Antitest validálás

Források “Technikai erőforrás központok “Antitest technikai erőforrások “Antitest validálás

Nem minden antitest érvényes minden kísérlethez és feltételhez, validálni kell őket az adott alkalmazáshoz és fajhoz. Jelenleg nincs szabványos eszköz az “antitestek validálására”, és ez nagymértékben befolyásolhatja a kísérletek reprodukálhatóságát és megbízhatóságát. A folyóiratok és a támogatást nyújtó ügynökségek lépéseket tettek ennek a hiányosságnak a kiküszöbölésére. Sokuknak már vannak olyan követelményeik, amelyek kifejezetten előírják, hogy hogyan validálnak egy antitestet egy adott felhasználásra. Sajnos nincsenek általánosan elfogadott kritériumok az antitestek validálására. Így minden egyes kutatóra hárul, hogy minden egyes antitestet a tervezett alkalmazáshoz validáljon.

Az alapvető validálás

A standard antitest validálási módszerek közé tartozik a western blot, az ELISA, az áramlási citometria és az IHC. A legtöbb kutató jól ismeri ezeket a bevált módszereket. A validálási folyamat időigényes lehet, mivel a kutatónak vagy a gyártónak minden egyes alkalmazáshoz validálnia kell az antitestet. Ezt a nehézséget fokozza, hogy az egyes vizsgálatok körülményei eltérőek. A western blot például a fehérjék denaturálásától függ. Így egy western blot-validált antitest denaturáló körülmények között jól működhet, de előfordulhat, hogy nem ismeri fel az antigéneket a natív konformációjukban (pl. ELISA).1 Hasonlóképpen, egy natív fehérjeaffinitásra validált antitest denaturálás vagy fixálás után nem képes megkötni ugyanazt az antigént.

A fenti módszerek szükséges szerepet játszanak az antitestek validálásában. Nem támaszkodhatunk azonban kizárólag ezekre a módszerekre, mert nem reprezentálják az egyre bővülő alkalmazásokat. A validált antitestek megbízhatósági szintje növelhető más validálási technikák bevonásával.”

Régi technikák, új felhasználások

Az antitestek alapvető validálásának hiányosságait orvosolandó, tudósok egy csoportja nemrégiben összegyűlt, hogy “javaslatot tegyen az antitestek validálásának standard irányelveire”.2 Azt javasolják, hogy az antitestek validálásának alapvető módszerei mellett a kutatók kezdjenek koncepcionális pillérekre támaszkodni. Ezek közé tartoznak a genetikai stratégiák, a független antitest stratégiák és a jelölt fehérjék expressziója.2

• Genetikai stratégiák: A genetikai stratégiák olyan technikákból állnak, mint aCRISPR-Cas9, az RNAi és az siRNS knockdown, amelyeket fehérje kimutatási próbával együtt használnak. Ezek a módszerek a megfelelő gén kiütése vagy lekapcsolása után detektálják a kérdéses antitest nem specifikus kötődését. Ha az antitest specifikus, akkor a kiütött vagy leállított sejtvonalakban nem, illetve csökkentett jelet kell észlelni az antitesttől.

• Független antitest-megközelítés

  A független antitestek használata egy másik módszer, amellyel a nem specifikus kötődés kimutatható. A független antitest megközelítés két különböző (független) antitestet alkalmaz, amelyek ugyanazt az antigént, de különböző epitópokat kötnek. Ezért a két antitestnek ugyanazt a detektálási mintázatot kell mutatnia, és nem lehet célponton kívüli kötődés.2 Ez a technika több mintát igényel a vizsgálathoz a változó célfehérje-expresszió ellenőrzéséhez, ami költséges és időigényes lehet.2 Ezenkívül a validálási technika olyan több antitest rendelkezésre állásán alapul, amelyek ugyanazon célfehérje különböző epitópjait ismerik fel. A GenScript aMonoExpress™ mAb szolgáltatásokban kínál epitóp binninget, amely “független antitesteket” tartalmaz a fehérje antigénekhez.

• Megjelölt fehérje expresszió

  A megjelölt célfehérjék kimutatásának elemzése módot adhat az antitestek nem specifikus kötődésének mérésére is. Ebben a módszerben a célfehérjéket affinitási címkével (pl. FLAG) vagy fluoreszcens fehérjével (pl. GFP) módosítják. Ezután a független antitest megközelítéshez hasonlóan a validálandó antitest detektálási mintázatát összehasonlítják a tag-specifikus antitestével. Bár egyszerű, a módszer egyik problémája annak biztosítása, hogy a címkézett fehérjék endogén szinten expresszálódjanak, mivel “a túlexpresszió elfedheti a célponton kívüli kötődési események kimutatását”.2

  Rekombináns antitestek a monoklonális antitestek alternatívájaként?

  A közelmúltban az antitestek validálásával kapcsolatos felhívás azt javasolta, hogy a kutatók a poliklonális vagy akár monoklonális antitestek helyett csak rekombináns antitesteket használjanak. A monoklonális antitesteket hibridóma sejtvonalak felhasználásával állítják elő. Sajnos a hibridóma-sejtvonalak elhalhatnak, elveszíthetik az antitestet kódoló génjeiket, vagy nem növekednek, amikor fagyasztott tárolásból kiveszik őket.3 Ráadásul a hibridómával előállított monoklonális antitestek egynél több célponthoz is kötődhetnek. Ezért a hibridoma által kódolt antitest szekvenciájának meghatározása és az antitest rekombináns előállítása megoldja ezeket a problémákat. Továbbá a meghatározott szekvencia miatt a rekombináns antitestek a fenti technikák kizárólagos alkalmazásához képest a validáció egy újabb rétegét biztosíthatják.3

  Ezek a további validálási módszerek azt javasolják, hogy “bizonyítékot szolgáltassanak arra, hogy az antitest megköti a célpontját, és a legtöbb esetben lehetővé kell tenniük az esetleges keresztreaktivitás értékelését is a vizsgált körülmények között”.2 A régi és új stratégiákat azonban valószínűleg kombinálva kell végrehajtani az antitestek megfelelő validálásához.

A megfelelő antitest-validálási módszer kiválasztása

Az antitesteket körülvevő összes ilyen kérdés mellett hogyan választja ki a megfelelő módszert?

Először is el kell döntenie, hogy milyen vizsgálatban fogja használni az antitestet. A CRISPR-Cas9 módszer például nem jár a célfehérje módosításával, és validálja, hogy az antitestnek nincs keresztreaktivitása más fehérjékkel. Így ezt a technikát az antitestek validálására használhatja a legkülönbözőbb vizsgálatokhoz, beleértve a western blot, IHC, immuncitokémia (ICC), áramlási citometria, ELISA, immunprecipitáció (IP), kromatin immunprecipitáció (ChIP) és fordított fázisú fehérjemérésekhez.2 A módosított fehérje expressziójának nehézségei miatt azonban egy antitest validálása jelölt fehérje expressziójával csak western blot, IHC, ICC és áramlási citometria esetén javasolt.

Másrészt a kutatónak tisztában kell lennie az ilyen validációs módszerek mintakorlátozásaival. Például mind a CRISPR-Cas9/KO, mind a jelölt fehérje-expressziós technikák nem használhatók antitestek validálására emberi szövetmintákban és testfolyadékokban, például plazmában és szérumban.2 Ennek az az oka, hogy az emberekben nem lehet genetikai manipulációt végezni, ellentétben a sejtvonalakkal.

Végezetül, függetlenül az antitest és az antitestszolgáltató által használt megfelelő validálási módszertől, a kutatónak legalább egy validálási stratégiát el kell végeznie az adott alkalmazás vagy minta kontextusában.2

A reprodukálható és megbízható eredmények eléréséhez kulcsfontosságú minden egyes antitest validálása az adott alkalmazás és faj szempontjából. Az információk segítenek Önnek a laboratóriumában alkalmazandó megfelelő módszerek kiválasztásában. Ha további segítséget szeretne kapni az antitestek validálásához vagy más alkalmazásokhoz, látogasson el a GenScript Antibody Technical Resources oldalára.

A BitesizeBio által a GenScript nevében készített tartalomból adaptálva.