[Antigén visszanyerése: jelentősége és hátrányai az immunhisztokémiában]

Az immunhisztokémia egyik legnagyobb problémája az volt, hogyan lehet az antigének jó morfológiáját és immunreaktivitását is megőrizni a szöveti metszetekben. Különböző technikákat dolgoztak ki az antigének immunreaktivitásának visszanyerésére (unmaszking) a rutinszerű szövetpreparációk után, mint például a fixálás, dehidratálás és beágyazás, és mostanra már nemcsak a citohisztológiai vizsgálatokban, hanem a patoklinikai diagnosztikában is megtalálják az immunfestések alkalmazását. Ebben a jelentésben először is áttekintettük mind a fixálás, mind az antigén-visszanyerés mechanizmusait és jelentőségét a fehérje inaktiválás szempontjából. Másodszor, áttekintettük a két legnépszerűbb leleplezési technika, az enzimes emésztés és a hőindukált epitóp-visszanyerés (HIER) néhány gyakorlati problémáját és megjegyzését annak érdekében, hogy a technikákat pontosan adaptálni lehessen az immunhisztokémiában. A fixálás által kiváltott fő artefaktum a szöveti antigének elfedése a fehérjék aminosavmaradványai közötti keresztkötés miatt. Fontos, hogy minden antigénhez megfelelő rögzítési körülményt válasszunk, figyelembe véve annak biokémiai természetét és a rögzítéssel szembeni ellenálló képességét. (2. táblázat), és a rögzítési körülményeket a minimumon kell tartani, hogy az antigén immunreaktivitása könnyen kinyerhető legyen különböző maszkmentesítési technikákkal (3. táblázat, 1. ábra). Az antigén visszanyerése önmagában a fehérjék denaturációját okozó folyamat a szövetekben, csakúgy, mint számos más fehérje inaktiválási folyamat (1. táblázat). Az enzimes emésztés lemarhatja a fehérjék maszkoló részeit az antigén körül, hogy feltárja az epitópot. Bár az enzimes emésztés viszonylag egyszerű, és kezelési feltételei könnyen ellenőrizhetők, az eredmények nem feltétlenül drámaiak és következetesek az enzimek típusától vagy mennyiségétől függően. Ezért meg kell találni a saját emésztési kézikönyvet, hogy az egyes antigének esetében a legjobb festési eredményt érjük el (pl. 4. táblázat). Például a pepszines emésztés adta a legjobb eredményt a bróm-dezoxiuridin (BrdU) és a proliferáló sejtmag antigén (PCNA) immunfestésében, míg más enzimeknek alig volt hatása (5. táblázat). A melegítés is hasíthatja a polipeptid gerincet és megszakíthatja a fixálással létrehozott keresztkötéseket. A melegítés hatása az antigén visszanyerésére hőmérsékletfüggő, és úgy tűnik, hogy arányos a hőmérséklet és az idő szorzatával. A paraformaldehiddel fixált paraffinba ágyazott metszeteken végzett PCNA immunfestés esetében legalább 3 percig 90 °C-on történő melegítésre volt szükség, azonban a melegítési feltétel erősödésével a nem specifikus háttérfestések is növekedtek (6. táblázat), ami az antigén-visszanyerés egyik legsúlyosabb problémája (2a., c. ábra). Az ilyen nemkívánatos eredmények elkerülésére az egyik lehetséges választás a szuboptimális fűtés (80 C fokon 10-15 percig) és a pepszin emésztés kombinációja (2b, d ábra). Egy ilyen drámai denaturálási módszer alkalmazásakor fontos elméleti megfontolás, hogy a maszkolt antigén epitópok megfelelően exponálhatók-e anélkül, hogy a korábban megbízható antitestekkel hamis pozitív (vagy hamis negatív) eredményeket kapnánk. Úgy tűnik, hogy minden antigénnek “testre szabott” szöveti preparátumra van szüksége az antigén jellegének optimális megőrzéséhez és pontos lokalizációjához. Az immunológia, a molekuláris biológia, a genetika vagy az embriológia fejlődésével összhangban egyre nagyobb szükség lesz a többszörös immunfestésre más technológiákkal, például in situ hibridizációval kombinálva, hogy a különböző molekulák közötti térbeli és funkcionális kapcsolatokat in situ elemezhessük. Az antigén-visszakeresés ekkor hatékony stratégiává válna.