Aporfin alkaloidok az Ocotea macrophylla (Lauraceae)

ARTIGO

Aporfin alkaloidok az Ocotea macrophylla (Lauraceae)

Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Kolumbia. AA 14490

ABSZTRAKT

Az Ocotea macrophylla (Lauraceae) fából négy aporfin-alkaloidot izoláltak és jellemezték (S)-3-metoxi-nordomesztin (1) néven, (S)-N-etoxikarbonil-3-metoxi-nordomeszticin (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomeszticin (3) és (S)-N-metoxikarbonil-3-metoxi-nordomeszticin (4); a 2-4 alkaloidákról most számolunk be először. Az izolált vegyületek szerkezetét spektrális adataik alapján és a spektrális adatoknak az irodalomban leírt értékekkel való összehasonlításával határoztuk meg. Az alkaloid frakció és az 1. vegyület gombaellenes aktivitást mutatott Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ellen, valamint az 1. vegyület antimikrobiális aktivitást mutatott Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis ellen is.

Kulcsszavak: Ocotea macrophylla; aporfin alkaloidok; Lauraceae.

BEVEZETÉS

Az Ocotea nemzetség (Lauraceae) több mint 350 fajt tartalmaz, amelyek az amerikai kontinensen és Afrika déli részén találhatók.1,2 Kolumbiában 35 Ocotea faj található, amelyek az ország egész területén, főként az Andok erdeiben találhatók.3 A hagyományos gyógyászatban néhány Ocotea faj különböző alkalmazásokat mutat. Az O. quixos-t fertőtlenítőszerként, helyi érzéstelenítőként és hasmenés elleni szerként használják.4 Az O. lancifolia-t parazitaellenes szerként, az O. caparrapi-t pedig rovarcsípések, kígyómarások, hörghurut és rákos daganatok kezelésére használják.5,6,6

Kémiai szempontból az Ocotea nemzetség elsősorban furofurán7 és tetrahidrofurán lignánok,8 biciklooktán9 és benzofurán neolignánok,10 valamint benzil-izokinolin11 és aporfin alkaloidok forrásaként ismert.5 Korábbi tanulmányokban az Ocotea macrophylla fából négy aporfin-alkaloidot izoláltak és azonosítottak: nantenin, glaucin, izokoridin és dehidronantenin12,13 . Ebben a dolgozatban az (S)- 3-metoxi-nordomesztin 1 mellett három új aporfin-alkaloid 2-4 izolálását és szerkezeti meghatározását ismertetjük, valamint a vegyületek antibakteriális és gombaellenes hatásáról számolunk be.

Eredmény és vita

Az O. macrophylla szárából sav-bázis extrakciót végeztek, hogy alkaloid frakciót nyerjenek, amelyet további frakcionálásnak és kromatográfiás tisztításnak vetettek alá, ami négy alkaloid izolálásához vezetett: (S)-3-metoxi-nordomeszticin (1), (S)-N-etoxikarbonil-3-metoxi-nordomeszticin (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomeszticin (3) és (S)-N-metoxikarbonil-3-metoxi-nordomeszticin (4). Az 1-4 alkaloidok szerkezetét az 1. ábra, spektroszkópiai adatait pedig az 1. táblázat mutatja.

A δH 6,30 (1H, s) jel a HMQC kísérletben nem mutatott kapcsolódást, ami fenolos OH-csoport jelenlétére utal, amit az IR is alátámaszt. A HMBC spektrum elemzése lehetővé tette a szubsztituensek helyének meghatározását a δH 5,94 és 5,95 (a metiléndioxi csoportra vonatkozó) jelek és a δC 145,9 (C-9) és 146 (C-9) jelek között megfigyelt korrelációk alapján.2 (C-10), illetve ez utóbbi két jel és a δH 6,70 (H-8), illetve 7,90 (H-11) protonok között, ami arra utal, hogy a 9. és 10. pozícióban egy metiléndioxi csoport és az aromás gyűrűn két para-orientációjú hidrogén található. Az 1. pozícióban lévő hidroxilcsoport jelenlétét a C-11b-hez rendelt δH 6,30 és δC 116,5 jelek közötti korreláció alapján határoztuk meg. A C-2 és C-3 pozícióban lévő metoxilcsoportok helyét a δH 3,96 és 3,86-nál lévő hidrogének és a δC 138,4 (C-2), illetve δC 147,8 (C-3) szénatomok közötti korreláció alapján határoztuk meg.

A C-6a abszolút konfigurációját S-nek rendeltük, mivel a CD-görbén 280 nm-en negatív Cotton-hatást, 240 nm-en pedig pozitív Cotton-hatást mutat.17 Ezenkívül ezt megerősítette az optikai forgás pozitív értéke 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Ezért az 1. alkaloidot (S)-3-metoxi-nordomeszticinnek határoztuk meg, egy aporfin-alkaloidnak, amelyet korábban a szintén a Lauraceae családba tartozó Nectandra sinuatából19 jelentettek. Ez a jelentés korrigálja és kiegészíti ennek a vegyületnek a spektroszkópiai adatait.

A 2. alkaloidot sárga olajként kaptuk, amely pozitív reakciót ad a Dragendorff-reagenssel, és optikai forgási értéke 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3) volt. A 2 UV- és IR-spektruma hasonló volt az 1 spektrumához, kivéve, hogy mindkét spektrumban megjelentek a karbamátcsoportnak tulajdonítható abszorpciók 282 nm-nél, illetve 1688 cm-1-nél.20 Az 1H és 13C NMR spektrumok hasonló profilt mutattak, mint az 1. Az 1H NMR-ben két új jel jelent meg δH 4,29 (2H, m) és 1,29 (3H, m), valamint a H-5 jel elmozdulása, ami egy védőtlenítő csoport közeli jelenlétének köszönhető. A COSY-kísérlet a δH 4,29 és 1,29 jelek korrelációját mutatta ki, ami egy etilcsoport jelenlétére utal, amely az elmozdulás miatt egy heteroatomhoz való kapcsolódásra utal. A 13C NMR- és DEPT-spektrumok három új jel megjelenését mutatták δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) és 14,8 (CH3) értéken, amelyek egy nitrogénatomhoz kapcsolódó etoxikarbonilcsoport tipikus jelei. A C-6a abszolút konfigurációját S-ként határoztuk meg, mivel ugyanazt a Cotton-hatást mutatta, mint az 1. Ezért a 2. alkaloid vegyületet (S)-N-etoxikarbonil-3-metoxi-nordomeszticinként azonosítottuk. ESIMS spektruma a C22H22NO7 molekulaformulának megfelelő m/z 414 +-nál egy pszeudomolekuláris ioncsúcsot mutatott, a fragmentálódások pedig a CH3OH és a CH3CH2OH elvesztésének voltak köszönhetőek az m/z 382 + és az m/z 368 +-nál. A negatív ion módú ESI spektrum az m/z 412 – és az m/z 383 . csúcsokat mutatta, ez utóbbi az etilcsoport elvesztése. Ilyen típusú, N-etoxikarbonil szubsztituensű alkaloidokat izoláltak a Lindera angustifoliából (Lauraceae).21

A 3. alkaloidot sárga olajként kaptuk, amelynek optikai forgási értéke 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). Az IR spektrum hasonló volt az 1. és 2. alkaloidákéhoz. Ezen kívül a formilcsoportra jellemző 2830, 2700, 1739 cm-1 -es abszorpciók jelenlétét figyeltük meg. A HRESIMS negatív módban a pszeudomolekuláris iont figyeltük meg – m/z 369,1133-nál, amely megfelel a C20H20NO6 molekulaformulának. Az ESI-MS spektrumok negatív ion módjában a formilcsoport elvesztését mutatták az m/z 339 .. m/z-nél. Az NMR profil hasonló volt az 1. és 2. alkaloidokéhoz. Az 1H NMR-ben különböző jelek jelentek meg, amelyek a két izomer 3:1 arányú keverékéhez tartoznak. A fő izomer összehasonlítása az 1. alkaloiddal az NMR-ben az aromás gyűrű szubsztitúciójának azonos mintázatát mutatta, amellett, hogy két új jel jelent meg az 1H-ban δH 8,25 (1H, s) és a 13C-ban δC 161,9-nél a formilcsoporttól a 3-hoz. Ez a nitrogén funkcionalitás rotációs izomerek kialakulásához vezetett, amelyeket korábban már leírtak N-formil és N-acetilcsoporttal rendelkező alkaloidok esetében.22 Az abszolút konfigurációt S-ként határoztuk meg, ugyanúgy, mint az 1 és 2 esetében. Ezért ezt a 3-as alkaloidot (S)-N-formil-3-metoxi-nordomeszticinként azonosítottuk.

A 4-es alkaloidot fehér szilárd anyagként kaptuk, olvadáspontja 222-223 ºC (MeOH), optikai rotációja 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). A 4 NMR-adatainak elemzése kimutatta, hogy ugyanolyan alapvázzal rendelkezik, mint a 2, de a 2-ben lévő etilcsoport jelek helyett a 4 esetében a δH 3,76 (3H, s) és δC 52,6 jelek szerint metil-észterrel rendelkezik. A HRESIMS egy pszeudomolekuláris iont mutatott ki – m/z 398,1233-nál, amely megfelel a C22H22NO7 molekuláris képletnek. Ezért a 4 alkaloidot (S)-N-metoxikarbonil-3-metoxi-nordomeszticinként azonosítottuk.

A gombaellenes aktivitást korongdiffúziós módszerrel értékeltük a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 egy fitopatogén gomba ellen, amely a paradicsomkultúrákat károsítja, hatalmas veszteségeket okozva a gazdáknak. Az alkaloid frakció 250 μg/μL koncentrációban volt aktív a F. oxysporum ellen. A gomba növekedésével szembeni gátló hatás mérsékelt volt 5 μg/μL-nél az (S)-3-metoxi-nordomesztin-1 esetében, míg a többi alkaloid hatástalan volt, ami arra utal, hogy a nitrogénatomon lévő elektronelvonó szubsztituensek jelenléte csökkenti a gombaellenes aktivitást.

Az aporfinok gombaellenes aktivitásáról szóló kevés értékelő jelentés ellenére úgy találták, hogy ezek aktívak olyan fajokkal szemben, mint a Candida albicans,24,25 de inaktívak olyan gombakórokozókkal szemben, mint a Cladosporium herbarium.26. Ezek az eredmények az alkaloidok gombaellenes aktivitásának új értékelési jelentését jelentik, ahol hangsúlyozzák, hogy az aporfinok nitrogénjén lévő szubsztituensek típusa hatással van az általuk kifejtett gombaellenes aktivitásra.

Az antibakteriális aktivitást a Lerhrer27 által közölt radiális diffúziós módszerrel értékelték két Gram (+) standard törzzsel szemben: Staphylococcus aureus 6538 és Enterococcus faecalis 29212, valamint három Gram (-): Escherichia coli 25922 és Salmonella tiphymurium, MS7953 és 14028s törzsek. Az 1. alkaloid (2,5 μg) antimikrobiális aktivitást mutatott mindkét vizsgált Gram-pozitív baktériummal szemben, a 2. táblázatban látható 30 AU értékekkel.

A 3-metoxi-nordomesztin vegyület racém keveréke esetében már beszámoltak az E. coli (MIC= 256 μg/ml) és a S. aureus (MIC= 512 μg/ml) elleni aktivitásáról,28 azonban ebben az esetben az 1. vegyület nem aktív az E. colival szemben. coli ellen.

Hasonlóan a gombaellenes aktivitáshoz, az eredmények azt mutatják, hogy a nitrogénen lévő szubsztituens jellege befolyásolja az antibakteriális aktivitást (2. táblázat).

KÉPZÉS

Általános eljárások

Az olvadáspontot Mel-temp Fisher Johns, Laboratory Device segítségével határoztuk meg. Az UV spektrumokat Perkin Elmer Lambda 2S készülékkel, a CD spektrumokat pedig JASCO J-720 spektrométerrel vettük fel. Az IR-spektrumokat Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 sorozat 1000-es Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 sorozatú készülékkel nyertük vékonyrétegként. Az optikai forgásokat Schmidt-Haensch polariméterrel vettük fel. Az 1H (400 MHz) és 13C (100 MHz) NMR spektrumokat, valamint a 2D spektrumokat (COSY, HMQC és HMBC) Bruker Avance 400 MHz-es spektrométeren végeztük CDCl3 belső referenciát használva. A HRMS meghatározások egy Shimadzu LCMS-IT-TOF tömegspektrométer rendszeren történtek ESI-vel pozitív ion módban és negatív ion módban. Az oszlopkromatográfiát (CC) szilikagéllel (70-230 és 230-400 mesh, Merck), az analitikus kromatográfiát pedig szilikagél 60 PF254 (0,25 mm) segítségével végeztük.

Növényi anyag

Az O. macrophylla szárát 2006 júliusában a kolumbiai Nocaimából gyűjtötte W. Delgado. A botanikai példányt A. Jara azonosította, és egy voucher példányt (COL-517191), a Kolumbiai Nemzeti Egyetem Kolumbiai Nemzeti Herbáriumában (Kolumbia, Bogotá, Kolumbia) helyezték el.

Kivonatolás és izolálás

Az Ocotea macrophylla szárát (2,0 kg) szobahőmérsékleten történő macerálással EtOH-val extraháltuk, majd vákuumban koncentráltuk, hogy kivonatot (102,6 g) kapjunk. Ebből a kivonatból egy mintát (48,9 g) ultrahanggal vízben oldottunk, és 5%-os HCl-lel pH 2,0-ra savanyítottuk. A savas szuszpenziót ezután leszűrtük és 20%-os NaOH-val pH 8,0-ra lúgosítottuk, majd ezt követően kloroformmal extraháltuk. A kloroformos frakciót (3,01 g) szilikagél oszlopkromatográfiának vetettük alá, és petroléter:AcOiPr (4:6-0:10) és AcOiPr:MeOH (10:0-0:10) gradienssel eluáltuk, így négy frakciót (I-IV) kaptunk. Az I. frakciót (347 mg) ismételten oszlopon (CC) kromatizáltuk szilikagélen, és n-hexán:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 és Tol:AcOiPr 7:3 elúcióval eluáltuk. Így kaptuk az 1. (7 mg) és a 2. (4 mg) alkaloidot. A II. frakciót (250 mg) szilikagélen oszlopkromatográfiának vetettük alá, és CHCl3:AcOEt (85:15) eluálással, majd Sephadex LH-20-on (CH3OH) CC-nek vetettük alá, így kaptuk a 3. alkaloidot (8 mg). A IV. frakciót (1433 mg) ismételt oszlopkromatográfiával tisztítottuk szilikagélen, CH2Cl2:MeOH 97:3 és CH2Cl2 elúciós rendszerrel. Végül az egymást követő mosások MeOH-val a 4. alkaloidot (98 mg) eredményezték.

Gombaellenes vizsgálat

A F. oxysporumot a Cundinamarcai Egyetem (Agronómiai Tanszék, Növénykórtani Laboratórium) tenyészetgyűjteményéből nyertük. A gombaellenes aktivitási vizsgálatokhoz PDA-t használtunk táptalajként. A táptalajt 100 μL 105 spórát tartalmazó oldattal oltották be. A mintákat különböző koncentrációjú oldatokban készítettük, amelyek az alkaloid frakció 50, 25 és 10 μg/μL-nek, valamint a tiszta alkaloidok 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 és 0,1 μg/μL-nek feleltek meg. Tíz mikroliter mintát vittünk fel a szűrőpapírkorongokra és helyeztük az oltott táptalajra. A lemezeket lezártuk, és 3 napig 25 °C-on inkubátorban hagytuk. A növekvő gombával szemben megjelenő tiszta zónák jelezték a frakció vagy alkaloid minimális mennyiségét, amely a gomba növekedésének gátlásához szükséges. Minden kezeléshez három ismétlés készült. Pozitív kontrollként a benomilt (benzimidazol – 5 μg), negatív kontrollként pedig az acetont használtuk.23

Antibakteriális vizsgálatok

Az antibakteriális aktivitást a Lehrer által korábban közzétett módszertan alapján adaptált radiális diffúziós módszerrel értékeltük.27 A vegyületeket két Gram (+) törzzsel szemben vizsgáltuk: Staphylococcus aureus ATCC 6538 és Streptococcus fecalis ATCC 29212, valamint három Gram (-) törzs ellen: Escherichia coli ATCC 25922 és Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s és Salmonella tiphymurium MS7953. Az egyes törzsekből izolált kolóniát Gram (+) törzsek esetében 3 ml szójás triptikázba (TSB), Gram (-) törzsek esetében pedig Luria tápoldatba (LB) helyeztük, és 37 °C-on, kevergetés mellett addig inkubáltuk, amíg a mikroorganizmusok logaritmikus fázisba nem léptek. A felülúszót eltávolítottuk, és a kapott üledéket foszfátpufferben (PBS) újra szuszpendáltuk, majd PBS-szel mostuk és centrifugáltuk. Végül az üledéket újra szuszpendáltuk PBS-ben, és 620 nm-en meghatároztuk az optikai sűrűséget a milliliterenkénti CFU (kolóniaképző egységek) számának kiszámításához. Minden edényben 4 x 107 CFU-t tartalmazó bizonyos térfogatot diszpergált. A mért térfogatot összekevertük és homogenizáltuk 15 mL többé-kevésbé 45 °C-ra olvasztott agarózban. Ezt a baktériumszuszpenziót Petri-csészékbe tálaltuk, és szobahőmérsékleten hagytuk megszilárdulni, majd steril lyukasztóval 2 mm átmérőjű lyukakat készítettünk.

A vizsgálati mintákat 1 mg tiszta vegyületet 500 μL DMSO-ban feloldva készítettük el, amelybe 8 μL mintát duplikátumban helyeztünk, és 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. Ezt követően hozzáadtuk a tápközeget, amely olvasztott agar agart és TSB-t tartalmaz, 18 órán át inkubáltuk 37 ºC-on, majd a vegyület aktivitása alapján megmértük a gátlási zónák átmérőjét. Pozitív kontrollként különböző antibiotikumokat, Ampicillint (50 mg/ml), Kanamicint (10 mg/ml) és Tetraciklint (4,12 mg/ml) használtunk 1:100-as hígításban PBS-ben, negatív kontrollként pedig DMSO-t és PBS-t, minden egyes kontroll 8 μl-t szolgált minden kútban. A gátlási zónák átmérőjét milliméterben mértük, és az eredményeket aktivitási egységekben adtuk meg az aránynak megfelelően, amely előírja, hogy 1 egységnyi hatás (UA) 0,1 mm gátlási zónának felel meg.

MAGYARÁZATI ANYAG

ÖSSZEFOGLALÁS

A szerzők köszönetet mondanak a Kolumbiai Nemzeti Egyetemnek a projekt pénzügyi támogatásáért. Továbbá köszönetet mondanak a Nukleáris Mágneses Rezonancia Laboratóriumnak és a tömegspektrometriás laboratóriumnak az NMR spektrumok, illetve a HR-ESI-MS felvételéhez nyújtott támogatásukért. Továbbá a szerzők köszönetet mondanak a Javeriana Egyetemnek az optikai forgatásokért, a FIDIC-nek (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) a CD spektrumok felvételéért és különösen Prof. J. M. Lozanónak az antibakteriális aktivitás vizsgálatáért.

1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.

2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.

4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.

5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.

6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.

7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.

8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.

9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.

10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.

11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.

12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.

13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.

14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.

15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.

16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.

17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.

18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.

19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.

20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.

21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.

22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.

23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.

24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.

25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.

26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.

27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Módszerek. 1991, 137, 167.

28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bika. 2009, 57,

Befogadva 26/6/09; elfogadva 6/11/09; közzétéve az interneten 10/3/10

* email: [email protected]

KIEGÉSZÍTŐ ANYAG