Ammónium-szulfát fehérje kicsapása:

A sókicsapatás nagyon hatékony eszköz lehet a fehérjék kicsapással történő tisztítására. Az ammónium-szulfát általában a választott só, mivel olcsó, vízben nagyon jól oldódik, és sokkal hidratáltabbá tud válni (több vízmolekulával lép kölcsönhatásba), mint szinte bármely más ionos oldószer. A gyakorlatban az ammónium-szulfátot vagy közvetlenül szilárd anyagként adják hozzá, vagy (általában) telített oldatként adják hozzá a kívánt fehérjék kicsapásához.

Kis sókoncentrációknál (<0,15M) a több só hozzáadása általában a fehérjék oldhatóságát növeli, mivel az ionok megvédik a fehérjemolekulákat más molekulák töltéseivel szemben; ezt a tendenciát “besózásnak” nevezik. Egy bizonyos ponton az ionerősség túl nagy lesz, és negatívan hat a fehérjék oldhatóságára, amit “kisózásnak” nevezünk. Ez azért történik, mert az oldott só versenyez a fehérjékkel a kevés vízmolekuláért, növelve a víz felületi feszültségét, és így a fehérje szorosabbra hajtogatódik. A fehérje felületének csökkenése kevesebb fehérje-víz kölcsönhatást jelent, ami több hidrofób kölcsönhatást tesz lehetővé a fehérjemolekulák között, ami aggregációt, majd kicsapódást okoz.

A fehérjék oldatban is frakcionálhatók, mivel a só koncentrációjának függvényében kicsapódnak. Ily módon lehetséges bizonyos fehérjék tisztítása úgy, hogy meghatározott mennyiségű ammónium-szulfátot adunk a nemkívánatos fehérjék kicsapásához, visszanyerjük a felülúszót, majd egy kicsit több ammónium-szulfátot adunk a kívánt fehérje kicsapásához, majd a kicsapódott fehérje pelletjét megmentjük. Mivel a sócsapadék csak a fehérjék oldhatóságát befolyásolja, és nem denaturálja őket, a visszanyert frakció hosszabb ideig tárolható a sóoldatban anélkül, hogy aggódni kellene a bakteriális szennyeződés miatt, mivel a magas sótartalom gátolja a mikrobiális növekedést vagy a proteáz aktivitást.

Mivel az ammónium-szulfát kicsapás csak a fehérjék oldhatóságát csökkenti és nem denaturálja őket, a fehérjék koncentrálhatók a maradék ammónium-szulfát oldat eltávolításával, majd a fehérje pellet reszolubilizálható standard pufferekben vagy alacsonyabb ammónium-szulfát koncentrációban. Ezután hidrofób kölcsönhatás kromatográfia vagy gélszűréses kromatográfia használható a fehérjeoldat további tisztítására. Az ammónium-szulfát arra is használható, hogy az ammónium-szulfát koncentrációjának fokozatos növelésével egyes denaturálószerek, például a karbamid által kibontott fehérjéket visszavezessük a megfelelő natív konformációjukba.

Az ammónium-szulfáttal való munka során figyelembe kell venni néhány bevált gyakorlatot, például:

• Használjunk mozsarat és mozsárt a csomók felbontásához, és egyéb módon őröljük fel az ammónium-szulfátot, hogy megkönnyítsük a hozzáadást és az oldást.
• Egyszerre csak kis mennyiségű ammónium-szulfátot adjunk hozzá, várjuk meg, amíg feloldódik, és óvatosan keverjük, hogy elkerüljük a habzást.
• Az ammónium-szulfát savasító jellegének minimalizálása érdekében használjunk puffert, például 50 mM HEPES-t vagy Trist.
• Az analitikai minőségű ammónium-szulfátot használja, mivel az alacsonyabb minőségűek jellemzően nehézfém-szennyezettséget mutatnak.

A só kicsapásának folyamata néhány hátrányos tulajdonsággal is jár. A fehérjék kisózásához a fehérjék oldhatóságának előzetes ismerete szükséges. Ezenkívül a kiindulási mintában jelenlévő szennyeződések még mindig jelen lehetnek az érdeklődésre számot tartó fehérjét tartalmazó frakcióban; ez az eljárás koncentrálja a fehérjét, de nem tisztítja meg. Továbbá szükség lehet a só eltávolítására a fehérjemintából, így további feldolgozásra lesz szükség dialízis vagy kromatográfia formájában.

Kapcsolódó blogbejegyzések

• Milyen fehérjecsapadék-leválasztási technikákat használnak a koncentráláshoz és a tisztításhoz?
• Növényi fehérjeextrakció és fehérjecsapadék-leválasztási technikák