Az antitest-mikrotáblák jelenlegi alkalmazásai
Az antitest-mikrotáblák egyedülálló képességeinek és a különböző orvosbiológiai projektekben való alkalmazhatóságának köszönhetően számos különböző antitest-mikrotáblát fejlesztettek ki, amelyek közül néhány már kereskedelmi forgalomban is kapható. Az alábbiakban összegyűjtöttünk néhányat az elmúlt 7 év reprezentatív vizsgálataiból (1. táblázat), és áttekintésünket a projektek fókuszától függően két részre osztottuk: alapbiológiai irányultságú vizsgálatokra és klinikai kutatásokra. Mivel továbbra is gyakorlatilag lehetetlen lefedni az antitest-mikroarray valamennyi közelmúltbeli alkalmazását, azokra az alkalmazásokra összpontosítunk, amelyeket nagy érdeklődésre tartunk számot, és fontos klinikai jelentőségű eredményekre.
Az alapkutatás
Szignálútvonalakkal kapcsolatos
A jelátviteli útvonalakban bekövetkező változások számos betegségre jellemzőek, beleértve a rákot , a cukorbetegséget és a neurodegeneratív rendellenességeket . Az érdeklődésre számot tartó jelátviteli kaszkádban lévő fehérjéket megcélzó befogadó reagenseket használó antitest tömbök létrehozása lehetővé tette a kutatók számára, hogy vizsgálják a fehérjeprofilok változásait és a jelátviteli utak módosításait a normális biológiai folyamatokban és a betegségekben. A kutatók ezt a koncepciót számos biológiai mintaanyagra és preparátumra alkalmazták, beleértve a sejtlizátumokat , a szövetkivonatokat és a plazmát .
A kalbindin-D28 k (CB), egy fontos kalciumkötő fehérje, amely kalciumpufferként működik, és alacsonyabb szinten fejeződik ki az Alzheimer-kórban szenvedő egerek és emberek agyában, de nem ismert, hogy ezek a változások hozzájárulnak-e az Alzheimer-kórral kapcsolatos működési zavarokhoz (AD). Kook és munkatársai CB-hiányos Alzheimer-kóros transzgenikus egeret (CBKOTg) hoztak létre, hogy megvizsgálják a CB hozzájárulását az AD jelátviteli útvonalaihoz . Az egér agyszövetének vizsgálatához antitest-mikrotáblákat használva jelentős változásokat azonosítottak a sejthalál útvonalaiban, a szinaptikus transzmisszióban és a MAPK jelátviteli útvonalakban a CB deléciója esetén. Ezeket az eredményeket immunhisztokémiával igazolták, amely megnövekedett apoptotikus markereket és fokozott neuronális pusztulást mutatott ki, bizonyítva, hogy az antitest-mikrosorozatok újszerű információkkal szolgálhatnak, amelyek javítják a CB szerepének és az AD patofiziológiájában betöltött szerepének megértését.
Az antitest-mikrosorozatok segítségével feltárták a magasan konzervált fehérjék, köztük a 4. elongációs faktor élettani szerepét. Gao és munkatársai a mitokondriális elongációs faktor 4 (mtEF4) minőség-ellenőrző faktor transzlációs mechanizmusát boncolták foszfo-explorer antitest mikroarray segítségével . Az mtEF4 knock-out és WT egerek hereszövetei közötti sejtlizátumokat összehasonlítva azt találták, hogy a különböző jelátviteli útvonalak közül az mTOR fold enrichmentje volt a legmagasabb. A szerzők kimutatták, hogy mtEF4 deléció esetén a szomatikus citoplazmából érkező fő visszacsatolási jel az mTOR felszabályozása. Ezt fokozott citoplazmatikus transzláció kísérte, ami arra utal, hogy az mTOR döntő szerepet játszik a mitokondriális transzlációs hiányt kompenzáló downstream effektorként . Továbbá a tanulmány összekapcsolta a mitokondriumban lévő mtEF4-függő minőségszabályozás és a citoplazmában lévő mTOR-útvonal közötti, korábban le nem írt keresztbeszélgetést.
Drogmechanizmus
Az antitest-mikroarray-próbák segítségével a kutatók szisztematikusan és hatékonyan vizsgálhatják a gyógyszermechanizmusokat. Számos lehetséges alkalmazás közül a tumor-indukált angiogenezist tanulmányozták, mivel ez kulcsfontosságú szerepet játszik a rák progressziójában . A P11-et, egy PDZ-kötő motívumot (Ser-Asp-Val) tartalmazó új peptid ligandumot, amely nagy affinitással rendelkezik az integrin αvββ3-hoz, egy hexapeptid könyvtárból (PS-SPCL) azonosították egy antitest microarray segítségével . A P11 farmakológiai mechanizmusát 48 rákhoz kapcsolódó antitestet tartalmazó, speciálisan tervezett farmakoproteomikai mikroarray megközelítéssel tisztáztuk . A vizsgálat kimutatta, hogy a P11 gátolja a bFGF által indukált humán köldökvénás endotélsejtek proliferációját a mitogén-aktivált protein kináz és az extracelluláris szignál szabályozott kináz gátlásán keresztül. Ezenkívül a microarray kimutatta, hogy a P11 az apoptotikus marker p53 felregulációját okozta, a kaszpázok rendszerének aktiválásán keresztül apoptózis indukciót eredményezett, ami azt jelzi, hogy a P11 kulcsszerepet játszhat a tumor progressziójának megelőzésében. A P11 és a p53 közötti kapcsolat bemutatása a klinikai és alapkutatók rákkutatók számára segít a P11 szerepének és gátló célpontjának további felderítésében.
A lovasztatint, az Aspergillus terreusból vagy a Monascus ruberből származó természetes terméket széles körben használják koleszterinszint-csökkentő gyógyszerként a klinikumban. Yang és munkatársai 656 antitestet tartalmazó, különböző funkcionális sejtútvonalakra fókuszáló antitest-mikroarray-t használtak, amely arra utalt, hogy a lovasztatin rákellenes tulajdonságokkal is rendelkezik, mégpedig kevéssé meghatározott mechanizmusokon keresztül. Nagy szükség van a hatékony rákellenes kezelések megtalálására és hatásmechanizmusuk megértésére. Egy microarray segítségével mellrákos sejteket vizsgáltak hipoxiás körülmények között, hogy megvizsgálják a molekuláris mechanizmusokat, amelyeken keresztül a Lovastin kifejti hatását. A kontrollhoz képest 17 felfelé szabályozott fehérjét és 20 lefelé szabályozott fehérjét mutattak ki a lovasztatinnal kezelt emlőráksejtek esetében, és az eredményeket ezt követően valós idejű PCR-rel validálták . A fehérje szignatúra tartalmazta az apoptózisban, a sejtproliferációban és a tumor metasztázisban szerepet játszó fehérjéket, összekapcsolva ezen útvonalak modulációját a lovasztin farmakológiai hatásával.
A 2-es típusú diabétesz gyógyszer, a metformin, szintén rákellenes tulajdonságokat javasolt. Lee és munkatársai a sejtciklussal kapcsolatos molekulák tanulmányozására épített antitest-mikroarray segítségével vizsgálták az új metformin-származékok hatásosságát. A szerzők kimutatták, hogy a metformin-butirát (MFB) jobb daganatellenes hatékonysággal rendelkezik, mint a metformin-HCl, a nagyobb neoplasztikus aktivitás és a sejtciklus-progresszió S és G2/M fázisok alatti károsításának jobb hatékonysága révén, amellett, hogy úgy tűnik, hogy preferenciális citotoxikus hatással van az emlőrák őssejtpopulációira . Ezek az eredmények rávilágítanak arra, hogy az antitest-táblázatok hogyan szolgáltathatnak proteomikai bizonyítékot a jobb hatékonyságú gyógyszerek fejlesztésének támogatására.
A biológiai alapkutatásokban az antitest-mikrotáblázatok a jelzőfehérjék és az adott fenotípushoz kapcsolódó fehérjék kimutatására szolgálhatnak. A párhuzamos fehérjeérzékeléssel rendelkező array-k lehetőséget teremtenek több jelátviteli útvonal vizsgálatára egyetlen kísérletben, betekintést nyújtva új mechanizmusokba, például a betegség progressziójának, a gyógyszerkölcsönhatásoknak és a fertőzésekre adott válasznak a vizsgálatába.
Klinikai kutatás
A klinikai minták fehérjeszintű elemzése lehetővé teszi a diagnosztikai markerek javítását és a kezelési lehetőségek irányítását. Mivel a fehérjék a sejtfolyamatok többségében részt vesznek, a fehérjeelemzés biológiai betegségszignatúrát adhat, részletes betekintést nyújtva egy sejt, szerv vagy rendszer aktuális állapotáról. Az antitest-mikroelemek valós idejű útmutatást nyújthatnak a biológiai folyamatok aktuális változásairól az egészség és a betegség során. Ebben a fejezetben azt mutatjuk be példaként, hogyan használták az antitest-mikrosorait klinikai kohorszok vizsgálatára, elsősorban szérum- és plazmaminták elemzésére. Nem lehetséges az antitest-mikrovázak klinikai kutatásban történő felhasználásának minden aspektusára kitérni, az alábbiakban csak a legfontosabb betegségek közül néhányra, azaz az autoimmun betegségekre, a fertőző betegségekre, a rákos és a neurodegeneratív betegségekre koncentrálunk.
Autoimmun betegségek
A szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnózisa kihívást jelent a heterogén klinikai megjelenés és az aktív és inaktív betegségtől, valamint más autoimmun betegségektől való megkülönböztetéséhez szükséges robusztus biomarkerek hiánya miatt. Lin és munkatársai 60 különböző betegségaktivitású SLE-beteg, 25 reumatoid artritiszes beteg, 28 egyéb autoimmun betegségből származó perifériás vér mononukleáris sejtjeinek, valamint 24 egészséges kontrollnak a DotScan™ antitest-mikroarray szűrését végezték el. Az antitest-mikroarray-profilok meg tudták különböztetni az aktív SLE-betegeket az egészséges kontrolloktól. A leukocita capture array használatával javult a hagyományos SLE-diagnosztika diszkriminatív képessége, a szérum anti-dsDNS, a komplement C3 és C4 igazolásával a microarray-k növelték a félaktív és aktív SLE megkülönböztetésének képességét, amely információ segíti a betegség jobb kezelését.
Egy másik vizsgálatban Carlsson és munkatársai 135 humán rekombináns egyláncú fragmensváltozót (scFv) konstruáltak, amelyek immunfehérjéket céloznak, hogy házon belüli antitest microarray-t építsenek. Ebben a vizsgálatban szisztémás szklerózisban (SSc), SLE-ben szenvedő betegeket és 15 egészséges önkéntest vizsgáltak. Az SSc a kötőszöveteket érintő autoimmun betegség, amelynek az SLE-től való megkülönböztetése kihívást jelenthet. A tömb 40 differenciálisan expresszálódó fehérjét azonosított, létrehozva egy jelölt proteom szignatúrát az SLE és annak súlyosságának az SSc-től való elhatárolására. Ez a fehérjeszignatúra jobb betegségosztályozást jelentett, mint a hagyományos klinikai paraméterek, köztük az ANA, anti-DNS, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 és CRP egyes vagy akár kombinációi, illusztrálva az antitest-mikrotömbök lehetséges felhasználását új betegség-szignatúrák létrehozására, amelyek klinikai értéket adnak a betegség kezeléséhez.
Infektív betegségek
A fertőzések különbözőképpen aktiválják az immunrendszert, és ezeket a mechanizmusokat antitest-mintázatokkal proteomszintű szinten lehet vizsgálni. A Helicobacter pylori a világ népességének mintegy felét kolonizáló kórokozó, amely krónikus gyomorhurutot okoz. Sukri és munkatársai a DotScan™ antitest-mikroarray-t alkalmazták az immunrendszer tumorsejtekkel szembeni toleranciájának meghatározására gyomorrákban, 144 CD antitestet használva a CD markerek eloszlásának profilozására a Helicobacter pylori fertőzött és nem fertőzött gyomor adenokarcinóma sejtek között. Érdekes módon azt találták, hogy a cagA + H. pylori által fertőzött AGS gyomor adenokarcinóma sejtvonal fokozott CD27 expressziót mutatott, ami elengedhetetlen a T-sejt populáció fenntartásához, és a H. pylori-fertőzött gyomorrákos betegeknél is fokozott CD markereket mutattak ki. Ez a vizsgálat nemcsak az immunrendszer toleranciájára utal a gyomorrákkal szemben, hanem a különböző H. pylori törzsek által kiaknázott immunválasz-variációkra is.
Az antitest-táblázatok továbbá hasznosak lehetnek a fiziológiai környezet folyamatos változásának nyomon követésében, beleértve a betegség állapotát és a terápiákra és beavatkozásokra adott választ. A májtranszplantációt követően a betegek 94%-ánál találtak hepatitis C vírus (HCV) okozta szövettani károsodást, néhány betegnél súlyos betegség kiújulást szenvedett . Sürgősen szükség van prediktív biomarkerekre a betegség kiújuló súlyosságának azonosítására. Egy CD antitest mikroarray segítségével a transzplantáció előtti, korai, közepes és késői transzplantációs csoportba sorolt betegek perifériás vérét vizsgálták a transzplantáció utáni HCV kiújulás súlyosságának előrejelzésére . A májátültetés előtt és után a betegektől vett sorozatos vérminták lehetővé tették a betegség miliőjének nyomon követését, saját belső kontrollokkal. Öt CD-marker (CD27, CD182, CD260, CD41 és CD34) szignifikánsan emelkedett a súlyos kiújulásban az enyhe kiújuláshoz képest. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az antitest-táblázatok segítséget nyújthatnak a májtranszplantációt követő recidiváló HCV-betegség súlyosságának megítélésében.
Ellmark és munkatársai a gyomor adenokarcinómán az n-CoDeR könyvtárból kiválasztott immunszabályozó antigénekkel szemben 127 különböző antitestet tartalmazó, egyetlen keretből álló rekombináns antitest (SinFabs) mikro-táblát dolgoztak ki. Kiderítették, hogy a plazma proteomjából azonosíthatóak különböző tumor-, valamint fertőzés-asszociált fehérje-expressziós szignatúrák, mint például az IL-9, IL-11 és MCP-4, amelyek potenciális biomarkerekként szolgálnak. Ezek az eredmények segíthetnek a H-pylori által kiváltott rák jobb megértésében, és a jövőben utat nyithatnak a kifinomult diagnosztika számára.
Bead alapú antitest tömböket végeztek maláriában és maláriával kapcsolatos szövődményekben szenvedő gyermekek plazmájában lévő differenciális fehérjeprofilok vizsgálatára . Az 1000 fehérje közül 41 fehérje mutatott eltérő expressziót a maláriával fertőzött gyermekek és a közösségi kontrollok között. Tizenhárom további fehérje kapcsolódott a malária-betegség súlyosságához. Ezek az eredmények a gyulladás, valamint a glükóz kiegyensúlyozatlan anyagcseréjének részvételére utalnak a betegség súlyos formáiban, és a legnagyobb változásokat az izomfehérjék közül kettőnél (szénsav anhidráz 3 és kreatin-kináz) tapasztalták, ami az agyi maláriában szenvedő gyermekek izomkárosodására és elváltozásaira utal. Ezek az eredmények segíthetnek olyan egyszerű tesztek kifejlesztésében, amelyekkel a maláriával fertőzött gyermekek a betegség súlyos formájának nagyobb kockázatát mutató csoportba sorolhatók.
Rák
Az antitest-mikrotáblákat a rákkutatásban elsősorban a rák progressziójának és a diagnosztikai biomarkerekként használható fehérjejelöltek vizsgálatára alkalmazták . A hasnyálmirigyrák agresszív betegség, rossz prognózissal, és sürgős szükség van a korai és pontos diagnózist biztosító betegségspecifikus biomarkerekre. Wingren és munkatársai egy saját fejlesztésű rekombináns antitest-mikroarray platform segítségével 148 hasnyálmirigyrákos, krónikus hasnyálmirigy-gyulladásos, autoimmun hasnyálmirigy-gyulladásos (AIP) és egészséges kontrollbeteg szérumát vizsgálták. Azonosítottak egy 25 fehérje célpontból álló panelt, köztük IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, amelyek hozzájárultak a hasnyálmirigyrák és az egészséges kontrollok megkülönböztetéséhez. Ez a 25 fehérje szignatúra magas diagnosztikai potenciált mutat (AUC 0,88). Ezenkívül a csoport a közelmúltban kiterjesztette a panel elemzését további mintakészletekre, beleértve a limfómát , a prosztatarákot és az emlőrákot sejtlizátumokban és plazmában. Ezek az eredmények hasznosak az új és többváltozós diagnosztikai módszerek fejlesztéséhez.
A rákbiológia egyik legfontosabb kérdése, a daganat invazivitásának meghatározása. Egy tanulmány kifejlesztett egy testre szabott, 4096 jellemzőt tartalmazó antitest-mikroarray platformot a preinvazív és invazív betegségeket felölelő plazmaminták lekérdezésére a hasnyálmirigy ductus adenokarcinóma (PDA) egérmodelljéből . Találtak egy fehérje szignatúrát, amely három fehérje, az ERBB2, a TNC és az ESR1 differenciált expressziójából áll, és amelynek segítségével az AUC 0,86-ról (95%-os konfidenciaintervallum 0,76-0,96) 0,97-re (95% CI 0,92-1,0) javítható, ha a PDA marker CA19-9 is szerepel.
A hólyagrák újonnan diagnosztizált eseteinek többsége alacsony stádiumú, alacsony fokú, nem izom-invazív . A standard transzurethralis reszekciót követően a daganatok 50-70%-a kiújul, azonban a daganatok 10-30%-a izom-invazív betegséggé fejlődik . A daganatos progresszió mechanizmusának megértése hasznosabb információkkal szolgálhat a klinikai területek számára. Srinivasan és munkatársai sejtlizátumokat vizsgáltak a Hoheisel laboratórium által konstruált, 810 rákhoz kapcsolódó antitestet tartalmazó antitest-mikroarray-vel. A szerzők 20 fehérjét tartalmazó többváltozós osztályozót építettek, amely 80%-os érzékenységgel és 100%-os specificitással megkönnyítette a kiújulás előrejelzését. Érdekes módon a TGF-β jelátviteli útvonal represszióját találták a kiújuló rákban. Az IFNG, a TNF-α és a THBS1 jelátviteli faktorok kevésbé fejeződtek ki, és a MAPK3 (más néven ERK1) inhibitorának gyakorisága magasabb volt, míg a SMAD2, SMAD3 és SMAD4 ismét jelentősen alulreprezentált volt . Az adatok azt jelezték, hogy a TGF-β jelátviteli útvonal gátlói csökkenthetik a hólyagrák kiújulását .
Puig-Costa és munkatársai antitest-mikrotáblákat alkalmaztak a gyomorrák (GC) biomarkereinek felfedezésére. Nevezetesen, az antitest-mikroarray különböző jól ismert funkcionális fehérjéket célzó antitesteket tartalmazott, amelyek döntő szerepet játszanak a rák progressziójában, beleértve 120 citokint, 43 angiogén faktort, 41 növekedési faktort, 40 gyulladásos faktort és 10 metalloproteinázt. Az Ingenuity pathway-elemzés megerősítette, hogy egyes biomarkerek, mint például az ICAM-1 és az angiogenin, magas gyulladásos választ jeleztek a GC-betegeknél. A sejtmozgás és az immunsejtek mozgásának célpontjai, mint például a monocita kemoattraktáns fehérje (MCP)-1, túlreprezentáltnak bizonyultak a GC-betegeknél. A pozitív prediktív és negatív prediktív érték ebben a validációs kohorszban 75% (95% CI 53-90), illetve 80% (95% CI 56-94) volt. Végül a GC-hez társuló gyulladásos proteom antitest-mikrotömb-elemzései egy 21 fehérje gyulladásos fehérje által vezérelt gyomorrák-szignatúrát (INPROGAS) azonosítottak, amely pontosan megkülönböztette a GC-t a nem rákos gyomornyálkahártyától, és új nyomokat adhat a rák progressziójának elemzéséhez.
A prosztatarákban Schwenk és munkatársai szuszpenziós gyöngytömbökre helyezett antitest-táblázatokat használtak a fehérjék plazmaszintjének különböző csoportok közötti összehasonlítására, hogy további biomarkereket találjanak a prosztata-specifikus antigén (PSA) mellett. A betegek PSA alapján történő osztályozása mellett csökkent CNDP1 plazmaszintet azonosítottak, és egy későbbi nagyobb vizsgálatban kimutatták, hogy ez a betegség agresszívebb formáinál társul. Több mint 1200 betegnél szendvics-immunpróbát fejlesztettek ki ezen eredmények validálására, és tovább tisztázták a csökkent CNDP1 és a nyirokcsomó-metasztázis közötti összefüggést . Ez azon nagyon kevés tanulmányok egyikét mutatja be, amelyek sikeresen validáltak egy kezdeti indikációt az antitest-mikroarray csővezeték és egy célzott assay kifejlesztése révén. A rákos kachexia egy későbbi vizsgálatában a CNDP1 plazmaszintjét a kachexiás betegeknél csökkentnek találták, ami a CNDP1 szintjének változásában bekövetkező metabolikus szerepre utal .
A vékonybél neuroendokrin tumorok vizsgálatában Darmanis és munkatársai két független vizsgálati sorozat (77 és 132 minta) plazmaszintjét és egy célzott gyöngytömböt vizsgáltak 124 egyedi fehérje esetében. Egy fehérjepanel segítségével akár 85%-os osztályozási pontosságot is el tudtak érni, és végezetül új jelölteket javasoltak a tumorok osztályozására. A kiválasztott jelöltek közül, például az IGFBP2 és az IGF1 esetében a csoport ELISA-próbákat végzett a jelzések megerősítésére. Ezek az eredmények a plazmafehérjék és a rák metabolikus kapcsolatára utalnak, és támogatják e célpontok figyelembevételét a jövőbeli rákkutatásokban.
Neurodegeneratív betegségek
A fehérjeexpresszió elemzése lehetőséget nyújt a neurodegeneratív patofiziológiára vonatkozó jelenlegi ismeretek bővítésére . A proteomika területén a közelmúltban elért eredmények lehetőséget biztosítottak új biomarkerek keresésére antitest-mikro-táblák segítségével . A protokollfejlesztés fejlődése lehetővé tette a kutatók számára, hogy ne csak a vért, hanem az agy-gerincvelői folyadékot (CSF) is vizsgálják .
A neuroproteomikán belül a Nilsson laboratórium számos vizsgálatot végzett a Human Protein Atlasból származó antitestek felhasználásával, a szuszpenziós gyöngytömbös vizsgálatokkal együtt. Sclerosis multiplexben (MS) szenvedő betegek CSF-jének profilozásával megtalálták a GAP43-at, egy citoplazmatikus fehérjét, amely részt vesz az idegsejtek kialakulásában és regenerációjában, így ígéretes biomarker az agyi betegségekre . Nemrégiben Remnestål és munkatársai 441, különböző neurodegeneratív betegségekből gyűjtött CSF-mintában, valamint post mortem gyűjtött CSF-ben lévő fehérje szintjét hasonlították össze. A 376 antitest közül a GAP43 és az NRGN szinaptikus fehérjéket találták összefüggésbe hozhatónak az AD-betegekkel a kontrollokhoz képest.
A szklerózis multiplexben szenvedő betegek plazmamintáinak, liquorjának és agyszövetének felhasználásával nagyszabású szűrést végeztek, amely 4500 antitest gyöngysorokon történő felhasználásával kezdődött . Egy sor olyan fehérjét találtak, amelyek a liquorban és a plazmában összefüggésbe hozhatók az MS altípusaival. Az IRF8, IL7 és METTL14 ellen termelt jelölt antitestek közül néhányat az agyszövet immunfluoreszcens elemzésére is felhasználva az MS-léziók közelében lévő neuronok festődését mutatták ki. Ez azt jelzi, hogy a testfolyadékok elemzésére szolgáló tömbalapú vizsgálatokból kiválasztott antitestek további bizonyítékot szolgáltathatnak az érintett szöveteknél is.
Végül a gyöngytömböket amyotrófiás laterális szklerózisban (ALS) szenvedő betegek plazmájának profilozására használták, ahol 367 ALS-beteg és 101 kontrollbeteg 278 fehérje tekintetében került elemzésre. A tanulmány azzal zárul, hogy a neurofilamentum közepes polipeptidet (NEFM), az oldott hordozó család 25 (SLC25A20) és a G-protein jelátvitel szabályozója 18 (RGS18) fehérjéket értékes fehérjéknek javasolják, mivel részt vesznek a betegség patofiziológiájához kapcsolódó folyamatokban, amelyek további validálást igényelnek független mintasorozatokban.