AmpR növeli a karbapenem-rezisztens Klebsiella pneumoniae virulenciáját a kapszulaszintézis kezdeti lépésének szabályozásával

Bevezetés

Klasszikus K. pneumoniae (cKp) és a hipervirulens K. pneumoniae (hvKp) a jelenleg keringő két globális K. pneumoniae patotípus1,2. Észak-Amerikában és Európában a legtöbb K. pneumoniae-fertőzést a cKp izolátumok okozzák, amelyek leggyakrabban opportunista kórokozók, és elsősorban az egészségügyben, immunhiányos gazdáknál okoznak fertőzéseket. E patotípus legproblémásabb jellemzője, hogy egyre több olyan elemet képes megszerezni, amelyek antimikrobiális rezisztenciát biztosítanak. A plazmidkódolt karbapenemázokkal társuló karbapenemrezisztens K. pneumoniae (CRKP) külön klinikai kihívást jelent, és magas mortalitással járó invazív fertőzéseket okoz.3,4

Tajvanról származó beszámolók a közösségben szerzett, szöveti invazív K. pneumoniae fertőzés egyedülálló klinikai szindrómáját írták le egészséges egyéneknél, amely gyakran több helyen jelentkezett vagy később terjedt el, beleértve a piogén májtályogot is.5,6. Ezt a patotípust a cKp-től való megkülönböztetés céljából hvKp-nek nevezték el, és a hvKp okozta fertőzések előfordulása az elmúlt 3 évtizedben folyamatosan nőtt az ázsiai csendes-óceáni országokban.7-11 A hvKp általában érzékeny az antimikrobás szerekre, de találtak már rezisztenciát is, sőt, egy olyan extenzíven gyógyszerrezisztens (XDR) cKp izolátumról is beszámoltak, amely egy hvKp virulencia plazmid egy részét szerezte meg, és halálos kimenetelű nosocomiális járványt okozott.12-15

A hvKp izolátumokra kezdetben érzékenynek és specifikusnak hitt jellemző a hipermukoviszkusz fenotípus volt, amelyet a pozitív string teszt határoz meg.16 Ez azonban némi zavart okozott, mivel nem minden hvKp izolátumról állapították meg, hogy hipermukoviszkuszos, és néhány cKp izolátum rendelkezett ezzel a jellemzővel.17 Nemrégiben több biomarker, köztük a peg-344, az iroB, az iucA, a plazmid által kódolt rmpA és rmpA2, valamint a kvantitatív sziderofórtermelés kimutatták, hogy pontosan előrejelzik a hvKp izolátumokat; ezeket a biomarkereket fel lehetne használni egy diagnosztikai teszt kifejlesztésére, amelyet a klinikai laboratóriumok az optimális betegellátás érdekében, valamint a járványügyi felügyelet és kutatás során használhatnak.18 Ebben a vizsgálatban azonban a nem hipermukoviszkuszos CRKP izolátumok egy új csoportját azonosítottuk, amelyből hiányzott a legtöbb hvKp-specifikus gén. Egy pángenom-széles körű asszociációs vizsgálat (Pan-GWAS), proteomelemzés és virulenciateszt egy állatmodellben kimutatta, hogy az AmpR a kapszulaszintézis beindulásának szabályozásával növeli ezen izolátumok virulenciáját. Továbbá azt is megállapítottuk, hogy a K-locus 47 (KL47) törzsek által hordozott AmpR ebben a vizsgálatban nem volt képes növelni a KL1 hipermukoviszkuszos K. pneumoniae virulenciáját.

Anyagok és módszerek

Klinikai izolátumok és adatgyűjtés

A nem ismétlődő klinikai K. pneumoniae izolátumokat Guangdong és Anhui tartományok 5 kórházának laboratóriumi orvostani osztályán 2018 és 2019 között rutinszerűen kimutatott és tárolt mintákból gyűjtöttük. Minden izolátumot felhasználás előtt -80°C-on tároltunk. A betegek klinikai adatait beszereztük. A fajok azonosítását és az antimikrobiális érzékenység vizsgálatát a VITEK-2 kompakt rendszerrel (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Franciaország) végeztük. Az eredményeket a Klinikai és Laboratóriumi Szabványügyi Intézet (CLSI; M100-S26 dokumentum) által közzétett iránymutatásoknak megfelelően értelmezték.19 Az összes izolátum azonosított faját mátrix-asszisztált lézer deszorpciós/ionizációs tömegspektrometriával (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Franciaország) erősítették meg. A CRKP-t imipenemmel vagy meropenemmel szembeni rezisztenciaként definiálták.

Hypermukoviszkusz fenotípusos jellemzés

A hipermukoviszkusz fenotípus madzagteszttel történő azonosításához az izolátumokat 5% juhvért tartalmazó agarlemezekre oltották és 37°C-on inkubálták egy éjszakán át. A zsinórteszt akkor volt pozitív, ha 5 mm-nél hosszabb viszkózus zsinórt lehetett létrehozni, ha egyetlen kolóniát egy standard oltóhurokkal megérintettünk és a kolóniát felfelé húztuk.2

Whole Genome Sequencing (WGS)

A genomi DNS (gDNS) kinyeréséhez 1 ml tenyésztési térfogatot (optikai sűrűség 600 nm-en 0,6) használtunk (Sangon, Sanghaj, Kína). A gDNS-t Illumina HiSeq 2500 szekvenálóval (Illumina, San Diego, CA, USA) szekvenáltuk párosított végű 150 bp olvasatokkal. A genom összerakását de novo SPAdes Genome Assembler (3.12.0 verzió) segítségével végeztük.20 Az összerakott szekvenciákon Kaptive (0.5.1 verzió) segítségével végeztük el a kapszula tipizálást.21 Az antimikrobiális rezisztenciagéneket és virulenciafaktorokat az izolátumokban a genomkontigok ResFinder és VFDB adatbázisokkal való szkennelésével azonosítottuk az ABRicate (0.8.7 verzió) segítségével. A multilókuszos szekvenciatipizálást (MLST) és a core genom MLST (cgMLST) genotipizálási elemzést a Ridom SeqSphere+ (5.1.0 verzió) segítségével végeztük el.22 A komplex típus (CT) meghatározása a K. pneumoniae cgMLST séma (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931) szerint történt. A törzsgenom egyetlen nukleotid variánsain (SNV) alapuló filogenetikai faépítést a Harvest suite (1.2. verzió) segítségével végeztük 1000-bootstrap teszttel.23 Az iTOL online eszközt használtuk a filogenetikai fa megjelenítéséhez, manipulálásához és annotálásához.24 A genomszekvenciákat a Prokka (1.13.3 verzió) segítségével annotáltuk.25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

A pángenom pipeline Roary (3.12.0 verzió) segítségével az annotált assembléket GFF3 formátumba helyeztük (a Prokka által előállított) és kiszámítottuk a pángenomot.26 A Scoary (1.6.16 verzió) segítségével vettük a “https://sanger-pathogens.github.io/Roary/” fájlt, létrehoztunk egy tulajdonságfájlt, és kiszámítottuk a járulékos genomban lévő összes gén és a tulajdonságok közötti asszociációkat. Közöltük az asszociáció erőssége szerint rendezett gének listáját, amelyek P-értéke < 0,01, a Benjamini-Hochberg módszerrel többszörös összehasonlítások korrekciójával korrigálva.27

Proteomelemzés

A fehérjeextrakcióhoz 1 ml tenyésztési térfogatot (600 nm-en mért optikai sűrűség 0,6) használtunk. A mintát háromszor szonikáztuk jégen nagy intenzitású ultrahangos processzorral (Scientz) lízispufferben (8 M karbamid, 1% proteáz inhibitor koktél). A maradék törmeléket 12 000 g-nél 4°C-on 10 percig tartó centrifugálással távolítottuk el. Végül a felülúszót összegyűjtöttük, és a fehérjekoncentrációt BCA-kittel határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. Az emésztéshez a fehérjeoldatot 5 mM ditiotreitollal redukáltuk 30 percig 56°C-on, majd 11 mM jodoacetamiddal alkileztük 15 percig szobahőmérsékleten, sötétben. A fehérjemintát ezután 100 mM TEAB hozzáadásával hígítottuk 2M alatti koncentrációjú karbamiddal. Végül tripszint adtunk hozzá 1:50 tripszin-fehérje tömegarányban az első emésztéshez egy éjszakán át, és 1:100 tripszin-fehérje tömegarányban a második 4 órás emésztéshez. A triptikus peptideket 0,1%-os hangyasavban (A oldószer) oldottuk, és közvetlenül egy házilag készített fordított fázisú analitikai oszlopra töltöttük (15 cm hosszú, 75 μm i.d.). A gradienst a következőképpen hajtottuk végre: 6%-ról 23%-os B oldószerre (0,1% hangyasav 98%-os acetonitrilben) történő emelkedés 26 perc alatt, 23%-ról 35%-os B oldószerre történő emelkedés 8 perc alatt, 80%-os B oldószerre történő emelkedés 3 perc alatt, és 80%-os B oldószeren tartás az utolsó 3 percben 400 nL/perc állandó áramlási sebesség mellett egy EASY-nLC 1000 UPLC rendszeren. A peptideket NSI-forrásnak, majd tandem tömegspektrometriának (MS/MS) vetettük alá az UPLC-hez online kapcsolt Q ExactiveTM Plus (Thermo) készülékben. Az alkalmazott elektrospray feszültség 2,0 kV volt. Az m/z letapogatási tartomány 350 és 1800 között volt teljes letapogatás esetén, és az intakt peptideket az Orbitrap készülékben 70 000-es felbontással detektáltuk. Ezután a peptideket MS/MS-re szelektáltuk a 28-as NCE-beállítással, és a fragmentumokat 17 500-as felbontással detektáltuk az Orbitrapban. Az adatfüggő eljárás során egy MS-leolvasás, majd 20 MS/MS-leolvasás váltakozott 15,0 s dinamikus kizárással. Az automatikus erősítésszabályozást (AGC) 5E4-re állítottuk be. A rögzített első tömeget 100 m/z-re állítottuk be. Az így kapott MS/MS adatokat a MaxQuant keresőmotor (v.1.5.2.8) segítségével dolgoztuk fel. Az InterProScan (5.37-76.0 verzió) programot használtuk a fehérjetartományok annotálásához. A korrigált p-érték < 0,05 és a > 1,2 fold változás szignifikánsnak minősült.

Az ampR komplement mutáns

K. pneumonia ampR (Kiegészítő anyagok) szintetizáltuk és 5ʹXbaI és 3ʹHindIII restrikciós helyekkel flankáltuk. Ezt a fragmentumot restrikciósan emésztettük és klónoztuk a pUC57-be. A rekombináns DNS-t Escherichia coli DH5α-ban állítottuk elő ampicillinszelekcióval. A restrikciós emésztést követően az ampR fragmentumot a pBAD33 expressziós vektorba (Invitrogen) ligáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. pBAD33-ampR-t használtunk transzformációhoz elektroporációval, mint a laboratóriumban izolált E. coli standardját. Az ampR-komplement törzseket polimeráz láncreakcióval (PCR) igazoltuk (S1. táblázat). Az ampR expresszióját 100 μg/ml arabinóz hozzáadásával indukáltuk.

Egerek tüdőfertőzési modelljei

A K. pneumoniae egerek tüdőgyulladásos modelljét használtuk az izolátumok virulenciájának tesztelésére. Hat-nyolc hetes nőstény BALB/c egereket vásároltunk specifikus kórokozómentes osztályban a Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.-től. Az egereket intraperitoneálisan altatták pentobarbitál-nátriummal (75 mg/kg), majd nem invazív intratracheális instillációval, közvetlen látás mellett 1,0 × 107 K. pneumoniae kolóniaképző egységgel (CFU) oltották be őket. Az egerek túlélését a fertőzés után 7 napig figyelték. A tüdőben lévő baktériumterhelés értékeléséhez a fertőzött egerek szerveit homogenizáltuk és 1 ml foszfát pufferoldatban (PBS) feloldottuk; 50 μL-t folyadékleves (LB) agarlemezre oltottunk, és CFU-számlálást végeztünk. A szövettani elemzéshez a tüdő szegmenseit 10%-os semleges formalinban rögzítettük, paraffinba ágyaztuk, és hematoxilinnal és eozinnal festettük a fénymikroszkópos megjelenítéshez. A baktériumterhelést és a szövettani elemzést a fertőzést követő 24 óra elteltével végeztük el.

Kapszuláris poliszacharidok extrakciója és mennyiségi meghatározása

A kapszuláris poliszacharidokat Zwittergent 3-14 detergenssel extraháltuk. Ezt követően az uronsav mennyiségét a korábban leírt módszer szerint mértük.28 Ezzel párhuzamosan a baktériumtenyészet sorozatos hígításait a CFU-szám meghatározásához kiültettük, és a kapszuláris poliszacharid koncentrációját a 109 CFU/mL mintához tartozó glükuronsav mennyisége (μg) alapján fejeztük ki. Minden kísérletet három példányban végeztünk.

Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzést a GraphPad Prism szoftver 8-as verziójával (La Jolla, Kalifornia) végeztük.

Eredmények

Izolátum jellemzői

A vizsgálatban nem ismétlődő CRKP (n = 135) izolátumokat használtunk. Minden izolátum 11-es szekvenciatípusú (ST11) volt, és K. pneumoniae karbapenemázt (KPC-2) expresszált, 1 izolátum pedig OXA-23 és KPC-2-t is hordozott (S1 ábra). Az izolátumokat a cgMLST séma segítségével 16 CT-hez rendeltük. A leggyakoribb CT-k a CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) és CT2410 (n = 11) voltak, amelyeket 11 másik, egyenként kevesebb mint 10 izolátumban azonosított CT követett (1. ábra). Minden izolátumot két KL típusba soroltak, a KL64 (n = 86) és a KL47 (n = 49) típusba (S2. ábra). Hipermukoviszkuszos izolátumokat nem találtunk. A virulencia-génelemzés azt mutatta, hogy a hvKp és cKp izolátumok megkülönböztetéséhez szükséges összes biomarkert hordozó izolátumról korábban nem számoltak be (1. ábra, S2. ábra).18

1. ábra A vizsgálatban szereplő 135 izolátum filogenetikai elemzése. A különböző CT-típusú izolátumok ágait színekkel jelöltük. Az egyes CT-típusok megfelelő izolátumai a következők: CT1291 (P1291-1-P1291-20), CT1313 (P1313-1-P1313-33, AH1313-1-AH1313-2), CT1689 (AH1689-1-AH1689-8), CT1772 (AH1772-1-AH1772-4), CT1814 (AH1814-1-AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1-P2405-9), CT2410 (P2410-1-P2410-11), CT2418 (P2418-1-P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1-P2445-6), CT3175 (AH3175-1-AH3175-2), CT3176 (AH3176-1-AH3176-14), CT3178 (AH3178-1-AH3178-4), CT3179 (AH3179-1-AH3179-2) és CT3195 (AH3195). Az rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 és iucA egy korábbi vizsgálatban a hipervirulens K. pneumoniae és a klasszikus K. pneumoniae megkülönböztetéséhez azonosították18.

Klinikai adatok elemzése

Nem volt szignifikáns különbség a CT-k között a demográfiai adatok, a fertőzés típusai, a főbb társbetegségek, az invazív műtétek, a Charlson-féle komorbiditási index és a Pitt-féle bakteraemiás score tekintetében, kivéve a központi vénás katétert, valamint az összes okból bekövetkező kórházi halálozás tekintetében (P = 0,035 és P = 0,001, Fisher pontos teszt). A CT3176-tal fertőzött betegek halálozási aránya szignifikánsan magasabb volt (78,6% vs 37,1%, P = 0,012; 78,6% vs 20,0%, P = 0,001; 78,6% vs 7,7%, P = 0,0003; 78,6% vs 31,0%, P = 0,004; Fisher pontos teszt) a CT1313, CT1291, CT1814 és a többi CT csoporthoz képest. A központi vénás katéterek felhasználása a CT1814-ben szignifikánsan magasabb volt, mint a CT1313-ban és a CT1291-ben (84,6% vs 51,4%, P = 0,049; 84,6% vs 35,0%, P = 0,011, Fisher pontos teszt) (1. táblázat).

Táblázat 1 Demográfiai adatok, társbetegségek, Invazív eljárások és a Carbapenem-rezisztens Klebsiella pneumoniae fertőzésben szenvedő betegek mortalitása

Pan-GWAS elemzés

A CT3176 genetikai alapjainak azonosítása érdekében Pan-GWAS elemzést végeztünk a CT3176 és a nem CT3176 csoportok között. 39 olyan gént azonosítottunk, amelyek ismert funkciókkal kapcsolódnak a CT3176-hoz (P < 0,01 Benjamini-Hochberg módszerrel korrigálva) (2. ábra), köztük virulenciafaktorokat, kapszulaszintézis géneket, antimikrobiális rezisztencia géneket és multidrog efflux transzportereket. Közülük az ampR mutatta a legnagyobb összefüggést a CT3176-tal. Megfigyeltük azonban, hogy más CT-k, például a CT3178 és néhány CT1689 izolátum (AH1689-2 és AH1689-6) is hordozta az ampR gént (1. ábra). Az ampR gént hordozó izolátumok mindegyike a KL47 csoportba tartozik.

2. ábra Pan-GWAS elemzés a CT3176 és a nem CT3176 csoportok között. A pangenomot és az asszociációkat Roary és Scoary segítségével számoltuk ki. A plot-térképet ggplot2-vel készítettük.

Proteomelemzés

Három ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 és AH1689-2) és három ampR- (AH1689-3, AH1689-4 és AH1689-5) izolátumot választottunk ki proteomelemzésre. Mindkét csoportban összesen 3093 fehérjét azonosítottak 36 727 egyedi peptid alapján. Végül 24 differenciálisan expresszált fehérjét (DEP) azonosítottunk. Közülük 15 volt felfelé szabályozott, 9 pedig lefelé szabályozott az ampR+ izolátumokban az ampR-izolátumokhoz képest (3A-C ábra, S2. táblázat). A WcaJ mutatta a legnagyobb mértékű hajtásváltozást, ezért kiemeltük.

3. ábra Proteomelemzés és kapszulafestés. (A) Az ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 és AH3178-1) és ampR- (AH1689-3, AH1689-4 és AH1689-5) Klebsiella pneumoniae izolátumok közötti kvantitatív fehérjeexpresszió összehasonlítását bemutató Volcano plot. (B, C) Az 1,2-nél nagyobb hajtásváltozást mutató differenciálisan expresszálódó fehérjéket színnel jelöltük.

Virulencia állatmodellben és a kapszula mennyiségi meghatározása

Az ampR nem hipermukoviszkuszos CRKP izolátumok virulenciájában betöltött szerepének azonosítása céljából három izolátumot (AH3176-1, AH1689-2 és AH1689-3) választottunk ki, és egérmodellben vizsgáltuk a virulenciát. Az AH3176-1 és az AH1689-2 két ampR+ izolátum volt, míg az AH1689-3 az ampR-izolátum (1. ábra). Ezenkívül két hipermukoviszkuszos törzset is kiválasztottunk a gyűjteményünkből, a GM2-t és a GM6-ot, hogy teszteljük a virulenciát. Mind a GM2, mind a GM6 a KL1-hez tartozik, amelyek közül a GM6 az ampR gént hordozza, míg a GM2 nem. A KL47 nem hipermukoviszkuszos törzs ampR szekvenciája azonban különbözött a KL1 hipermukoviszkuszos törzsétől, ezért ebben a tanulmányban ampRKL1 és ampRKL47 néven neveztük el őket.

Amint a 4A. ábra mutatja, az AH3176-1 és az AH1689-3:ampRKL47 plusz arabinóz esetében az 1 × 107 kolóniaképző egység (CFU) inokulummal a fertőzést követő 4. napon 0%-os túlélést tapasztaltunk, míg az AH1689-2 esetében 20%-os, az AH1689-3:ampRKL47 esetében 40%-os túlélést arabinóz nélkül, az AH1689-3:pBAD33 és ATCC70721 esetében 60%-os, az AH1698-3 esetében pedig 80%-os túlélést a fertőzést követő 7. napon. A túlélési arány szignifikánsan csökkent az ampRKL47 génnel való komplementálás után az AH1689-3-ban (n = 10; P = 0,033, log-rank Mantel-Cox teszt), ami az ampR fontos szerepére utal a virulenciában. Az egerek AH3176-1-gyel történő fertőzése a többi izolátumhoz képest körülbelül 10-100-szor nagyobb CFU-t eredményezett a tüdőben (4B. ábra). A tüdő patológiája különböző mértékű alveoláris falvastagodást, limfocita-infiltrációt és intravaszkuláris vérzést mutatott a fertőzési csoportban. Közülük az AH3176-1 által okozott pulmonális patológiai elváltozások voltak a legsúlyosabbak, amelyek kiterjedt pulmonális konszolidáció és intraalveoláris vérzés formájában jelentkeztek (4D-F ábra).

4. ábra A nem hipermukoviszkuszos Klebsiella pneumoniae izolátumok virulencia potenciálja egér pulmonális fertőzési modellben. (A) Az AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 és AH1689-3 ampRKL47 komplementmutánsok 1 × 107 kolóniaképző egységének (CFU) túlélésre gyakorolt hatását vizsgáltuk. (B) 24 órával a fertőzést követően (hpi) a fertőzött egerek tüdejét kitermeltük, és a baktériumterhelést CFU-számlálással határoztuk meg (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, egyirányú ANOVA). Az adatok 3 független kísérlet reprezentatív adatai. (C) A különböző törzsek uronsavtermelése. Párosítás nélküli, kétoldalas Student’s t-próbát végeztünk. Minden adatpontot háromszor ismételtünk meg (n = 3). Az adatok átlag ± s.e.m. *P < 0,05, ns = nem szignifikáns. A fertőzés nélküli (D) vagy az ATCC700721 (E) és az AH3176-1 (F) vírussal fertőzött egerek tüdejét összegyűjtöttük és hematoxilinnal és eozinnal festettük. Minden kép ×40-es nagyítással készült. Méretsávok: 250 μM.

Amint az 5A. ábrán látható, a GM6-tal fertőzött egerek túlélési aránya jelentősen alacsonyabb volt, mint a GM2 és az ATCC700721 esetében. Az ampRKL1 komplementálása után a GM2-ben a túlélési arány csökkenése volt megfigyelhető. Ezenkívül a GM6-tal fertőzött egerek tüdejében a baktériumterhelés jelentősen magasabb volt, mint a GM2 és az ATCC700721 esetében (5B. ábra); a HE-festés azt mutatta, hogy a GM6 fertőzés a tüdő kiterjedt konszolidációját és intraalveoláris vérzést okozott (5E-G. ábra). A túlélési arányt azonban nem befolyásolta, ha a GM2-be ampRKL47-et vittünk be (5C. ábra).

5. ábra A hipermukoviszkuszos Klebsiella pneumoniae izolátumok virulenciapotenciálja egér tüdőfertőzési modellben. (A) A GM2, GM6 és GM2 ampRKL1 komplement mutáns 1 × 106 kolóniaképző egységének (CFU) hatását vizsgáltuk a túlélésre (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, log-rank Mantel-Cox teszt),). (B) 24 órával a fertőzés után (hpi) a fertőzött egerek tüdejét kitermeltük, és a bakteriális terhet CFU-számlálással határoztuk meg (n = 10; **P < 0,01, egyirányú ANOVA). Az adatok 3 független kísérlet reprezentatív adatai. (C) Megvizsgáltuk a GM2 és a GM2 ampRKL47 komplement mutáns 1 × 106 CFU hatását a túlélésre. (D) A különböző törzsek uronsavtermelése. Párosítás nélküli, kétoldalas Student’s t-próbát végeztünk. Minden adatpontot háromszor ismételtünk meg (n = 3). Az adatok átlag ± s.e.m. *P < 0,05, ns = nem szignifikáns. A fertőzés nélküli (E) vagy GM2-vel (F) és GM6-tal (G) fertőzött egerek tüdejét összegyűjtöttük és hematoxilinnal és eozinnal festettük. Minden kép ×40-es nagyításban készült. Méretsávok: 250 μM.

Mivel a kapszula a K. pneumonia fő virulenciafaktora, és a proteomelemzés eredménye alapján kiemelt WcaJ a kapszulaszintézis kezdeti lépését szabályozza, megvizsgáltuk a kapszulás poliszacharid termelés mennyiségét. Az eredmény azt mutatta, hogy az ampR-komplementer törzsek AH1689-3:ampRKL47 és GM2:ampRKL1 plusz arabinóz szignifikánsan több kapszulapoliszacharidot (uronsavat) termeltek, mint az AH1689-3, illetve a GM2 (4C ábra, 5D ábra).

Diszkusszió

AzMLST a K. pneumoniae populációk meghatározásának leggyakrabban használt technikája. A gyors és megfizethető WGS segítségével az izolátumok tipizálásához teljes genomokat lehet összehasonlítani, nem pedig csak néhány lokuszt, mint a hagyományos MLST esetében. A cgMLST-vel végzett genotipizálás a genom több ezer allélját használja, ami magasabb szintű izolátum-megkülönböztetést eredményez. Ebben a tanulmányban a cgMLST-t 135 klinikai CRKP-izolátum osztályozására használtuk, és a klinikai információk alapján különbségeket találtunk a CT-típusok között. Az esetek korlátozott száma miatt nem tudtunk összefüggést megállapítani a CT-típusok és a klinikai kimenetel között. A halálozási arányok közötti különbségek azonban lehetővé tették számunkra, hogy tovább vizsgáljuk a CT3176-hoz tartozó izolátumokat. A GWAS-analízis kimutatta, hogy az ampR gén szignifikánsan társult a CT3176-os izolátumokhoz.

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az AmpC β-laktamáz szabályozó AmpR, amely a LysR transzkripciós faktorok családjának tagja, több virulencia-mechanizmust is szabályoz a Pseudomonas aeruginosa-ban.29,30 Eddig csak egy cikk számolt be az AmpR szerepéről a K. pneumoniae virulenciájának szabályozásában. A K. pneumoniae egy klonális izolátuma azt mutatta, hogy kevés ismert virulencia-gén felelős a súlyos fertőzésekért. Az AmpR ezekben az izolátumokban részt vett a kapszulaszintézis felszabályozásában, modulálta a biofilmképződést és a 3. típusú fimbriális gének expresszióját, valamint az egér gasztrointesztinális traktus kolonizációját.31 Ezen izolátumok virulenciaszintje azonban a letális fertőzési modellekre vonatkozó adatok hiánya miatt továbbra sem világos. Ebben a tanulmányban tüdőgyulladásos modellt használtunk, hogy megerősítsük ezen ampR-t hordozó izolátumok fokozott virulenciáját. Ez megmagyarázná, hogy az ezekkel az izolátumokkal fertőzött betegeknél miért volt magas a halálozási arány.

Régebben gyakori volt, hogy az ST11 típusú K. pneumoniae rezisztens volt a karbapenemekkel szemben, de nem volt hipervirulens. 2017-ben azonban ST11 típusú, karbapenem-rezisztens, hipervirulens K. pneumoniae izolátumok által okozott kórházi fertőzések kitöréséről számoltak be. Ezen izolátumok hipervirulencia fenotípusa egy körülbelül 170 kbp pLVPK-szerű virulencia-plazmid megszerzésének volt köszönhető az ST11 és a K47 szerotípusba tartozó klasszikus CRKP izolátumok által.15 A fenti jelentéssel ellentétben ebben a vizsgálatban nem találtak virulencia-plazmidot a fokozott virulenciájú ST11 CRKP izolátumokban, ami arra utal, hogy a virulencia fokozása nem a klasszikus mechanizmusnak köszönhető.32 A virulencia-plazmiddal ellentétben, amely több virulenciafaktort tartalmaz, az AmpR képes a virulenciát önállóan növelni. Ezt az AmpR-komplement törzs virulenciavizsgálata is megerősítette.

A WcaJ az az enzim, amely elindítja a kolánsavszintézist és az első cukrot (glükóz-1-P) a lipidhordozó undekaprenilfoszfátra rakja. A WcaJ potenciális szerepét a K. pneumoniae virulenciájában nemrégiben határozták meg.33 A proteomelemzés eredményei arra utalnak, hogy az AmpR a kapszulaszintézis kezdeti lépésének szabályozásával fokozza a K. pneumoniae virulenciáját. Mint szabályozónak, az AmpR-nek a gén promóteréhez kell kötődnie ahhoz, hogy kifejthesse szabályozó szerepét. A mai napig számos kapszulatípust azonosítottak a K. pneumoniae-ban,34 és az AmpR-kötőhelyek hiánya egyes kapszulatípusokban megmagyarázhatja, hogy a KL1 izolátumok virulenciáját miért nem képes fokozni a KL47 izolátumokban található AmpR.

Újabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a hipermukoviszkozitás és a hipervirulencia különböző fenotípusok, amelyeket nem szabad szinonimaként használni. Továbbá fontos megállapítani, hogy a negatív string teszt nem elegendő annak meghatározásához, hogy egy izolátum hipervirulens-e.35 Munkánk egyik legfontosabb eredménye, hogy nem hipermukoviszkuszos ST11 CRKP szubklónt azonosítottunk fokozott virulenciával.

A tanulmány fő korlátja, hogy csak kis számú esetről van szó, ezért nem tudjuk vizsgálni a klinikai kimenetel és a nem hipermukoviszkuszos hipervirulens CRKP fertőzés közötti kapcsolatot. Nem tudtunk ampR knockout törzset is létrehozni, és ez azzal magyarázható, hogy a genomikai elemzés kimutatta, hogy az ampR feltételezhetően plazmidon helyezkedik el (S3 ábra). Mivel a nem hipermukoviszkuszos fenotípussal rendelkező törzsek a klinikumban alig különböztethetők meg, sürgősen szükség van ezen új törzsek folyamatos felügyeletére és vizsgálatára.