Az Anakinra, egy rekombináns humán interleukin-1 receptor antagonista, gátolja az apoptózist kísérleti akut szívinfarktusban

Az akut szívinfarktus (AMI) világszerte a morbiditás és mortalitás egyik fő oka. Az AMI-t a hirtelen fellépő myocardialis ischaemia és az azt követő nekrózis okozza. Az AMI-t túlélőknél a halálozás kockázata az indexes eseményt követő években is magas marad. Mivel az AMI kezelése az elmúlt években jelentősen javult, egyre több beteg éli túl az AMI-t. Az AMI leggyakoribb szövődménye a bal kamrai diszfunkció és szívelégtelenség kialakulása. A szívizomzat kezdeti iszkémiás károsodása olyan események kaszkádját aktiválja, amelyek végül kedvezőtlen kardiális remodellinghez és szívelégtelenséghez vezetnek, az ebből következő túlzott morbiditással és mortalitással.1 Az iszkémiás és nem iszkémiás szívizomzatban zajló remodelling folyamatot különböző útvonalak fel- és leszabályozása közvetíti, amelyek a halál és a túlélés közötti kényes egyensúlyban a kardiomiomiocita hipertrófiát és apoptózist váltják ki.1,2 Az interleukin-1 (IL-1) receptor antagonista (IL-1Ra), az IL-1 család tagja, egy természetesen előforduló gyulladásgátló fehérje, amely akut fázisú reaktánsként viselkedik.3,4 Más akut fázisú reaktánsokhoz hasonlóan az IL-1Ra szintje is emelkedik AMI során, és szintje korrelál a prognózissal.5,6 Az AMI során megnövekvő IL-1Ra szerepe nem egyértelmű, és olyan feltételezések is születtek, hogy szerepe a pusztán károsodás markerétől a gyulladásos válasz modulátorán át a potenciális citoprotektív ágensig terjed.5,8 Nemrégiben kimutatták, hogy az IL-1Ra erőltetett expressziója egy állatmodellben kardioprotektív hatású az infarktus méretének és az apoptózisnak a csökkenése szempontjából.8

A jelen tanulmányban az anakinra, egy exogén rekombináns humán IL-1Ra hatását vizsgáltuk 2 kísérleti modellben, bal koszorúér sebészi lekötésével rágcsálókban: Az anakinra azonnali beadásának vizsgálata egérmodellben, hogy felmérjük az apoptózisra, az infarktus méretére és a remodellingre gyakorolt hatását, valamint az anakinra késleltetett (24 órás) beadásának vizsgálata, hogy felmérjük az apoptózisra gyakorolt hatását az esetleges infarktus-kímélő hatásoktól függetlenül, valamint a szív remodellingre gyakorolt hatását patkánymodellben (a lehetséges fajok közötti különbségek felmérése céljából). Emellett az anakinra antiapoptotikus hatását in vitro is vizsgálták.

Módszerek

Műtéti eljárások

Minden állatot a Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.) szállított. Minden állatkísérletet a National Institutes of Health által kiadott, a laboratóriumi állatok humánus felhasználásáról és gondozásáról szóló irányelvek (No. 85-23, felülvizsgált 1996) alapján végeztünk. A Rákkutató Intézet felnőtt hímivarú egereit (életkor: 10 hét; súly: 26-38 g) és felnőtt Wistar patkányait (életkor: 10 hét; súly: 350-500 g) szívkoszorúér-lekötésnek vetették alá. A sebészeti beavatkozásokat az 1. napon 2 képzett operátor (F.N.S. és S.S.) végezte a korábban leírtak szerint.9,10 Az állatok altatásban (pentobarbitál 50-70 mg/kg) intubálták és jobb dekubitusra helyezték őket, majd a mellkas sebészeti megnyitását és a bal proximális koszorúér lekötését végezték el. Nyolc egéren és 8 patkányon látszatműtétet végeztek, amely a koszorúér-lekötés kivételével minden lépést tartalmazott; felét napi anakinra (1 mg/kg) injekcióval, a fennmaradó felét pedig sóoldatos injekcióval kezelték. A Virginia Commonwealth Egyetem Intézeti Állatgondozási és Állatfelhasználási Bizottsága jóváhagyta a vizsgálatot. Tíz egér és 4 patkány elpusztult a közvetlen posztoperatív időszakban, és nem vettek részt az elemzésekben.

Kezelés

Két alvizsgálatot végeztünk: azonnali anakinra beadást az iszkémia alatt az egérnél és késleltetett anakinra beadást 24 órával az iszkémia után a patkánynál. Az egérmodellben az anakinrát 1 mg/kg (ami megfelel a reumatoid artritisz kezelésére ajánlott dózisnak) intraperitoneálisan adtuk a műtét alatt, majd naponta 6 adagban 20 egérnek (16-nak koszorúér-lekötéssel és 4-nek látszatműtéttel). A patkánymodellben az anakinrát intraperitoneálisan adták a 2. napon, majd naponta 5 dózison keresztül 8 patkánynak (4 koronarilevágással és 4 látszatműtéttel). A fennmaradó 24 egér (20 koszorúér-lekötéssel és 4 látszatoperált) és 12 patkány (8 koszorúér-lekötéssel és 4 látszatoperált) NaCl 0,9%-os (sóoldat) injekciót kapott. Két különböző rágcsálófajt használtunk a lehetséges fajok közötti különbségek értékelésére. További 28 egéren a műtét után 24 órával elvégeztük az infarktus méretének értékelését: 6 sóoldattal kezelt egér és 22 anakinra növekvő dózisokkal (1 mg/kg , 10 mg/kg és 100 mg/kg ) kezelt egér, hogy felmérjék az anakinra esetleges dózisfüggő infarktus-kímélő hatását. Végül további 6 egeret (3 anakinrával kezelt és 3 sóoldattal kezelt) altattunk el 7 nappal a koszorúér-lekötés után a mátrix metalloproteináz-9 (MMP-9) expressziójának értékelése céljából. Összesen 78 egeret és 20 patkányt használtunk fel ebben a vizsgálatban.

Infarktusméret értékelése

Huszonnégy órával az infarktusprotokoll befejezése után a szívet gyorsan eltávolítottuk és Langendorff-készülékre szereltük. A koszorúereket 2,5 mmol/L CaCl2-t tartalmazó 0,9%-os NaCl-lal perfundáltuk. A vér kimosása után ≈2 ml 10%-os Evans-kék festéket adtunk be bólusként az aortába, amíg a szív nagy része meg nem kékült. A szívet sóoldattal perfundáltuk, hogy kimossuk a felesleges Evans-kéket. Végül a szívet eltávolítottuk, lefagyasztottuk, és a szívcsúcstól a bázisig 8-10 egyenlő vastagságú (≈1 mm) keresztirányú szeletre vágtuk. A szeleteket ezután izotóniás foszfátpufferben (pH 7,4) lévő 10%-os trifenil-tetrazolium-klorid oldatban inkubáltuk szobahőmérsékleten 30 percig. Az infarktusos szövetek, a kockázati zóna és a teljes bal kamra területét számítógépes morfometriával határoztuk meg a BIOQUANT képalkotó szoftverrel (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Az infarktus méretét az ischaemiás kockázati zóna százalékában fejeztük ki, amelyet a bal kamra százalékában határoztunk meg.

Echokardiográfia

Transztorakális echokardiográfiát végeztünk könnyű altatásban (pentobarbitál 30-50 mg/kg) közvetlenül a műtét előtt és 7 nappal a műtét után, közvetlenül a halál beállta előtt. A Doppler echokardiográfiát a Vevo770 képalkotó rendszerrel (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) és egy 30 MHz-es szondával végeztük az egérnél; a patkánynál egy 15 MHz-es fázis-soros átalakítóval (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif) felszerelt echokardiográfiás rendszert használtunk. A transzducert a mellkas bal elülső oldalán helyezték el. A szívet először 2 dimenziós üzemmódban, a bal kamra rövid tengelyű nézetében képezték le. Az M-módú kurzort az elülső és a hátsó falra merőlegesen helyezték el a bal kamra (LV) végdiasztolés és végszisztolés átmérőjének (LVEDD és LVESD) méréséhez. Az Amerikai Echokardiográfiás Társaság ajánlásainak11 megfelelően ezután M-módú felvételeket készítettek a papilláris izmok szintjén, a mitrális billentyű csúcsa alatt. Az egérben apikális 4- és 5-kamrás felvételeket is készítettünk a transzmissziós áramlás, a bal kamrai kiáramlás és a transaorta áramlási sebességének mérésére. Az LV frakcionált rövidülését (FS) a következőképpen számították ki: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Az ejekciós frakciót a Teichholz-formulával számították ki. A transzmissziós és a bal kamrai kiáramlási traktus pulzált Doppler-áramlási spektrumát az apikális nézetből nyertük. A kiáramlási traktus áramlásának mérését végeztük. Megmérték az izovolumetrikus összehúzódási (ICT) és relaxációs (IRT) időket és az ejekciós időt (ET). Az LV kiáramlási traktus (LVOT) áramlási sebesség-idő integrálját (AoVTI) is megmérték. Ezeket az adatokat a Tei-index (Tei-index=ICT+ IRT/ET)12 és a szívteljesítmény (CO=AoVTI×π×(LVOT átmérő/2)2×szívfrekvencia, ahol az LVOT keresztmetszetét a paraszternális hossztengelyes nézetben mértük) kiszámításához használtuk. Emberekben a magasabb Tei-index mind szisztolés, mind diasztolés diszfunkcióval és rosszabb kimenetellel jár együtt12. A különböző kezelésekhez való hozzárendelés véletlenszerű volt, és az echokardiogramot végző és leolvasó vizsgáló vak volt a kezelést illetően.

Patológia

A 7. napon az echokardiográfiát követően és altatásban a hasi aortát polietilén katéterrel kanülálták, a mellkast felnyitották, az aortát foszfátpufferrel (0,2 mol/l, pH 7,4) és heparinnal (100 NE) töltötték fel, és a jobb pitvart felvágták, hogy lehetővé tegyék a drenázst. Gyors egymásutánban a szívet diasztolésan leállították, és foszfát-pufferelt formalin perfúziót indítottak. Csak a patkányok esetében a citokin-plazma meghatározásához 1-2 ml teljes vért nyertünk a szívből. A bal kamra kamráját fixálószerrel töltöttük fel a 10 perces fixáláshoz. Az eljárás végén a bal kamra középső harmadából keresztmetszeteket készítettünk, amelyeket legalább 48 órán át formalinban tároltunk. Az apoptózist a terminális dezoxinukleotidiltranszferáz-mediált dUTP nick-end jelölés (TUNEL; DNS-fragmentáció, Oncor, Gaithersburg, Md) festésével határoztuk meg. A részletes protokollt máshol publikáltuk.13 A peri-infarktus területét az infarktust határoló zónaként definiáltuk, ahol az életképes szívizomzat uralkodott.13 Az apoptotikus arányt az apoptotikus kardiomiociták számaként fejeztük ki az összes kardiomiocitára vetített apoptotikus kardiomiociták számaként mezőnként. A sejttípus dokumentálására TUNEL és izomaktin (előhígított anti-egér α-szarkomerikus aktin antitest, Invitrogen, San Francisco, Calif) festést végeztünk. Elsősorban a kardiomiociták apoptózisát vettük figyelembe, de mértük az apoptózist a granulációs szövetben (aktin-negatív mononukleáris sejtek) is az infarktus területein.

A leukociták számát a myocardiumban a CD45+ sejtek számaként mértük 1 mm2 -re vetítve (anti-mouse CD45 ellenanyaggal, 1:100 hígítás, Southern Biotech, Birmingham, Ala), és összehasonlítottuk az anakinra- és a sóoldattal kezelt AMI egerek között. Az apoptotikus arányt a peri-infarktus régióiban 10 véletlenszerű mezőben számoltuk ki, amelyek szinte a teljes peri-infarktus területet lefedik. A sejtszámlálást végző vizsgálók nem voltak tisztában a kezelés allokációjával.

Mértük a miokardiális fibrózist az AMI után 7 nappal az egerekben, hogy megvizsgáljuk, hogy az azonnali anakinra-kezelés összefüggésbe hozható-e az infarktus gyógyulásának károsodásával. A szívmetszeteket Masson trikrómfestékkel (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) festettük meg. Röviden, a metszeteket egy éjszakán át Bouin-oldatban pácoltuk, majd folyó csapvízzel mostuk a sárga szín eltávolítása érdekében. A metszeteket Mayer-féle hematoxilinnal, Biebrich-féle skarlátos fukszinnal, működő foszfotungstic/foszfomolibdinsav oldattal és anilin-kékkel festettük meg egyenként 5 percre, majd 2 percre 1%-os ecetsavba helyeztük. A metszeteket leöblítettük, alkohollal dehidratáltuk, xilolban tisztítottuk és montíroztuk. A citoplazma és az izomrostok vörös színűek, a kollagén és a sejtmagok kék színűek. A fibrózis és a teljes bal kamra területét számítógépes morfometriával határoztuk meg egy BIOQUANT képalkotó szoftver segítségével, és az arányt a hegterület kiszámításához használtuk, a bal kamra százalékában kifejezve. A peri-infarktus területén a fibrózis és az életképes szívizomzat arányát (intersticiális fibrózis) számítógépes morfometriával határoztuk meg ×20-as nagyítással, és a felület százalékában fejeztük ki. Von Kossa-festést (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Calif) használtunk a (pre)nekrotikus szívizomzat kalciumlerakódásainak kimutatására.

Citokinszintek

Kilenc patkányból (4 anakinrával és 5 normál sóoldattal kezelt patkányból) a halál időpontjában teljes vért vettek nátrium-citrát csövekbe, és azonnal 1000 g-nél 4°C-on 10 percig centrifugálták. A felülúszót összegyűjtöttük és 0,22 μm-es szűrőn átszűrtük. A mintákat ezt követően -20°C-on tároltuk, majd később elemeztük. Egy multiplex citokin gyöngysoros rendszert (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, Calif) használtunk a gyártó utasításai szerint az IL-1β, tumor nekrózis faktor-α, IL-6 és interferon-γ keringő szintjének meghatározására. A reakcióelegyet a Bio-Plex protein array olvasóval olvastuk le, és az adatokat a Bio-Plex Manager szoftverprogrammal elemeztük.

MMP-szintézis

Az MMP-9-et, vagy zselatináz B-t választottuk prototípusos metalloproteináznak, amely AMI után felszabályozódik, és összefüggésbe hozható a káros remodellinggel.14,15 A teljes oldható fehérjét 6 egér (3 anakinrával és 3 sóoldattal kezelt) infarktus és periinfarktus myocardiumából extraháltuk 7 nappal a koszorúér-ligatiót követően, 20 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA és 1 mmol/L EGTA pufferrel. A homogenátumot 14 000 g-nél 10 percig 4°C-on centrifugáltuk, és a felülúszót visszanyertük. Ezután minden mintából 50 μg fehérjét 7,5%-os akrilamid géllel elválasztottuk, nitrocellulóz membránra vittük, majd 5% zsírmentes száraz tejjel blokkoltuk Tris-pufferelt sóoldatban Tween-20 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L NaCl és 0,1% Tween 20) 1 órán keresztül. A membránt ezután kecske poliklonális primer antitesttel inkubáltuk 1:1000 hígításban az MMP-9-re (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) 16 órán keresztül 4°C-on, majd mostuk és inkubáltuk antinyúl torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel (1:2000; Amersham Biosciences, Inc, Piscataway, NJ) 1 órán keresztül. A blotokat kemilumineszcens rendszerrel fejlesztettük. Két sáv volt látható, amelyek a pro-MMP-9-nek és az aktív MMP-9-nek feleltek meg. A méréshez csak az MMP-9 aktív sávját (105 kDa) választottuk ki. Az egyes sávok optikai sűrűségét letapogattuk és denzitometriával számszerűsítettük, és az aktív MMP-9 és a β-aktin arányaként fejeztük ki.

Az Anakinra in vitro antiapoptotikus hatása

A kamrai kardiomiocitákat patkányból izoláltuk a korábban leírtak szerint módosított enzimatikus technikával.16 Röviden, a patkányt pentobarbitál-nátriummal (100 mg/kg IP) altattuk, és a szívet gyorsan eltávolítottuk a mellkasból. 3 percen belül az aortanyílást Langendorff perfúziós rendszerre kanüláltuk, és a szívet retrográd módon perfundáltuk. Az enzimatikus emésztést a II. típusú kollagenáz (egyenként 0,5 mg/ml; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) és a XIV. típusú proteáz (0,02 mg/ml) perfúziós pufferhez történő hozzáadásával kezdtük meg, és ≈15 percig folytattuk. Ezután 50 μmol/L Ca2+-t adtunk az enzimoldathoz, hogy a szívet további 10-15 percig perfundáljuk. Az emésztett kamraszövetet darabokra vágtuk, és a sejtdiszszociáció megkönnyítése érdekében transzferpipettával óvatosan leszívtuk. A sejtpelletet reszuszpendáltuk a 3 lépéses Ca2+ helyreállítási eljáráshoz (azaz 125, 250 és 500 μmol/L Ca2+). A frissen izolált kardiomiocitákat ezután minimális esszenciális tápfolyadékban (katalógusszám: M1018, pH 7,35-7,45, Sigma) szuszpendáltuk. A sejteket ezután 35 mm-es sejttenyésztő edényekre ültettük, amelyeket 1 órán keresztül 20 μg/ml egér lamininnel vontunk be foszfát-pufferelt sóoldatban, 1%-os penicillin-streptomicinnel. A kardiomiocitákat 5% CO2 jelenlétében 1 órán át 37°C-on, párásított inkubátorban tenyésztettük, ami lehetővé tette a kardiomiocitáknak, hogy a kísérleti protokoll előtt a tál felületéhez kapcsolódjanak. A kardiomiocitákat ezután 40 percig szimulált iszkémiának vetettük alá úgy, hogy a sejtközeget “iszkémiás pufferrel” helyettesítettük, amely 118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3, 1,0 mmol/L NaH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L nátrium-laktát, 16 mmol/L KCl és 10 mmol/L 2-deoxiglükóz (pH 6,2-re állítva). Ezenkívül a sejteket hipoxiás körülmények között inkubáltuk 37°C-on a teljes szimulált iszkémiai időszak alatt, a tri-gáz inkubátorban 1% és 2% O2 és 5% CO2 közötti értékre állítva. 40 perc elteltével reperfúziót szimuláltunk úgy, hogy az iszkémiás puffert normoxikus körülmények között normál közegre cseréltük. Ezzel egyidejűleg anakinrát adtunk a lemezhez növekvő (×100) koncentrációban, 25×10-16g/ml koncentrációtól kezdve egészen 25×10-6g/ml koncentrációig (n=3 csoportonként). Ugyanilyen mennyiségű normál tápfolyadékot adtunk 3 lemezhez, amelyek kontrollként szolgáltak. A lemezeket 18 órán át inkubáltuk. A kardiomiocita apoptózist TUNEL festéssel elemeztük a BD Biosciences-től (San Jose, Calif) vásárolt készlettel, amely fluoreszcens teszttel mutatja ki a nukleáris DNS-fragmentációt. Röviden, 40 perc szimulált iszkémia és 18 óra reperfúzió után a 2 kamrás tárgylemezeken lévő sejteket 4%-os formaldehiddel/foszfát-pufferelt sóoldattal 4°C-on 25 percig fixáltuk, majd a gyártó protokollja szerint TUNEL-vizsgálatnak vetettük alá. A tárgylemezeket ezután 4,6-diamidino-2-fenilindolt tartalmazó Vectashield rögzítőközeggel ellenfestettük (DNS-interkaláló festék a rögzített sejtek sejtmagjainak láthatóvá tételére; katalógusszám: H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, Calif). A festett sejteket Olympus IX70 fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáltuk (Olympus Inc, Center Valley, Pa).

Anakinra felvétele In Vitro

AHL-1 sejteket, egy egér szívizomsejtvonalat, amely megtartja a felnőtt kardiomiociták fenotípusos jellemzőit, konfluenciáig növesztettük Claycomb médiumban (Sigma Chemical Co), amelyet 10% FCS-vel (JHR Bioscience, Ltd, Andover, Hampshire, UK) és noradrenalin 0.1 mmol/l (Sigma Chemical Co) zselatinnal/fibronectinnel bevont 22 mm-es üveg fedőlapokon, amelyeket 35 mm-es Petri-csészék aljára helyeztünk.17 Ezután FITC-konjugált anakinrát (10 μg/mL) adtunk a sejtekhez, majd a sejteket 37°C-on inkubáltuk normoxikus vagy hipoxikus (2% oxigén) körülmények között Micro galaxy, RS Biotech inkubátorban 5 órán keresztül. Ezután a sejteket kétszer mostuk 10% FCS-t tartalmazó Hanks sóoldattal. A sejtmagokat Hoechst ellenfestéssel ellenfestettük, és a megfigyeléseket Leica DM 2000 fluoreszcens mikroszkóppal (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex) végeztük.

Kaszpáz-1 és -9 aktivitás vizsgálatok

A kaszpáz-1 és -9 aktivitás anakinra általi gátlását a kereskedelmi assay kitekkel (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) segítségével, rekombináns humán kaszpáz-1 és YVAD-AMC, a pro-Il-1β hasadási helyén található YVHD szekvencia variációja, mint fluorogén szubsztrát a kaszpáz-1 esetében és Ac-LEHD-AMC a kaszpáz-9 esetében. A kísérletet 22°C-on végeztük fluorometriás lemezolvasóval (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) kinetikus üzemmódban, 390 és 460 nm-es gerjesztési és emissziós hullámhosszúsággal. A szubsztrát kiindulási koncentrációja 11,5 μmol/L volt (ami megfelel a kaszpáz-1 Km-jének), majd 37,5 μmol/L-re növeltük a kompetitív és nem kompetitív gátlás vizsgálatához.18 Az anakinra esetében 100 nmol/L kezdő dózist választottunk 10 μg/mL poliklonális anti-IL-1Ra blokkoló antitest (R&D Systems, Minneapolis, Minn) jelenlétében vagy hiányában, majd 300 és 900 nmol/L-re növeltük a dózis-válasz görbe értékeléséhez. A vakból történő korrekciókat elvégeztük, és a görbéket 0,0 metszéspontra illesztettük, mivel az aktivitást 0 időpontban 0-nak feltételeztük. Regressziós meredekségeket (r>0,95) kapunk minden kísérlethez minden egyes dózisnál, és az együtthatókat összehasonlítjuk a 3 csoport között (anakinra, kontroll, anakinra plusz blokkoló antitest). A kísérleteket minden csoport esetében három példányban végeztük, és a görbéket minden minta esetében legalább 5 alkalommal futtattuk le. A valószínűségi érték a csoportok közötti 1-utas ANOVA-t tükrözi, 2 oldalú post-hoc Dunnett-teszttel, amely az egyes csoportokat az anakinra-val hasonlítja össze.

Az anakinra és a kaszpáz-1 és -9 közötti fizikai kölcsönhatást és kötődést koimmunoprecipitációval vizsgáltuk. Az anakinrát (1 μg) kereskedelmi forgalomban kapható rekombináns humán kaszpáz-1 és -9 (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) inkubáltuk 1 órán keresztül 4°C-on. Az elegyet ezután kicsapattuk úgy, hogy 2 különböző szett Sepharose gyöngyhöz adtuk, amelyekhez anti-IL-1Ra (Santa Cruz) vagy anti-kaszpáz-1 antitestet (Santa Cruz) kapcsoltunk. A szefarózhoz kötött frakciókat SDS pufferben főztük és SDS-PAGE-on választottuk szét. Az egyes beállításokban koprecipitált fehérjéket ezután immunoblotoltuk és Western blot segítségével elemeztük. Anti-IL-1Ra és anti-kaszpáz-1 vagy -9 antitesteket használtunk az anakinra, illetve a kaszpáz-1 immunreaktivitásának kimutatására a koprecipitátumban. Ha nem keletkezett koprecipitátum, akkor a Western blot során egyetlen sávot vártunk, amely a Sepharose-gyöngyökhöz kötött antitesttel azonos típusú oldható antitestnek felel meg (azaz az IL-1Ra immunfestése az IL-1Ra-hoz kötött Sepharose-gyöngyökkel végzett kicsapási vizsgálatban). Ha koprecipitáció történt volna, akkor mindkét oldható antitest esetében kettős sáv jelenlétét vártuk volna mindkét kicsapási próbában (összesen 4 sáv). Az Anakinra és a kaszpáz-1 vagy -9 további sorokban futott a Western blotban, és pozitív kontrollként használtuk őket.

Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzést az SPSS 11.0 csomaggal végeztük Windowshoz (SPSS Inc, Chicago, Ill). A folytonos változókat átlagban és SE-ben fejeztük ki. Egyirányú ANOVA-t használtunk a több (>2) csoport közötti átlagok összehasonlítására, a post hoc 2 oldalú Dunnett-teszttel, hogy kifejezetten az egyes csoportokban lévő kontrollokkal hasonlítsuk össze az alanyok közötti hatásokat. A nem párosított adatokra vonatkozó t-tesztet csak a 2 csoport közötti átlagok összehasonlítására használtuk. Az ismételt mérések véletlenszerű hatású ANOVA-ját használtuk a beavatkozás előtti és utáni echokardiográfiai paraméterek összehasonlítására a 4 különböző csoport között, a post hoc 2 oldalú Dunnett-teszttel, hogy kifejezetten az alanyok közötti hatásokat hasonlítsuk össze (anakinra és sóoldatos AMI csoportok). A 2 folytonos változó közötti korrelációkat Pearson-teszttel értékeltük. Kaplan-Meier túlélési görbéket készítettünk, és a log-rank tesztet használtuk a csoportok közötti szignifikáns különbségek értékelésére. A túlélési arányokat a Fisher-féle egzakt teszttel is összehasonlították. A statisztikai szignifikancia 0,05-ös szinten meghatározott statisztikai szignifikanciával.

A szerzőknek teljes hozzáférésük volt az adatokhoz, és teljes felelősséget vállalnak azok integritásáért. Minden szerző elolvasta és elfogadja a kéziratot a leírt formában.

Eredmények

A vizsgálat az anakinra in vivo (egér és patkány koszorúér ligációs modellben) és in vitro (primer patkány kardiomiocita tenyészetben, HL-1 kardiomiocita tenyészetben és izolált kaszpáz-1-ben) hatásainak értékelésére terjedt ki.

Az Anakinra in vivo alkalmazása

Túlélés

Huszonnyolc egeret 24 órán belül elaltattak az infarktus méretének felmérése céljából. Hat egeret 7 napon belül elaltattak az MMP-9 expressziójának elemzése céljából; ezek az egerek nem vettek részt a túlélési elemzésben. A koszorúér-lekötés után 7 nappal az anakinrával kezelt 16 egérből 15 (94%) élt, míg a sóoldattal kezelt 20 egérből 11 (55%) (P=0,013, Kaplan-Meier log-rank teszt; P=0,021, Fisher pontos teszt). Hasonlóképpen, az anakinrával kezelt 4 patkányból 4 (100%) életben maradt, míg a sóoldattal kezelt 8 patkányból csak 5 (62%). A látszatműtött egerek (n=8) és patkányok (n=8) mindegyike életben volt 7 napon belül.

Infarktus mérete

A sóoldattal kezelt egerek és az 1 és 10 mg/kg anakinra adaggal kezelt egerek között nem találtunk szignifikáns különbséget a kockázati terület és az infarktus területe (kockázati területre jutó infarktus területként kifejezve) tekintetében; azonban az anakinra 100 mg/kg adagja az infarktus méretének szerény, de jelentős (13%-os) csökkenésével járt (P=0,015 a sóoldattal szemben; 1. ábra).

Apoptózis

Anakinra alkalmazása a kardiomiomiocita apoptózis jelentős csökkenésével járt a peri-infarktus myocardiumában mind az azonnali, mind a késleltetett kezelési csoportban (3,1±0,2% versus 0,5±0,3%, P<0,001; és 4,2±0,4% versus 1,1±0,2%, P<0,001, illetve; 2. ábra). Az apoptotikus arány a peri-infarktus myocardiumban közvetlenül korrelált a kedvezőtlen remodelling jeleivel, mint például az LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), elülső fal diasztolés vastagsága (r=-0,50, P=0,012) és elülső fal szisztolés vastagsága (r=-0,50, P=0,012). A távoli myocardiumban az apoptotikus ráta vagy nem volt kimutatható, vagy nagyon alacsony volt, és nem volt szignifikáns különbség az AMI-s állatok (0,03±0,03%) és a látszatműtött állatok (0,01±0,01%), valamint az anakinra-kezelt (0,02±0,02%) és a sóoldattal kezelt (0,03±0,03%) állatok között (P>0,05 minden elemzésnél).

Myocardialis fibrózis és kalciumlerakódások

A myocardialis fibrózisban (hegképződés, a bal kamra százalékában kifejezve) nem találtunk különbséget az anakinra- és a sóoldattal kezelt egerek között (31±2% versus 33±2%; P=0,81; 1. ábra). Az intersticiális fibrózis a peri-infarktus területén minimális volt a sham-operált egerekben (<0,1%), de gyakoribb volt az anakinra- és a sóoldattal kezelt egerekben, anélkül, hogy szignifikáns különbség lett volna a csoportok között (13±2% versus 15±3%; P=0,58; 1. ábra). Az AMI után 1 héttel von Kossa-festéssel minimális mennyiségű myocardialis kalciumlerakódást találtunk (<0,1%), az anakinra- és a sóoldattal kezelt egerek közötti különbség nélkül.

LV remodelling and Function

A beavatkozás előtti LVEDD és LVESD értékek hasonlóak voltak minden egér- és patkánycsoportban. A sóoldattal kezelt egerekben az LVEDD és az LVESD szignifikáns növekedése, valamint az elülső fal diasztolés vastagságának, az elülső fal szisztolés vastagságának és az FS-nek a csökkenése volt megfigyelhető (a kiindulási értékhez és a látszatértékhez képest ) a 7. napon (3. ábra). A sóoldattal kezelt egerekhez képest az anakinrával kezelt AMI egereknél szignifikánsan kisebb volt az LVEDD és LVESD növekedése és az FS csökkenése a 7. napon a kiindulási értékhez képest. Az elülső fal szisztolés vastagságának csökkenése szintén kisebb volt az anakinra-kezelt egerekben (a sóoldattal kezelt állatokhoz képest), ami védőhatást mutat a peri-infarktus régiójában, míg a hátsó fal diasztolés vastagságában (0,96±0,08 versus 0,78±0,11; P=0,86) és a hátsó fal szisztolés vastagságában (1,32±0,08 versus 1,14±0,12; P=0,44) nem találtunk jelentős különbséget. Az Anakinra-kezelt egerek izovolumetrikus kontrakciós ideje (6±4 versus 16±5 ms; P=0,022) és izovolumetrikus relaxációs ideje (12±5 versus 29±8 ms; P=0,042) is rövidebb volt, és ennek következtében alacsonyabb volt a Tei-index (amely a szívizom teljesítményét tükrözi) (0,28±0,03 versus 0,66±0,07; P=0,044; 3. ábra). Az FS/Tei index, amely még szorosabban korrelál a dP/dt invazív méréseivel,19 szintén szignifikánsan magasabb volt az anakinra kezelt (0,74±0,06 versus sóoldattal kezelt 0,17±0,02; P=0,008) AMI egerekben. Nem találtunk különbséget a sóoldattal és anakinrával kezelt, látszatműtött egerek között (3. ábra).

A patkánymodellben hasonló hatást tapasztaltunk az LVEDD-re és az LVESD-re (4. ábra). Az LVEDD és az LVESD átlagos százalékos növekedése szignifikánsan nagyobb volt az egerekben, mint a patkányokban, függetlenül a kezelési kartól (P<0,001). Az LVEDD és LVESD változások abszolút csökkenése anakinra alkalmazásával szignifikánsan nagyobb volt egerekben, mint patkányokban (P<0,001); azonban az LVEDD és LVESD változások százalékos csökkenése hasonló volt egerekben (56±6% és 53±5%, illetve) és patkányokban (68±7% és 47±4%; P=0,66 és P=0,32, illetve), ami az azonnali és késleltetett anakinra beadás hasonló hatását mutatja.

Leukocita beszivárgás

Az infarktus területén az 1 mm2 myocardiumra jutó leukociták számában nem találtunk különbséget az anakinrával és sóoldattal kezelt AMI-egerek között (4. ábra). Az apoptózis aránya a granulációs szövetben 1 héttel az AMI után hasonló volt az anakinra- és a sóoldattal kezelt egerekben (4. ábra). A leukociták gyakorlatilag hiányoztak a távoli szívizomrégiókban és a látszatoperált állatokban.

Citokinszintek

Nem találtunk szignifikáns különbségeket az IL-1β, IL-6, tumor nekrózis faktor-α és interferon-γ plazmaszintekben (4. ábra).

MMP-aktivitás

Az aktív MMP-9 gyakorlatilag nem volt kimutatható a látszatműtött állatokban, míg az AMI-s egerekben 7 nappal a műtét után következetesen kimutatható volt. Az aktív MMP-9 szintjében nem találtunk különbséget a sóoldattal és az anakinrával kezelt AMI egerek között (4. ábra).

In Vitro Anakinra adása

Apoptózis

A kardiomiociták anakinrával történő inkubálása (2. kép).5×10-12 g/ml) a “szimulált reperfúzió” idején (40 perc “szimulált iszkémia” után) az apoptózis jelentős, 36%-os csökkenésével járt (11,2±0,5% versus 17,5±0,1% a kontrollban). Az anakinra növekvő (×100) koncentrációja 25×10-6 g/ml-ig nem mutatott további apoptóziscsökkenést, míg a 25×10-12 g/ml alatti koncentráció nem volt hatással az apoptózisra (5. ábra).

Az anakinra fokozott sejtfelvétele hipoxia alatt

A normoxiához képest az anakinra felvétele hipoxia alatt szignifikánsan megnövekedett, és a sejtek ≈95%-ában volt kimutatható hipoxia alatt (szemben a normoxia alatti 35%-kal; P=0,048; 6. ábra).

A kaszpáz-1 és -9 aktivitás gátlása

In vitro az anakinra (100-900 nmol/L) szignifikánsan ≈50%-kal gátolta a kaszpáz-1 és -9 aktivitást (P<0,001 minden koncentrációérték esetében a kontrollhoz képest), a különböző koncentrációk között nem volt különbség. Az anakinra a kaszpáz-1 (Ki, 0,201 μmol/L; Kic, 0,239 μmol/L; Kuc, 0,231 μmol/L) és a kaszpáz-9 (Ki, 0,31 μmol/L; Kic, 0,34 μmol/L; és Kuc, 0,28 μmol/L) esetében vegyes kompetitív és nem kompetitív enzimgátlóként viselkedett. IL-1Ra-blokkoló antitestek hozzáadása visszafordította az anakinra által okozott kaszpáz-1 és -9 gátlást (7. ábra). A koprecipitációs vizsgálat megerősítette az anakinra és a kaszpáz-1 és -9 közötti fizikai kölcsönhatást és kötődést (7. ábra).

Diszkusszió

Ez a tanulmány mutatja be először, hogy az AMI első 24 órájában adott exogén rekombináns humán IL-1Ra anakinra jelentősen javítja a szív remodellinget a szívizomsejtek apoptózisának csökkentése révén az infarktussal kapcsolatos tartós artériaelzáródás 2 különböző állatmodelljében, és hogy az anakinra in vitro közvetlen antiapoptotikus hatást fejt ki a szívizomsejtekre.

Az IL-1Ra biológiája

Az IL-1Ra akut fázisú reaktánsnak tekinthető3,4. Jelenleg nem világos az endogén IL-1Ra szerepe a gyulladásban. Az IL-1Ra az IL-1 receptorhoz kötődik, ezért kompetitív gátlója az IL-1 aktivitásának, potenciálisan gyulladásgátlóként viselkedik.3 Mivel azonban az IL-1 nagyobb affinitással kötődik a receptorához, és a receptorok feleslegben vannak (tartalék receptor hatás), az endogén agonista szerepe korlátozottnak tűnik.3 Az IL-1Ra gén biológiailag jól megőrződött, és fajok közötti különbségekről nem számoltak be. Ebben a vizsgálatban a 2 leggyakoribb rágcsálófajt vizsgáltuk, és hasonló hatásokról számoltunk be.

IL-1Ra az AMI-ban

Az IL-1Ra szintje jelentősen megemelkedik a myocardialis ischaemia-reperfúziót követően.7 Szintje korán emelkedik az ST-szegment-elevációval járó AMI-val jelentkező betegeknél,5 és minél nagyobb a veszélyeztetett myocardium területe, annál nagyobb az IL-1Ra szintjének emelkedése.6 Sőt, megfigyeléses vizsgálatokban az akut koronária-szindrómában szenvedő betegek magasabb IL-1Ra-szintje kedvezőtlen kimenetelhez társult.20,21 Hogy az IL-1Ra a károsodás markerét, a gyulladáscsökkentő aktivitással történő kardioprotekcióra tett kísérletet vagy a károsodás mediátorát jelenti-e, továbbra sem tisztázott. Az IL-1Ra overexpressziója a globális iszkémia-reperfúzió patkánymodelljében először mutatta ki az IL-1Ra kardioprotektív hatását, amely a kardiomiomiocita apoptózis megközelítőleg 50%-os csökkenését eredményezte8 .

Exogén IL-1Ra

A rekombináns humán IL-1Ra (anakinra) kereskedelmi forgalomban kapható (az Amgen által gyártott), az Élelmiszer- és Gyógyszerhatóság által engedélyezett, és nagyszámú betegnél alkalmazzák a rheumatoid arthritis kezelésére.22-24 Az IL-1 szerepe a rheumatoid arthritis patogenezisében központi szerepet játszik. Az anakinra szisztémás adagolása biztonságosnak és hatékonynak bizonyult reumatoid artritiszes betegeknél, ami a betegség aktivitásának módosításához vezet. Az anakinra klinikai vizsgálata akut koszorúér-szindrómában szenvedő betegeknél folyamatban van, de az eredmények még nem állnak rendelkezésre.25 Egy nemrégiben közzétett II. fázisú vizsgálatban 17 ischaemiás stroke-ban szenvedő beteget kezeltek anakinrával, amelyet 100 mg-os bólus formájában, majd 72 órás infúzióban adtak be; a másik 17 beteg megfelelő placebót kapott.26 Az anakinra nem mutatott gyógyszerrel kapcsolatos mellékhatásokat, és egy másodlagos elemzés szerint több olyan beteghez társult, akiknél a stroke-hoz kapcsolódó rokkantság minimális volt vagy nem volt. Kísérletes állati stroke-modellekben az anakinra csökkent apoptózissal, csökkent gyulladással és jobb viselkedési eredménnyel járt.27,28

Hatásmechanizmus

A pontos mechanizmus, amellyel az anakinra kifejti kedvező hatásait, nem teljesen világos. Az elfogadott nézet szerint a nagy dózisban beadott anakinra versenyez az IL-1-gyel és csökkenti az IL-1 aktivitását. Az anakinra az I-es típusú IL-1 receptorhoz kötődik, de megakadályozza az intracelluláris jel transzdukcióját azáltal, hogy megakadályozza az IL-1 receptor és az IL-1 segédfehérje közötti kölcsönhatást. Kimutatták, hogy az IL-1Ra csökkenti az IL-1-függő prosztaglandin-E2-szekréciót, amely közvetlenül felelős lehet a sejttoxicitásért és az apoptózisért.3,29 Hogy az anakinra a főként gyulladásos sejtekből származó IL-1-gyel, vagy a parakrin vagy autokrin módon lokálisan felszabaduló IL-1-gyel avatkozik-e be, és hogy az IL-1-receptorral való kölcsönhatásától függetlenül közvetlenül hat-e a sejtre, továbbra sem világos. Az IL-1Ra intracelluláris hatása független az IL-1 intracelluláris jelátviteli útvonalától,30 és leírták az IL-1Ra transzmembrán aktív transzportját a P2X7 purinerg csatorna receptorán keresztül.31 Az in vitro megfigyelt hatások, ahol csak kardiomiocitákat tenyésztettek, arra utalnak, hogy az anakinra szívizomra gyakorolt hatása legalábbis részben független a gyulladásos infiltrátum jelenlététől. Ennek megfelelően ebben a kísérleti modellben nem találtuk az anakinra hatását a keringő citokinszintekre, a szívizom leukocita-infiltrátumára vagy az MMP-9 aktivitására. Az IL-1Ra antiapoptotikus hatásairól már beszámoltak neuronokban és hámsejtekben.32,33 Ezek a hatások in vivo és in vitro is nyilvánvalóak, ami az IL-1Ra parakrin vagy autokrin hatására utal.32,33 Itt az anakinra iszkémiás sejtfelvételéről, az anakinra és a kaszpáz-1 és -9 közötti kötődésről, valamint a kaszpáz-1 és -9 aktivitás anakinra általi jelentős gátlásáról számolunk be. Az in vitro kapott adatok, bár a modellek inherens korlátai miatt csak hipotéziseket generálnak az in vivo történésekkel kapcsolatban, arra utalnak, hogy az anakinra hatására emelkedik a hipoxia által kiváltott apoptózis küszöbértéke.

Mutatjuk, hogy az anakinra korai (azonnali) vagy késleltetett (24 órával későbbi) adása csökkenti az apoptózist és megelőzi a szív tágulását AMI után. Az apoptózist gátló és a tágulást megelőző dózisban (1 mg/kg) az anakinra korai adagolás esetén nem volt hatással az infarktus méretére, és az AMI után 24 órával beadott anakinra esetén hasonló előnyök mutatkoznak a remodellingben, ami összhangban van a szív remodellingre gyakorolt, az infarktus kímélésétől független hatással. Figyelemre méltó, hogy az IL-1Ra kedvező hatásai az állati stroke-modellekben szintén, legalábbis részben, időfüggetlenek.34 Azonban, amint azt a stroke-irodalomban már megjegyezték, az anakinra 100-szor nagyobb dózisával infarktuskímélő hatást figyeltek meg. Hogy az infarktus méretének kis mértékű, de jelentős csökkenése magasabb dózisok esetén klinikailag releváns előnyre vezetne-e a szívelégtelenség vagy a túlélés szempontjából, nem ismert, és további vizsgálatokat igényel.

Az IL-1Ra kezelés optimális időtartama AMI után nem ismert. Az érfal sérülésre adott válaszának modelljében a 28 napig adott IL-1Ra nagyobb hatással járt, mint a 14 napig adott IL-1Ra.35 Megjegyzendő, hogy az IL-1Ra kezelés abbahagyása után nem találtak rebound hatást.35

A kaszpázok szerepe az iszkémiában és a szívelégtelenségben

A kaszpázok az apoptotikus és gyulladásos kaszkádban részt vevő proteázok.36-40 A kaszpáz-3 az apoptotikus kaszkád központi mediátora, amely a DNS-fragmentációért és a citoszkeleton strukturális fehérjéinek hasításáért felelős másodlagos effektorok downstream aktiválásához vezet. A kaszpáz-1, más néven interleukin-1-konvertáló enzim, proinflammatorikus kaszpáznak tekinthető, mivel többek között a pro-IL-1β-t IL-1β-vé alakítja át. A kaszpáz-1 azonban egyike azoknak az enzimeknek is, amelyek hasítják a pro-kaszpáz-3-at, ami annak aktiválásához vezet.36-40 Valójában a kaszpáz-3 általában más kaszpázok, például a mitokondriális útvonalban központi szerepet játszó kaszpáz-9, a kaszpáz-8, amely főként a receptorok által közvetített apoptózisban vesz részt, és a kaszpáz-1 hasításából aktiválódik. Kísérletes vizsgálatok kimutatták, hogy a kaszpáz-1 aktivitásának gátlása az IL-1 szintjétől függetlenül csökkent apoptózissal és kedvezőbb remodellációval jár AMI után.38,39 Tekintettel arra, hogy az IL-1 a kaszpáz-1 szubsztrátja, megvizsgáltuk, hogy az IL-1Ra a kaszpáz-1 közvetlen intracelluláris gátlásával gyakorolhatja-e kedvező hatását.40 Ennek megfelelően először írtuk le, hogy az anakinra in vitro kötődik a kaszpáz-1-hez és jelentősen gátolja annak aktivitását. A kaszpáz-1 anakinra általi közvetlen gátlása legalábbis részben felelős lehet gyulladáscsökkentő és antiapoptotikus hatásaiért. Az anakinra azonban a kaszpáz-1 aktivitására gyakorolt közvetett hatásból eredő antiapoptotikus hatása is lehet a kaszpáz-1 sejtmagba történő transzlokációjának megakadályozása és ezáltal az apoptózis gátlása révén41 vagy a kaszpáz-9 gátlásán keresztül. A kaszpáz-9 a mitokondriális útvonal kulcsfontosságú közvetítője, amely hipoxia/ischaemia során az apoptózis aktiválásához vezet.37 Hogy a kaszpáz-1 vagy a -9 gátlása játszik-e nagyobb szerepet az anakinra által megfigyelt előnyökben, még tisztázásra vár. Az ebben a vizsgálatban vizsgált dózisban az anakinra valószínűleg mindkét kaszpázra hasonló gátló hatást fejtett ki, és az apoptotikus kaszkádban a különböző kaszpázok közötti keresztkapcsolatról már beszámoltak36.-41

Az Anakinra farmakokinetikája és a dózis-hatás-válasz

Egy 25 egészséges önkéntes bevonásával végzett I. fázisú vizsgálatban az anakinra egyszeri adagja az ebben a vizsgálatban alkalmazotthoz hasonló dózisban (1 mg/kg) intravénásan beadva 3,1 μg/ml plazmaszintet és 2,64 órás felezési időt eredményezett.42 In vivo nem találtunk jelentős hatást az infarktus méretére az ajánlott dózisnál legfeljebb 10-szer nagyobb dózisú anakinra alkalmazásával, de a 100-szor nagyobb dózis alkalmazásával az infarktus méretének kismértékű, de jelentős csökkenését tapasztaltuk. Az, hogy ez a nagy dózissal járó infarktus-kímélő hatás kedvező hosszú távú kimenetelt eredményez-e, bizonytalan, és további vizsgálatokat igényel. In vivo az emberekben megfigyelt plazma csúcsszintnél >106-kal alacsonyabb koncentráció az apoptózis jelentős csökkenésével járt együtt. Az alacsonyabb dózisok nem voltak hatékonyak, míg a magasabb dózisok nem mutattak additív hatást. Ezek az adatok összhangban vannak az anakinra klinikai profiljával, amelyben általában 1 mg/kg-os standard dózist alkalmaznak, és a nagyobb dózisok több helyi mellékhatással járnak, jelentős további klinikai előny nélkül.22-24 Egy nemrégiben végzett vizsgálatban43 az anakinra 100 mg-os (bruttó 1 mg/kg-nak megfelelő) adagját a hasnyálmirigy β-sejt apoptózisának gátlására használták, és kimutatták, hogy jól tolerálható, és a placebóhoz képest jobb β-sejtfunkciót mutató indexekkel társult, anélkül, hogy befolyásolta volna az inzulinérzékenységet.

Ischaemia, apoptózis és szívelégtelenség AMI után

Az apoptózis és a remodelling közötti összefüggés megállapítása alátámasztja az apoptózisnak mint a szív remodelling központi közvetítőjének koncepcióját, függetlenül az infarktus méretétől.1,37,44 Az apoptózisra vagy a remodellingre gyakorolt hatásában az azonnali és a késleltetett kezelési stratégia közötti különbségek hiánya, valamint az infarktus méretére gyakorolt hatás hiánya az 1 mg/kg-os dózis esetében arra utal, hogy az anakinra specifikusan befolyásolja a szubakut posztinfarktus utáni remodellinget, amelyben az apoptózisnak közismerten nagy szerepe van,1,36,43 anélkül, hogy befolyásolná az infarktus gyógyulását, a mátrix degradációját és a fibrózist, vagy elősegítené a falrepedést.

Következtetések

Az anakinra alkalmazása az AMI-t követő 24 órán belül javítja az infarktus utáni remodellinget, miközben gátolja az apoptózist. A jelen vizsgálat korlátai ellenére (mint például a férfi nemre korlátozódó viszonylag kis mintanagyság, az érdeklődésre számot tartó kimenetelek egyszeri időbeli meghatározása, valamint az echokardiográfia alkalmazása, amely továbbra is szuboptimális és operátorfüggő módszer az LV remodelling és funkció értékelésére), az AMI-t követő 24 órán belül adott exogén IL-1Ra (anakinra) kedvező hatásának megállapításai új terápiás ablakot nyithatnak az ischaemiás károsodás és a remodelling kezelésére az ischaemiás szívelégtelenség megelőzése és kezelése érdekében.

Lábjegyzetek