Alfa-2 adrenerg receptor agonisták blokkolják a kokainkeresés stressz által kiváltott újbóli beindulását

Kísérlet 1: A klonidin, a lofexidin és a guanabenz hatása a lábdobogás által kiváltott NE-felszabadulásra

Alanyok

A kísérleti alanyok hím Long-Evans patkányok (Charles River, Quebec) voltak, akik a kísérlet kezdetén 300-350 g súlyúak voltak. A kísérlet során az állatokat egy páratartalom- és hőmérséklet-szabályozott kolóniaszobában tartották fordított fény-sötét időbeosztásban (világítás 1730-0530 óra között), és szabad hozzáférést kaptak a standard laboratóriumi patkánytakarmányhoz és vízhez. A kísérleti eljárások a CCAC irányelveit követték, és a Concordia Egyetem Állatgondozási Bizottsága jóváhagyta őket.

Műtét

A műtét előtt a patkányokat nátrium-pentobarbitállal (65 mg/kg, i.p.) altatták, majd atropin-szulfátot (0,6 mg/ml; 0,2 ml/patkány, SC) és antibiotikumot (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/patkány, i.m.) adtak be nekik. A dialízisszondák későbbi behelyezéséhez vezető kanülöket (20 gauge; Plastics One) ültettek be; egyet a PFC-be, egyet pedig az AMG-be helyeztek el az ellentétes féltekékben. A guanabenz hatásának vizsgálatára használt állatok egyetlen, a PFC-re irányuló vezető kanült kaptak. Az a félteke, amelybe a megfelelő vezető kanülöket beültették, a kezelések között kiegyenlített volt. Az alkalmazott sztereotaxiás koordináták (a bregmához és a koponya felszínéhez viszonyítva) a következők voltak: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos és Watson 1997). Behelyezéskor a dialízisszonda tengelye 1 mm-re nyúlt ki a vezető kanülökből. A beültetett vezető kanülöket rozsdamentes acélcsavarokkal és fogászati cementtel rögzítették a koponyához. A vezető kanülöket csavaros obdurátorokkal zárták le. Minden állatot visszavittek a kolóniaszobába a vizsgálatot megelőzően legalább egy hétig tartó gyógyulási időre.

Mikrodialízis

A mikrodialízist négy hatszögletű, plexiüvegből épített, fából készült mennyezettel és rozsdamentes acélrúddal ellátott vizsgálati kamrában (42 × 39 × 33,5 cm) végezték. Minden egyes kamra körül sötét függönyöket húztak, és a világítást fordított ciklusban, felülről világító izzókkal (15 W) biztosították. A dialízisszonda egy 1,8 mm (AMG) vagy 3,5 mm (PFC) hosszúságú féligáteresztő dialízismembránból (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutoff) állt, amely az egyik végén zárva volt, a másik végén pedig egy 19 mm hosszú, 26 mm-es rozsdamentes acélcsőhöz csatlakozott. A rozsdamentes acél tengely másik végét egy 40-50 cm hosszú PE-20 cső kötötte össze a vizsgáló kamra felett elhelyezett infúziós forgócsővel, amely viszont PE-20 csövön keresztül egy változó sebességű infúziós szivattyúhoz volt csatlakoztatva. Egy kis átmérőjű, olvasztott szilícium-dioxid cső húzódott a szonda belsejében, amelynek egyik vége 0,5 mm-re volt a szonda csúcsától, a másik vége pedig 35 cm-rel az infúziós forgócső alatt lépett ki a PE-csőből. A PE-20 cső külső hosszát acél rugóhüvelyek védték a sérülésektől. A szondákat úgy tervezték, hogy a félig áteresztő membrán teljes hossza a vezető kanül hegye alá nyúlt.

A vizsgált gyógyszerek hatásának vizsgálatára különálló állatcsoportokat használtak. Az egyes rajokon belül minden állatot véletlenszerűen rendeltek a kezelési feltételhez. Azokat az állatokat, amelyek vivőanyag-injekciót kaptak, minden egyes rajban futtatták, de a statisztikai elemzéshez egyetlen csoportba sorolták őket. A végleges csoportméretek (PFC/ AMG) a következők voltak: jármű (n = 15/17), klonidin 20 μg/kg (n = 7/6), klonidin 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidin 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidin 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). A guanabenzt kapott állatok kivételével minden alanyon kétszer végeztek dialízist, egyszer a PFC-ben és egyszer az AMG-ben, a vizsgálatok közötti 3-4 hetes intervallummal.

A szondákat a mikrodialízis vizsgálat megkezdése előtti napon helyezték be. Az elzáródás megelőzésére mesterséges liquort (145 mM Na+, 2,7 mM K+, 1,22 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0,2 mM aszkorbát, 2 mM Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) perfundáltunk egy éjszakán át 0,06 μl/perc sebességgel. A dializátum mintavételezése és az aktivitás monitorozása másnap reggel kezdődött. A dializátum áramlási sebességét 0,6 μl/percre növeltük, és 20 percenként alapszintű dializátmintákat (∼12 μl/minta) gyűjtöttünk. A mintákat addig gyűjtöttük, amíg stabil alapszintet nem értünk el, amelyet úgy definiáltunk, hogy legalább három egymást követő mintában a dializátum NE-szintje ±10%-kal változott. A stabil NE alapszintek megállapítását követően minden állat i.p. injekciót (1 ml/kg) kapott a megfelelő gyógyszerből vagy hordozóból, amelyet 40 perccel a 10 perces lábsokk előtt adtak be. Az ütéseket változó időbeosztásban, átlagosan 40 másodpercenként (10-70 másodperces tartományban) adtuk; minden egyes ütés (0,6 mA) 0,5 másodpercig tartott. A mintákat további 120 percig gyűjtötték (6 minta). A mintákat azonnal elemezték két hasonló, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás rendszer egyikével, elektrokémiai detektálással (HPLC-EC). A mintákat (10 μl) fordított fázisú oszlopokra töltöttük (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) kézi injekciós nyílásokon keresztül (Reodyne 7125; 20 μl-es hurok); a NE, a dihidroxifenil-ecetsav (DOPAC), az 5-hidroxi-indolecetsav (5-HIAA) és a homovanilinsav (HVA) redukciós és oxidációs áramát kétcsatornás ESA coulometrikus detektorokkal (Coulochem 5100, 5021-es modellű kondicionáló cellával és 5011-es modellű analitikai cellával, Sci. Products & Equipment) mértük. Az NE áramát a DOPAC és a HVA áramától függetlenül mértük a Coulochem detektorok külön csatornáin. A mobil fázisokat (nátrium-acetát 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitril, pH 3,7-re beállítva jégecettel) Waters 510 HPLC szivattyúkkal 1,4 ml/perc áramlási sebességgel keringtették át mindegyik zárt rendszeren. Az NE, DOPAC és HVA esetében kapott csúcsokat az EZChrom kromatográfiás adatrendszerrel (Sci. Products & Equipment) integráltuk és számszerűsítettük. Az egyes patkányoktól származó dializátmintákat mindig ugyanazzal a HPLC-EC rendszerrel elemeztük, és az állatok egyes rendszerekhez való hozzárendelése minden kezelési csoportban kiegyenlített volt. A mintavétel előtt a kamrákból eltávolították a táplálékot, de egy vízivócső rendelkezésre állt. A vizsgálat befejezésekor a szonda helyes elhelyezésének megerősítését a szonda elhelyezésének helyein átvágott 30 μm-es metszetek vizsgálatával határozták meg, amelyeket Cresyl violettel festettek meg.

2. kísérlet: A klonidin hatása a footshock- és kokain-indukált visszaállításra

Alanyok

A kísérleti személyek 25 hím Long-Evans patkány (Charles River, Quebec) voltak, akik a kísérlet kezdetén 350-425 g súlyúak voltak. Az állatokat az 1. kísérletben leírtak szerint tartottuk.

Műtét

Az állatokat az 1. kísérletben leírtak szerint készítettük elő a műtétre. Intravénás katétert (Dow Corning) ültettek be a jobb nyaki vénába. A vénába egy 3 cm hosszú szilasztikus csövet (belső átmérője 0,30 mm, külső átmérője 0,64 mm) helyeztek be, amelyet hőre zsugorodó csővel egy 9 cm hosszú szilasztikus csőhöz (belső átmérője 0,51 mm, külső átmérője 0,94 mm) kötöttek, amelyet bőr alá vezettek a koponya tetejére. A katétert selyemvarratokkal rögzítették a vénához, és egy csatlakozóba (módosított 22-es kanül; Plastics One, Roanoke, VA) lépett ki, amelyet ékszerészcsavarokkal és fogászati cementtel rögzítettek a koponyához; a kanül nyílására műanyag sapkát helyeztek. Az állatoknak 1-2 hetet hagytak, hogy felépüljenek a műtétből.

Készülék

A kísérletekben használt önadagoló kamrák visszahúzható karral (Med Associates, St Albans, VT) és egy nem visszahúzható “dummy” karral voltak felszerelve. Mindkét kar 9 cm-rel a padló felett helyezkedett el. Egy infúziós szivattyút (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) a visszahúzható vagy “aktív” karra adott válaszok aktiválták. A műkarra adott válaszok rögzítésre kerültek, de nem vezettek a pumpa aktiválásához. A gyógyszeroldatot 10 másodpercen keresztül 65 μl térfogatban adagolták. Az infúziós időszak alatt az aktív kar fölött egy fehér ingerlő fény világított, és ez idő alatt további válaszokat rögzítettünk, de ezek nem eredményezték a pumpa újraaktiválását. Mindegyik önadagoló kamrát úgy szerelték fel, hogy állandó áramú, szakaszos, kikerülhetetlen, elektromos lábsokkot adjon egy zavaró berendezésen keresztül a rácspadlóra (Grason-Stadler Generator #E1064GS vagy Med Associates). A lábsokkot 15 percig adták változó időbeosztás szerint, átlagosan 40 másodpercenként (10-70 másodperces tartományban). Minden egyes sokk (0,6 mA) 0,5 másodpercig tartott. A lábsokkoknak ezt az intenzitását a mi készülékünk használatával a megbízható visszaállítás kiváltásához szükséges minimálisnak találtuk.

Gyógyszerek

A kokain HCl-t a BDH Chemicals-tól (Toronto, Kanada) szereztük be, és fiziológiás sóoldatban oldottuk. A klonidin HCl-t a Sigmától (St Louis, MO) vásároltuk, fiziológiás sóoldatban oldottuk és i.p. injekcióban adtuk be (0, 20 és 40 μg/kg).

Eljárás

1. fázis: Tréning. A patkányokat a kokain HCl (0,5 mg / kg / injekció, i.v.) önadagolására képezték ki a megerősítés fix arányú-1 ütemezésével egy napi 3 órás önadagolási ülés során. Minden nap az állatok felét reggel, körülbelül három órával a villanyoltás után vitték az operáns kamrákba az önadagolási üléshez, és az állatok felét délután, körülbelül hét órával a villanyoltás után vitték a kamrákba. A reggeli és a délutáni foglalkozásokra kijelölt állatok csoportja naponta váltakozott, így a képzés végére minden állat ugyanannyi önadagolási foglalkozást kapott mindkét időpontban. Fontos volt, hogy minden állat hasonló tapasztalatokkal rendelkezzen a nap korai és késői szakaszában történő önadagolással kapcsolatban, mivel a 2. fázis során minden állat délelőtt kapott kioltási üléseket, amelyeket egy tesztelési ülés követett, amelyre jellemzően délután került sor. Minden ülés elején egy piros házi fényt világítottunk meg 10 másodpercre, mielőtt a visszahúzható kart bevittük volna a ketrecbe. Az aktív kar fölött lévő fény a kar bemutatását követő első 30 másodpercig világított. A ház fénye a munkamenet során végig égve maradt. Amint korábban jeleztük, az aktív karra adott válaszok az infúziós pumpa aktiválódását és a kar feletti lámpa megvilágítását eredményezték a 10 másodperces gyógyszeradagolás idejére. A gyógyszeradagolás ideje alatt a kar további megnyomásait rögzítették, de ezek nem vezettek a pumpa újraaktiválásához. A képzési feltételek 10-12 napig voltak érvényben. A kiképzés végén az állatokat 7-13 napig háborítatlanul hagyták a kolóniateremben. Ezt követően került sor a kihalásra és a tesztelésre. Ebben a kísérletben és a 3B kísérletben az állatcsoportokat a vizsgált gyógyszerek különböző dózisaihoz rendelték. Ezután minden csoportban minden állatot három tesztkörülménynek vetettek alá; sóoldat, kokain és lábsokk.

2. fázis: Kihalás és tesztelés. Az extinkció és a tesztelés során, amely négy egymást követő napon keresztül zajlott, az állatok napi 24 órában az önadagoló kamrákban voltak elhelyezve. Az állatok számára az élelem és a víz szabadon rendelkezésre állt, kivéve a napi kihalási és tesztelési ülések alatt. Az állatokat a kihalás és a tesztelés első napját megelőző este vitték a kamrákba. Mivel a képzési szakaszban minden nap két külön patkánycsoportot futtattak, az állatok egyik csoportját a 2. fázis első négy napján, a másik csoportját pedig a következő négy napon tesztelték. Az extinkció és a tesztelés során minden olyan körülményt fenntartottak, amely a kiképzés során is fennállt, kivéve, hogy a kar lenyomása nem eredményezett kokaininfúziót.

Ezekben és az összes későbbi visszaállítási kísérletben az állatok naponta több 1 órás extinkciós ülést kaptak, amelyeket olyan közbeeső időszakok választottak el, amelyekben a kart visszavonták. Az 1. napon az állatok négy kihalási ülést kaptak; a 2-4. napon az állatok két-három kihalási ülést kaptak, ami elegendő volt ahhoz, hogy egy óra alatt 15 vagy annál kevesebb reakciót tartalmazó alapszintet hozzanak létre, amelyet egy 180 perces vizsgálati ülés követett. A közbeeső időszakok időtartama minden kísérletben állandó volt, és megfelelt a gyógyszer felszívódásához szükséges késleltetésnek az előkezelés előtti injekciók és a teszt kezdete között. A jelen kísérletben a közbeeső időszakok időtartama 40 perc volt.

A vizsgálat során az állatok külön csoportjait 0, 20 vagy 40 μg/kg, i.p. klonidinnel előkezelték a három, egymást követő napokon és kiegyenlített sorrendben beadott visszaállítási teszt (sóoldat, kokain és lábsokk) mindegyikét megelőzően. A klonidint 40 perccel a kar behelyezése előtt adták be. A sóoldatos és kokainos alapozó tesztekhez az állatok a kar behelyezése előtt 5 perccel nem függő, i.p. sóoldat vagy kokain (20 mg/kg) injekciót kaptak. A lábsokk-tesztekhez az állatokat közvetlenül a kar behelyezése előtt 15 perces rövid intermittáló lábsokk stressznek tették ki. A tesztek időtartama 3 óra volt. A kokain dózisát és a footshock paramétereit a laboratórium korábbi munkái alapján választották ki (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). A klonidin dózisát a heroinra kiképzett patkányokkal végzett visszaállítási kísérleteink alapján választottuk (Shaham et al. 2000).

3A. kísérlet: A lofexidin hatása a szacharózra való magas válaszadási arányokra

Mivel a lofexidin farmakológiai profilját nem jellemezték olyan jól, mint a klonidinét, egy kísérletet végeztünk annak megállapítására, hogy a lofexidin okoz-e és milyen dózisokban teljesítményhiányt. A visszaállításra irányuló tesztekben a dózisokat az ebben a kísérletben kapott eredmények alapján választottuk ki.

Alanyok

A kísérleti alanyok 8 hím Long-Evans patkány (Charles River, Quebec) voltak, akik a kísérlet kezdetén 400-550 g súlyúak voltak. A patkányokat korábban egy olyan kísérletben használták, amelynek célja a szacharóz-keresés láblökés által kiváltott visszaállításának tanulmányozása volt (Buczek et al. 1999). Az állatokat az 1. kísérletben leírtakhoz hasonló körülmények között tartották.

Készülék

Minden önadagoló kamra két helyhez kötött karral volt felszerelve, szimmetrikusan középen az egyik oldallapon, 5 cm-rel a padló felett. Az egyik karra, az “aktív” karra adott válaszok egy szivattyút (Razel Sci. Stamford, CT) aktiváltak. A másik karra, a “dummy” karra adott válaszok rögzítésre kerültek, de következmények nélkül maradtak. A pumpa aktiválása 0,18 ml szacharózoldat 20 másodperces adagolását eredményezte a két kar között elhelyezett folyadékcsepp-tartályba. A szacharóz adagolási időszak alatt az aktív kar felett egy fehér ingerlő fény világított, és ez idő alatt további reakciókat rögzítettünk, de ezek nem eredményezték a pumpa újraaktiválását.

Gyógyszerek

A lofexidin HCl-t nagylelkűen Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., UK biztosította. A gyógyszert fiziológiás sóoldatban oldottuk és i.p. injekcióban adtuk be (0, 80, 120, 160 vagy 200 μg/kg).

Eljárás

A korábban egy másik vizsgálatban (Buczek et al. 1999) a szacharóz önadagolását megtanult állatok ezt követően öt egymást követő napon öt alkalommal kaptak önadagolást 30%-os szacharóz oldattal FR-1 ütemezésben. Az ezt követő napi munkamenetekben az állatoknak 60 perccel az önadagolási munkamenet kezdete előtt 60 perccel vivőanyagot (0 μg/kg) vagy lofexidint (80, 120, 160 vagy 200 μg/kg, i.p.) adtak be. Minden állat a lofexidin összes dózisát kiegyensúlyozott sorrendben kapta; a lofexidin legmagasabb dózisát kétszer tesztelték. Minden olyan munkamenetet, amelyben az állatokat lofexidinnel kezelték, sóoldatos előkezelés követett, hogy minimalizáljuk a gyógyszer átviteli hatásainak lehetőségét.

3B. kísérlet: A lofexidin hatása a láblökés és a kokain által kiváltott visszaállításra

Alanyok

A kísérleti alanyok 49 hím Long-Evans patkány (34 Charles River, Quebec; 15 Harlan Sprague Dawley, USA) voltak, akik a kísérlet kezdetén 350-400 g súlyúak voltak. Az állatokat az 1. kísérletben leírtak szerint tartották. A két szállítótól származó állatok között nem volt nyilvánvaló különbség a válaszadásban a kísérlet egyik fázisában sem.

Eljárás

1. fázis: Tréning. Az állatokat a 2. kísérletben leírt körülmények között képeztük ki a kokain önadagolására.

2. fázis: Kihalás és tesztelés. Ebben a kísérletben a közbeeső időszakok a fent leírtak szerint 60 percesek voltak. A teszteléskor az állatok külön csoportjait 0, 50, 100, 100, 150 vagy 200 μg/kg, i.p. lofexidinnel előkezelték a három, egymást követő napokon és kiegyenlített sorrendben (lásd a 2. kísérletet) adott, a visszaállításra irányuló tesztek (sóoldat, kokain és footshock stressz) mindegyikét megelőzően. A lofexidint 60 perccel a kar behelyezése előtt adták be. A tesztek időtartama 3 óra volt. A lofexidin dózisokat a 3A kísérletben kapott eredmények alapján választottuk meg.

4. kísérlet: A guanabenz hatása a láblökés- és kokain-indukált visszaállításra

Alanyok

A kísérleti személyek 18 hím Long-Evans patkány (Charles River, Quebec) voltak, akik a kísérlet kezdetén 350-400 g súlyúak voltak. Az állatokat az 1. kísérletben leírtak szerint tartották.

Gyógyszer

A guanabenzt a Sigmától (St Louis, MO) vásároltuk, fiziológiás sóoldatban oldottuk és i.p. injekcióban adtuk be (0, és 640 μg/kg).

Eljárás

1. fázis: Tréning. Az állatokat a 2. kísérletben leírt körülmények között kiképezték a kokain önadagolására.

2. fázis: Kihalás és tesztelés. Ebben a kísérletben a közbeeső időszakok a fent leírtak szerint 60 percesek voltak. A vizsgálat során az állatokat 0 vagy 640 μg/kg guanabenzzel kezelték előzetesen, i.p., az egymást követő napokon (lásd a 2. kísérletet) adott két visszaállítási teszt (lábsokk nélkül, lábsokk vagy sóoldat, kokain) mindegyikét megelőzően. A guanabenzt 60 perccel a kar behelyezése előtt adták be. A tesztek időtartama 3 óra volt. A guanabenz dózisát a 40 μg/kg klonidin helyettesíthetősége alapján választottuk ki egy kábítószer-diszkriminációs eljárásban (Bennett és Lal 1982).

Statisztikai elemzések

A mikrodialízis adatait vegyes faktoros ANOVA-val elemeztük az extracelluláris NE koncentrációjára a 20 perces dializátum mintákban; az alanyok közötti tényező a klonidin (0, 20, 40 μg/kg), a lofexidin (0, 75 vagy 150 μg/kg) vagy a guanabenz (0 vagy 640 μg/kg) dózisa volt, az ismételt intézkedés pedig az idő. A szignifikáns idő-dózis interakciókat egyirányú ANOVA-nak vetettük alá az egyes időpontokban a dózis tényezőre vonatkozóan. Adott esetben post hoc teszteket (Fisher LSD, p < .05) végeztünk a jármű (0 μg/kg) és a gyógyszeres körülmények összehasonlítására.

A két függő intézkedés a visszaállítás tesztjeiben az aktív karra adott válaszok száma (infúziók + időn kívüli válaszok) és az inaktív karra adott válaszok száma volt három óra alatt. Minden viselkedési adatot átlag ± SEM értékben mutatunk be. Mivel a különböző reintesztálási tesztekben a válaszok számának jelentős változékonysága miatt adott esetben a kapcsolódó (Friedman és Wilcoxon) és nem kapcsolódó (Kruskal-Wallis és Mann-Whiney) mintákra vonatkozó nem parametrikus statisztikákat használtuk.

A szacharóz vizsgálat (3A kísérlet) esetében a függő mérőszámok az aktív (megerősített + timeout válaszok) és inaktív karokon adott válaszok száma, valamint a kapott megerősítések száma voltak. Ismételt mérésekkel ANOVA-t végeztünk úgy, hogy a dózis volt az alanyon belüli tényező. Adott esetben post hoc teszteket (Fisher LSD, p < .05) végeztünk a jármű (0 μg/kg) és a gyógyszeres körülmények összehasonlítására.