként a szerkesztési helyhez közeli elsődleges szekvencia-motívumot használja (Niswender, 1998), az ADAR enzimekből hiányzik minden nyilvánvaló belső szekvencia-specifikusság. Valójában, amikor teljesen kétszálú RNS-molekulákat kapunk, az ADAR1 és az ADAR2 is szinte promiszkuitás nélkül deaminálja a szekvenciában lévő összes adenozin 50-60%-át (Nishikura, 2010). Azonban az RNS-szubsztrát szerkezetén belül a hurkok, mismatchek és dudorok jelenléte növeli a helyszelektivitást, és ahogyan azt néhány fiziológiás ADAR-célpont esetében láttuk, úgy tűnik, hogy az ilyen szubsztrát bonyolult RNS-redője korlátozza a hozzáférést az RNS-en való kötődéshez és a produktív katalízis gyakran egyetlen adenozinra korlátozódik (Nishikura, 2010). Ezért az A-to-I szerkesztés célpont-specifikusságának nagy része a szubsztrát háromdimenziós hajtásában rejlik. Az ADAR fehérje RNS-kötő doméneknek minimális RNS-szubsztrátokkal alkotott komplexben történő, nemrégiben végzett NMR-alapú szerkezeti vizsgálatai azonban arra utalnak, hogy az egyes dsRNS-kötő domének szekvenciaspecifikus kapcsolatokban is részt vehetnek, amelyek hozzájárulhatnak bizonyos RNS-célpontok szelektivitásához másokkal szemben (Stefl et al, 2006, 2011).

Az ADAR-ok egy másik tulajdonsága, amely hatással lehet a szubsztrátfelismerésre és kölcsönhatásra, az a felismerés, hogy a produktív és nagy aktivitású deamináláshoz az ADAR-fehérjék dimert alkotnak a szubsztráton (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potenciálisan az ADAR fehérjék között homo- és heterodimerek is kialakulhatnak (Chilibeck és mtsai., 2006), és így a szubsztrát-specifikus felismerést, valamint az RNS-szerkesztési aktivitást befolyásoló szabályozás egy újabb rétegét jelentik. Mivel a mai napig nincs ismert szerkesztési célpontja az ADAR3-nak, és ez a fehérje nem mutat enzimatikus aktivitást a standard deamináz tesztekben (Melcher és mtsai., 1996a; Chen és mtsai., 2000), feltételezik, hogy szerepe szabályozó jellegű a többi ADAR-ral való heterodimerizáció révén.

Az ADAR dimerek általános szerkesztési aktivitáshoz kapcsolódóan megfigyelték, hogy bizonyos, ugyanazon szubsztráton belül zajló RNS-szerkesztési események pozitív vagy negatív csatolást mutatnak. Például az egymással közvetlenül szomszédos vagy az RNS-duplex szerkezet azonos oldalán elhelyezkedő adenozinok (kb. 11 nt távolság az A-formájú RNS-en belül) gyakran mutatnak csatolást az ADAR-ok általi szerkesztés során, valószínűleg az enzim katalitikus helyének térbeli közelsége miatt (Koeris és mtsai., 2005; Enstero és mtsai., 2009).

A fenti felismerések ellenére jelenleg még mindig nem lehetséges az RNS szerkesztési helyének előrejelzése az RNS elsődleges szekvenciája alapján. Ez főként az RNS tercier struktúrák összetett természetének és dinamikus viselkedésének köszönhető. Még ha figyelembe vesszük is, hogy a dsRNS-kötő domének képesek lehetnek bizonyos elsődleges szekvencia-motívumok megkülönböztetésére másokkal szemben, a környező elsődleges szekvenciában vagy a másodlagos és harmadlagos szerkezetben bekövetkező apró változások módosíthatják vagy akár felül is írhatják a szekvencia-specifikus kapcsolatokat. Ennek eredményeként az olyan keresési algoritmusok kidolgozására tett kísérletek, amelyek több olyan molekuláris jellemzőt (beleértve a bázispárosodás valószínűségét, a szekvencia környezetét, a szekvencia konzerváltságát) kombinálnak, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a szerkesztés valószínűségét vagy aktivitását, a potenciális szerkesztési helyek előrejelzése érdekében, az mRNS-ekben található jelölt pozíciók hosszú listáját eredményezték, de kevés új, helyszelektív és magas szintű módosítási helyet validáltak jóhiszemű in vivo célpontként (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie és Maas, 2009). A pre-mRNS-ek molekuláris jellemzőin alapuló több ezer valószínű szerkesztési hely kimutatása és a magas szintű átkódolási helyek csekély száma közötti kettősség arra utal, hogy vagy a predikciós algoritmusok szenvednek a magas hamis pozitív aránytól, és e jelölt pozíciók többségét nem az ADAR-ok szerkesztik, vagy az RNS-szerkesztés kísérleti kimutatásával van a probléma, és sok valódi szerkesztési hely esetében nem a megfelelő szöveteket vizsgálják (sejttípus-specifikus szerkesztés) vagy nem a megfelelő időpontban vizsgálják őket (szabályozott szerkesztés). Vagy pedig a legtöbb hely in vivo szerkesztési szintje olyan kicsi, hogy a jelenlegi detektálási módszerek nem elég érzékenyek a szerkesztés bizonyítására vagy cáfolatára.