Adenil-cikláz

• 2.1 Ciklikus adenozin-monofoszfát
• 2.2 Pirofoszfát

• 3.1 II. típus
  • 3.1.1 Szerkezet
  • 3.1.2 Túlkifejeződési zavarok

• 4.1 Szerkezet
  • 4.1. Szerkezet
    • 4.1.1 C-terminális katalitikus domén
      • 4.1.1.1 α1-kapcsoló
    • 4.1.2 N-terminális szabályozó domén
      • 4.1.2.1 αN10-kapcsoló
  • 4.2 pH általi szabályozás
  • 4.3 Biológiai szerep
• 5 Az adenil-cikláz 3D szerkezetei

Funkció

Adenil-cikláz (ADCY, EC szám 4.6.1.1), más néven adenilát-cikláz, egy enzim, amely katalizálja a . Ez egyetlen, összehangolt lépésben történik, ahol az ATP 3′ hidroxilcsoportjának oxigénje nukleofil módon megtámadja az alfa-foszfátot, foszfodiészterkötést képezve és egy pirofoszfátcsoportot hasítva. A legtöbb aktív helyen a 3’OH közelében van egy savas maradék, amely a deprotonálásában működik, és bázikus maradékok a β-foszfor mellett, hogy csökkentsék a csoport hasítási energiáját. Az adenil-cikláz által katalizált reakció reaktánsa az ATP; az ATP a legtöbb sejtben a legnagyobb mennyiségben előforduló nukleotid-trifoszfát, amelynek tipikus koncentrációja 1 és 10 mM között mozog. Ez a magas intracelluláris koncentráció lehetővé teszi, hogy a cAMP koncentrációja egy adott jelre adott válaszként gyorsan emelkedjen, ami számos jelátviteli és anyagcsere-útvonalban fontos. A reakció fő terméke a cAMP, mellékterméke a PPi. Az ADCY citoplazmatikus régiói az N-terminális, a C1a, C1b, C2a és C2b részekből állnak. A C1a és a C2a alkotja a katalitikus domént. Ez az oldal a mikrobiális Rv1264 adenil-ciklázra helyezi a hangsúlyt, de az emlősök adenil-ciklázait is kevésbé részletesen tárgyalja.

Adenilcikláz-asszociált fehérje (CAP) minden eukariótában szabályozza az aktin cityoszkeleton és a sejtadhézió működését.

A kalmodulin-érzékeny adenil-ciklázról lásd Anthrax ödémafaktor.

Bevezetés

Az adenil-ciklázoknak tíz izoenzimje van az emlősökben, az adenil-cikláz I-X típusú, (ADCY I-X), és sokkal több más szervezetekben. Az összes emlős és a legtöbb más adenil-cikláz a III. osztályba tartozik; a legtöbbjük integrális membránfehérje, és mindegyikük cAMP-ot termel, amelynek képessége bizonyos körülmények vagy ligandumok hatására aktiválható vagy inaktiválható. Az emlősök valamennyi membránhoz kötött adenil-ciklázát a G-fehérjék alfa alegységei aktiválják, de különbözőképpen reagálnak az olyan ligandumokra, mint a magnéziumionok, kalciumionok és a G-fehérjék béta-gamma alegységei. Az emlősök egyik izoenzimje és az adenil-cikláz egyes prokarióta formái a környezeti feltételekre, elsősorban a pH-ra reagálnak.

Ciklikus adenozin-monofoszfát

A cAMP az emlősökben másodlagos hírvivőként működik, egyik funkciója a protein-kináz A (PKA) aktivitásának szabályozása. A PKA-nak viszont igen változatos szerepei vannak a sejtekben, míg a legtöbbjük az anyagcseréhez kapcsolódik, a PKA fontos szerepet játszik a transzkripcióban, a sejtciklusban és az apoptózisban is. A cAMP végső sorsa a foszfodiészterkötés 3′,5′-ciklikus adenozin-monofoszfát-foszfodiészteráz által történő hasítása révén AMP-vé történő átalakulása.

Pirofoszfát

A reakció melléktermékének, a PPi-nek a pirofoszfatáz általi hasítása két molekula szervetlen foszfátot (Pi) eredményez. Az ATP-szintáz ezt a szervetlen foszfátot vissza tudja építeni adenin-difoszfátba (ADP), hogy a protonmozgató erő energiáját felhasználva ATP-t állítson elő.

Emlős adenil-cikláz

Az emlősökben tíz izoenzim adenil-cikláz létezik, az adenil-cikláz I-X típusú, (ADCY I-X); Az emlősökben az adenil-cikláz fontos szerepet játszik a jelátviteli utakban, amelyekben a cAMP másodlagos hírvivő.

Az ADCY I-IX-ek általános szerkezete megegyezik; két transzmembrán régióból (M1, M2) állnak, amelyek hat membránon átívelő hélixből állnak, és az enzim membránban való rögzítését szolgálják, valamint két citoplazmatikus régióból (C1, C2), amelyek tovább oszthatók (C1a, C1b, C2a, C2b), és amelyek az összes katalitikus aktivitásért, valamint a G-fehérjék és a forskolin általi szabályozásért felelősek. Oldatban a C1a és C2a domének heterodimereket képezhetnek egymással, akár azonos, akár különböző enzimekben, vagy homodimereket képezhetnek azonos egységeikkel különböző enzimeken. A C1b domén nagyon nagy (≈15 kDa), sok szabályozóhellyel, és izoenzimenként változó szerkezetű; míg a C2b domén számos izoenzimben szinte egyáltalán nem létezik, és még nem társították konkrét funkcióval.

II. típus

Szerkezet

A C2 domén monomerjének belső, hidrofób, antiparallel több, amfipatikus körülvett , kivéve egy területet, amely egy másik C2 doménnel való homodimer kialakításához szükséges. A II. típusú adenil-cikláz C2-doménjének két monomerje oldatban összekapcsolódik, hogy egy , amely szükséges az ATP katalitikus átalakításához cAMP-á és PPi-vé. Kötődve egy mély hasadékot hoznak létre, amely a kötőhelyük közepén húzódik; ez a hasadék alkalmas arra, hogy két molekulát kössön meg a végein. A forskolin oxigénatomjai és a környező peptidgerinc között erős hidrogénkötések jönnek létre, a többi kölcsönhatás pedig erősen hidrofób, mivel a forskolin kötőhelye tíz alifás és aromás maradékot tartalmaz. A forszkolinnak ez a kötődése hidrofób kötést hoz létre a monomerek között, amelyek mindegyike két különböző hidrofób felülettel kötődik a forszkolinhoz; és ez a kölcsönhatás teszi a homodimert stabillá. A forskolin kölcsönhatásba lép az Asn 1025-tel is, és megfelelően pozícionálja azt, ami elengedhetetlen a katalitikus aktivitáshoz, sőt, akár közvetlenül is kölcsönhatásba léphet az ATP-vel. Ez a homodimer-forskolin komplex tovább aktiválódhat egy jelre válaszul a G-fehérje βγ-alegységéhez való kötődéssel . Ez a βγ-alegység kötődik, amely a komplex legkülső rétegén lévő α-hélix egy részét alkotja.

Ez a homodimer a crevasse-on belül helyezkedik el, és két erősen konzervált poláris maradékhalmaz jellemzi (Arg 997 (zöld), Asn 1025 (piros), Ser1028(rózsaszín), Arg 1029(narancssárga), Asp 1031(sárga) és Ser 1032(lila)). Ezekből a készletekből egy-egy található minden monomer alegységen, a homodimeren antiparallel módon helyezkednek el, ahol egymás felé mutatnak.

Túlterjedési zavarok

Az emlősök agyában a memórián alapuló funkciók végrehajtását a prefrontális kéreg (PFC) végzi. A neuronokon lévő, hiperpolarizációval aktivált ciklikus nukleotidkapuzott (HCN) csatornák záródnak, hogy az elektrokémiai jelek lefelé áramolhassanak az axonon és a szinapszisba; ha a HCN-csatornák nyitva vannak, az elektropotenciális jel nem tud átjutni a sejten. Ha ezeket a csatornákat cAMP-nak tesszük ki, akkor megnyílnak, leállítva a jelek továbbítását, és így károsítják a magasabb szintű kognitív gondolatokat. A skizofréniában szenvedő betegeknél egy cAMP szabályozó molekula, a Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) mutálódott, és nem képes szabályozni a cAMP-szintet; így az emelkedett cAMP-szint skizofréniát okozhat. A HCN-csatornák záródása feltehetően más rendellenességekben, például az ADHD-ban és a bipoláris zavarban is szerepet játszik. Így ésszerű, hogy a cAMP-termelés szabályozása a II. típusú adenil-cikláz célzottan történő szabályozásával, mivel az agyban található, az említett rendellenességek kezelésében működhet.

Rv1264 Adenil-cikláz

Bár az adenil-cikláz univerzális szinten minden szervezetben megtalálható, a távolabbi rokon szervezetekben az enzimnek különböző módosulásai vannak, mindegyik egy adott feladatra, egy adott környezetben specializálódott. Mint korábban említettük, az embernek az adenil-cikláz 10 ismert izoenzimje van; míg az Escherichia coli-nak csak egy izoenzimje, a Mycobacterium tuberculosisnak pedig 15 izoenzimje. Az M. tuberculosis egyik különösen érdekes adenil-ciklázának, az Rv1264-nek van egy N-terminálisa, amely bizonyos értelemben pH-szenzorként működik, mivel az enzim aktivitását a környező oldat pH-ja alapján szabályozza. Ez az adenil-cikláz, mint a legtöbb másik, a III. osztályba tartozik, az ebbe az osztályba tartozó adenil-ciklázok több doménnel rendelkeznek, legalább egy a katalízishez, és egy másik a szabályozáshoz.

Szerkezet

Az adenil-cikláz egy 363 maradék hosszú fehérje, amely egy katalitikus és egy szabályozó részből áll, amely egy flexibilis, a kettőt összekötő részt tartalmaz. Az aktív szerkezet az emlős II-es típusú homodimerre hasonlító homodimer, ahol az egyik monomer (Chain A) α-hélixe a másik (Chain B) központi tekercsén keresztül helyezkedik el. Ez a dimerizáció az A lánc szabályozó doménjét a B lánc katalitikus doménjének közvetlen közelébe helyezi, és fordítva. A fehérjében két kapcsolóelem van jelen, egy a C-terminális doménben (α1-kapcsoló) és egy másik a linker régióban (αN10-kapcsoló), ezek lehetővé teszik, hogy viszonylag kis környezeti változásokra nagy konformációs változások történjenek az enzimben.

C-terminális katalitikus domén

A katalitikus aktivitást az Rv1264-ben a maradékok végzik: Asp 222 (piros), Lys 261 (kék), Asp 265 (narancs), Arg 298 (rózsaszín), Asp 312 (sárga), Asn 319 (lila), Arg 323 (zöld). Mindezek a maradékok erősen poláros környezetet hoznak létre, amely töltés és polaritás szempontjából komplementer a reakció intermedierjéhez képest. Az ATP foszfátjait irányító maradékok, a 298-as és a 323-as arginin, az aktív centrumban kötődnek. Ez a szulfátion abban a pozícióban helyezkedik el, amelyet a katalízis során az ATP β-foszfátja foglal el. A katalízis során a β-foszfát leválik az α-foszfátról; ez a reakció kedvezőbbé tehető az energia csökkentésével a β-foszfát és a 298-as és 323-as arginin közötti komplementer töltéskapcsolatok révén. Egy másik maradék, a , elektrosztatikus kölcsönhatások révén köt meg egy molekulát. Ennek a társulásnak a specifikus funkciója nem ismert, de az aktív centrumhoz való közelsége miatt szerepet játszhat a katalízisben.

Az aminosav-szekvenálás kimutatta, hogy az Rv1264 adenil-ciklázok katalitikus doménje és az emlősök adenil-ciklázainak katalitikus doménje közötti szekvencia nem jól konzervált, és csak körülbelül 25%-os a megfelelés a fent tárgyalt emlősök II. típusú adenil-ciklázával. A két különböző izoenzim azonban még mindig hasonlít egymásra abban, hogy az egyik és a másik egymásra helyezése jelentős átfedést mutat, az összes izoenzim 79%-a között kevesebb mint 1,76Å átlagos négyzetes eltérés (rmsd) van. Az Rv1264 és a II. típusú adenil-cikláz katalitikus domének közötti figyelemre méltó különbség a relatív méretük; az Rv1264-nek nincs dimerizációs karja, és több hurokja megrövidült. Ez azt eredményezi, hogy az Rv1264 adenil-cikláz katalitikus doménje dimerként asszociálódik, kisebb határfelületi területtel, mint az emlősök II-es típusa, 1900Å2 és 3800Å2 határfelületi területtel. Az Rv1264 és az emlős II-es típusú adenil-ciklázok aktív centrumai még konzerváltabbak; az aktív centrumban az rmsd mindössze 0,69Å, az aktív centrumban pedig 1,17Å.

A C-terminális katalitikus doménre vonatkozó fenti szerkezeti információk csak akkor igazak, ha az enzim aktív állapotban van. Az enzim inaktív állapotában az aktív centrum szétesett, ezért nincs katalitikus aktivitása. A rögzített N-terminális doménekhez képest a C-terminális monomer domének mindegyike 6Å-ig transzponálódhat és 55o -kal foroghat. A C-terminális domének tercier szerkezetének ez a masszív változása szétszedi az aktív központot, és a katalitikus maradékokat akár 25Å-ra is elmozdítja a katalitikusan aktív helyükről. A C-terminális doménben nemcsak az aktív centrum szakad meg, hanem a két monomer közötti határfelület mérete 1900Å2 -ről 930Å2 -re csökken.

α1-kapcsoló

A C-terminális katalitikus doménben található, és kompakt α-hélixként létezik, amikor az enzim aktív állapotban van. Inaktiváláskor az α1-kapcsoló α-hélixes konformációja instabillá válik, és véletlenszerű tekerccsé alakul át. Mivel ez a kapcsoló az aktív centrum közvetlen közelében van, a szerkezet jelentős megváltozása nagymértékben megzavarja az aktív centrumot, és az enzimet inaktívvá teszi.

Ez a szerkezet konzerválódott az emlős adenil-ciklázokban, ahol az ATP-szubsztrát βγ-foszfátjainak kötőhelyéhez járul hozzá. Az emlős adenil-ciklázok szabályozásában is szerepet játszik, egy másik α-hélixszel együtt a Gsα és Giα G-fehérje alegységek kötőhelyét képezi, amely szabályozza az adenil-ciklázok aktivitását.

N-terminális szabályozó domén

Az N-terminális domén a szabályozásban működik; egyedülálló mechanizmusa van, amely a környező oldat pH-ja alapján határozza meg, hogy az enzim aktív lesz-e vagy sem. A katalitikusan aktív dimerben minden monomer tíz , dimerizálódva egy korongszerű szerkezetet alkotnak. Egyetlen molekula egy hidrofób zsebben kötődik. Ennek a polietilénglikolnak a funkciója strukturálisnak tűnik; azonban specifikus elhelyezése és az enzim aktív és inaktív formái közötti mozgása arra utal, hogy a környezet hidrofobicitási változásainak érzékelésében is szerepet játszhat.

αN10-kapcsoló

A linker régióban található, és konformációváltozása drasztikusabb hatással van az enzim egészére, mint az α1-kapcsolóé. Amikor az enzim aktív, az αN10-kapcsoló egy véletlenszerű tekercsből áll egy rövid α-hélixszel; ez a konformáció csak gyenge kölcsönhatást tesz lehetővé az N-terminális szabályozó domén és a C-terminális katalitikus domén között, így az enzim katalitikus aktivitást mutat. Ez a spirál akár 24Å-re is kiterjedhet, ami elválasztja a dimer monomer C-terminális katalitikus doménjeit. A doméneknek ez a szétválasztása csökkenti a határfelületüket, és maradékokat helyez át; amint azt fentebb tárgyaltuk, ezek a változások az enzim inaktiválódását eredményezik, és így az enzim inaktív állapotának egyik fő jellemzője a meghosszabbított αN10-kapcsoló. Ahogy az αN10-kapcsoló megnyúlik, az kifelé mozog, és a pentaetilén-glikol az αN10-hélix által újonnan kialakított üregbe kerül. Ez tovább erősíti azt az elképzelést, hogy a pentaetilénglikol ligandum nemcsak a szerkezet, hanem a szabályozás szempontjából is funkcionál.

Szabályozás a pH által

A linker régió elején található egy maradék, , amely jelentős hatással van a pH általi szabályozásra. Bázikus pH-n a maradéknak nincs töltése és minimális kölcsönhatása van a két katalitikusan fontos maradékkal , amelyek 14 Å és 21 Å távolságra vannak a katalitikusan aktív pozícióktól. Az enzim ebben az állapotban inaktív, nemcsak a Lys 261 és Asp 312 maradékok miatt, hanem azért is, mert a katalitikus hely más fontos szerkezeti elemei is szétesnek. Savas pH-n az Rv1264 aktívvá válik (optimális pH~5,8)és aktivitása akár 40-szeresére nő. Ennél a savas pH-nál a His 192 protonálódik és pozitív töltésűvé válik, ami jelentős szerkezeti változásokat hoz létre a fehérjében, beleértve mind az αN10-kapcsoló, mind az α1-kapcsoló tömörülését, az α4-hélix összehúzódását, ami viszont a paraetilén-glikol ligandum transzlokációját okozza. A pozitív töltésű His 192 elektrosztatikusan taszítja a Lys 261 és Asp 312 maradékokat, ami más szerkezeti változásokkal együtt 14 Å, illetve 21 Å-nyire helyezi át őket a katalitikusan aktív pozíciójukba.

, egy olyan maradék, amely hidrogénkötések révén számos, a C-terminális – N-terminális kölcsönhatásban fontos maradékot szervez a szabályozásban. Ha ez a maradék mutálódik, a pH-alapú szabályozás megszűnik, és az enzim állandóan aktív.

Sok más maradék is hozzájárul a pH-alapú szabályozáshoz; a C-terminális – N-terminális domén határfelületén lévő elektrosztatikus kölcsönhatások és hidrogénkötések azok, amelyek lehetővé teszik, hogy az Rv1264 adenil-cikláz érzékeny legyen a pH-ra.

Biológiai szerep

A M. tuberculosis patogén baktérium, ezért a gazdaszervezet immunválaszainak egész sorával szembesül, amelyekkel megpróbálnak megszabadulni tőle. A M. tuberculosis egyik gazdaszervezeti védekezési mechanizmusa a fagoliszoszómákban tapasztalt savasodás. Az a képesség, hogy képes legyen felismerni ezt a savas környezetet, és megfelelő választ adjon rá, nagyban segítheti az M. tuberculosis fertőzését a gazdaszervezetben. A cAMP-szint emelkedésével más struktúrák savasodása késik, és a megemelkedett cAMP-szint aktiválja a cAMP-receptor fehérjéket, amelyek viszont szabályozzák a transzkripciót.

Adenil-cikláz 3D struktúrái

3D Adenil-cikláz 3D struktúrák