Az AP endonukleáz EXO-3 hiánya fejlődési késést és rendellenes vulvális organogenezist okoz, Pvl, DNS-glikoziláz-iniciált ellenőrzőpont-aktiváción keresztül Caenorhabditis elegansban

Az AP endonukleázok expressziós szintje az L4 stádium után növekszik

Kikelés után a C. elegans négy lárvastádiumon (L1-L4) keresztül fejlődik felnőtté, amelyek mindegyikét a kutikula vedlése szakítja meg. A kifejlett stádiumok még mindig két szakaszra oszlanak: a fiatal kifejlett stádiumra és a gravid kifejlett stádiumra. Hogy betekintést nyerjünk az AP endonukleázok embriogenezist követő szerepébe, megmértük az exo-3 vagy az apn-1 mRNS-expressziós szintjének időbeli változását. 0, 24 és 48 órakor, amikor a legtöbb N2 giliszta a petesejt-, L1- és L4-stádiumban van, az exo-3 és az apn-1 mRNS-expressziós szintjében nem találtunk különbséget (1a,b ábra). 60 órakor, amikor a legtöbb N2 giliszta a fiatal felnőtt stádiumban van, az exo-3 és az apn-1 expressziós szintje körülbelül 13-szor, illetve 2,3-szor magasabb volt, mint 0 órakor (1a,b ábra). Az expressziós szint 72 órakor, amikor a legtöbb N2 giliszta a gravid adult stádiumban van, ugyanolyan volt, mint 60 órakor (1a,b ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az AP-endonukleázokra az embriogenezist követően, különösen az L4 stádium után van szükség.

Az exo-3 mutánsok fejlődési késést mutatnak

Az AP-endonukleázok L4-stádiumtól a kifejlett féreg fejlődéséhez való hozzájárulásának tisztázására az AP-endonukleázok valamelyikében vagy mindkét AP-endonukleázban (EXO-3 és APN-1) hiányos férgeket a megtermékenyített petesejt-stádiumtól kezdve 3 napig normál nevelési körülmények között inkubáltuk (1c. ábra). Az L4, a fiatal felnőtt és a gravid felnőtt stádiumok közötti fejlődési stádiumokat a vulva morfológiájának állapota és az ikrák költése alapján különböztettük meg (1d,f ábra). Bár az összes N2 giliszta gravid felnőtté fejlődött, az exo-3 mutánsok mindössze 14%-a volt a gravid felnőtt stádiumban, 85%-a a fiatal felnőtt stádiumban és 1%-a a lárva stádiumban (1g. ábra), ami arra utal, hogy az EXO-3 hiánya a fejlődés leállását vagy fejlődési késedelmet okoz. Ezzel szemben az apn-1 mutánsok mindegyike gravid felnőtté vált, és az apn-1;exo-3 mutánsok majdnem ugyanabban a fejlődési stádiumban voltak, mint az exo-3 mutánsok (1g. ábra). Tizenkét órával később az összes exo-3 és apn-1;exo-3 mutáns elérte a gravid felnőtt stádiumot (az adatok nem láthatóak), ami azt jelzi, hogy az EXO-3 hiánya nem okoz fejlődési leállást a fiatal felnőtt stádiumban, csak fejlődési késést. Annak pontos vizsgálatára, hogy az exo-3 mutánsok késése milyen hosszú volt, kétóránként megmértük az egyes férgek gravid adult állapotba jutásának idejét, és kiszámítottuk az N2 (N = 8) és az exo-3 mutánsok (N = 16) átlagos idejének különbségét. A különbség 6 óra volt.

Az exo-3 mutánsok fejlődési késése az NTH-1 DNS-glikoziláztól függ

Ez arra enged következtetni, hogy az exo-3 mutánsok fejlődési késés fenotípusát az AP-helyek vagy a 3′-blokkolt SSB felhalmozódása okozza a DNS-ben, mivel ezek az EXO-315 szubsztrátjai. Ezeket a struktúrákat a DNS-ben DNS-glikozilázok hozhatják létre. A C. elegansban konzervált két DNS-glikoziláz közül az UNG-1 a DNS-ben lévő uracilon végzett monofunkcionális DNS-glikoziláz aktivitással AP-helyeket hoz létre, az NTH-1 pedig a DNS-ben lévő oxidatív pirimidin-léziókon végzett bifunkcionális DNS-glikoziláz aktivitással 3′-blokkolt SSB-t hoz létre. Ezért megvizsgáltuk az exo-3 mutánsok késleltetésének UNG-1 és NTH-1 függőségét. Három nappal a petéből való kifejlődés után az ung-1;exo-3 mutánsok 9%-a volt a gravid adult, 86%-a a fiatal adult és 5%-a a lárva stádiumban, és ezek az arányok majdnem megegyeztek az exo-3 mutánsokéval (11% a gravid adult, 85% a fiatal adult és 4% a lárva stádiumban) (2. ábra), ami arra utal, hogy a késés független az UNG-1-től. Ezzel szemben az nth-1;exo-3 mutánsok 94%-a a gravid adult stádiumban, 6%-a pedig a fiatal adult stádiumban volt. Az nth-1;ung-1;exo-3 mutánsok hasonló eredményeket mutattak (2. ábra), ami arra utal, hogy a késés az NTH-1-től függ.

Az exo-3 mutánsok fejlődési késését MMS és NaHSO3 fokozza

Az AP-helyeket létrehozó szerek okozhatnak-e fejlődési késést, ezért MMS és nátrium-biszulfit (NaHSO3) alkalmazásával fejlődési vizsgálatot végeztünk (3a. ábra). Az MMS-ről ismert, hogy közvetve AP-helyeket hoz létre20,21 , és kimutatták, hogy DNS-léziókat indukál a C. elegans22 genomjában. A 0,94 mM MMS-t tartalmazó lemezekre történő tojásrakás után 3,5 nappal az N2 97%-a a gravid adult stádiumban és 3%-a a lárva stádiumban volt, míg az exo-3 mutánsok 61%-a gravid adult, 34%-a fiatal adult és 5%-a lárva stádiumban volt (3b. ábra), ami arra utal, hogy az MMS által indukált AP-helyek az exo-3 mutánsokban további fejlődési késést okoznak, mint az N2-ben. Másrészt az apn-1 mutánsok 93%-a a gravid adult stádiumban, 6%-a a fiatal adult stádiumban és 1%-a a lárva stádiumban volt, ami hasonló az N2-re vonatkozó eredményekhez (3b. ábra). A NaHSO3 elsősorban a citozin uracillá történő deaminálásán keresztül károsítja a DNS-t23. Négy nappal a petesejt-stádiumból való kifejlődés után az összes NaHSO3-mal nem kezelt exo-3 mutáns gravid felnőtté fejlődött, de a 10 mM NaHSO3-mal kezeltek 33%-a gravid felnőtt stádiumban, 12%-a fiatal felnőtt stádiumban és 55%-a lárvastádiumban volt (3c. ábra), ami arra utal, hogy a NaHSO3 fejlődési késést okozott az exo-3 mutánsokban. Ez a késés az ung-1;exo-3 mutánsokban enyhült, mivel a 10 mM NaHSO3-mal kezeltek 79%-a a gravid adult, 14%-a a fiatal adult és 7%-a a lárva stádiumban volt (3c. ábra), ami arra utal, hogy a NaHSO3 által kiváltott fejlődési késés az UNG-1 aktivitásnak köszönhető. Összességében az AP-helyek ugyanúgy okozhatnak fejlődési késést, mint az NTH-1 által generált 3′-blokkolt SSB.

Az exo-3 mutánsok fejlődési késését a CHK-2 indukálja

A következő feltételezésünk szerint az exo-3 mutánsok DNS-glikozilázok által indukált fejlődési késése a DNS-glikozilázok által termelt hasítási termékek által vezérelt DNS-károsodási ellenőrzőpont aktiválásának köszönhető. A C. elegansban már leírtak olyan DNS-károsodási ellenőrzőpont géneket, mint a chk-2 és a clk-224. Hipotézisünk tesztelésére a fejlődési vizsgálatot chk-2 (RNSi) vagy clk-2 (RNSi) körülmények között végeztük (4a. ábra). Bár az exo-3;kontroll (RNAi) férgek 14%-a a gravid adult stádiumban és 84%-a a fiatal adult stádiumban volt, és az exo-3;clk-2 (RNAi) férgek hasonló arányokat mutattak (18% a gravid adult stádiumban és 82% a fiatal adult stádiumban), az exo-3;chk-2 (RNAi) férgek 93%-a a gravid adult stádiumban volt (4b. ábra). Így a chk-2 kiütése megmentette az exo-3 mutánsok fejlődési késését, ami arra utal, hogy a CHK-2 indukálja az exo-3 mutánsok fejlődési késését.

EXO-3 megakadályozza a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl képződést

A DUT-1 egy dezoxiuridin-trifoszfát nukleotidohidroláz (dUTPáz), amely a dUTP-t dUMP-vá hidrolizálja. Ezért a dut-1 (RNSi) a nukleotid-poolban megnövekedett dUTP-t eredményez, amely a DNS-replikáció során dTTP helyett beépül a DNS-be, ami az uracil felhalmozódását okozza a DNS-ben25,26. Arról számoltak be, hogy a dut-1 (RNSi) a vad típusú N2 férgekben rendellenes vulvaorganogenezist, Pvl-t indukál, és hogy a dut-1 (RNSi) által kiváltott Pvl függ az UNG-127-től. Feltételeztük, hogy az EXO-3 hiánya a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl gyakoriságának növekedését okozza, mivel az EXO-3-ra szükség van az AP-helyek javításához, miután az UNG-1 az uracil DNS-ben történő hasítását követően az UNG-1 által. Ennek megerősítésére a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl képződést figyeltük meg AP-endonukleáz-hiányos mutánsokban (5a-c. ábra). A petéből való kifejlődés után 4 nappal túlélő felnőttek 52%-a exo-3 mutáns volt dut-1 (RNSi)-indukált Pvl-vel, és 13%-a N2 giliszta volt Pvl-vel (5d. ábra), ami arra utal, hogy az EXO-3 hiány a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedését okozza. Másrészt az apn-1 mutánsok 15%-ának volt Pvl-je, ami hasonló a Pvl-es N2 férgek arányához (5d. ábra). Az apn-1;exo-3 mutánsok és az exo-3 mutánsok aránya hasonló volt, 52%-ban volt Pvl (5d. ábra).

A dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedése az exo-3 mutánsokban az NTH-1-től függetlenül függ az UNG-1-től

Hogy megvizsgáljuk, hogy a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedése az exo-3 mutánsokban az UNG-1 aktivitásán keresztül történt-e, megvizsgáltuk a fenotípus UNG-1-től való függését. A Pvl-t tartalmazó ung-1;exo-3 mutánsok aránya 2% volt, ami megegyezett a Pvl-t tartalmazó ung-1 mutánsokéval (1%) (6a. ábra), ami arra utal, hogy a Pvl növekedése az exo-3 mutánsokban kizárólag az UNG-1 expressziójának köszönhető.

A következőkben azt vizsgáltuk, hogy az UNG-1 által termelt hasítási termékek szükségesek-e a Pvl indukálásához, azaz, hogy az AP-helyek az NTH-1 AP-liáz aktivitása révén alakulnak-e át 3′-blokkolt SSB-vé. Az exo-3 mutánsok Pvl-t mutató százalékos aránya hasonló volt az nth-1;exo-3 mutánsokéhoz (7b. ábra), ami arra utal, hogy az NTH-1 nem szükséges a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl-hez.

A dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedését az exo-3 mutánsokban a CHK-2 vezérli

Feltételeztük, hogy a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl UNG-1-függő növekedése az exo-3 mutánsokban a fejlődési késés mellett az UNG-1 által termelt hasítási termékek által vezérelt DNS ellenőrzőpont aktiváción keresztül is bekövetkezhet. Arról is beszámoltak, hogy a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl-t a CLK-227 ellenőrzőpont-kináz okozza. Ezért megvizsgáltuk, hogy a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedése az exo-3 mutánsokban függ-e a CHK-2-től és a CLK-2-től. Bár az exo-3;kontroll (RNSi) férgek 49%-ánál volt dut-1 (RNSi)-indukált Pvl, az exo-3;chk-2 (RNSi) férgeknek csak 10%-ánál (6b. ábra). Másrészt az exo-3;clk-2 (RNAi) férgeknél a Pvl-t mutató férgek aránya majdnem ugyanannyi volt (44%), mint az exo-3;kontroll (RNAi) férgeknél. A chk-2 kiütése tehát megmentette a dut-1 (RNAi) által kiváltott Pvl növekedését az exo-3 mutánsokban, ahogyan azt a fejlődési késés esetében megfigyeltük. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedése az exo-3 mutánsokban a CHK-2 expresszióján keresztül történik.

Oxidatív DNS-károsítók csak akkor növelték a Pvl arányát az exo-3 mutánsokban, ha dut-1 (RNSi)

Az exo-3 mutánsokban a Pvl növekedését okozó egyéb DNS-károsítók vizsgálatára azt vizsgáltuk, hogy oxidatív DNS-károsítók, mint az ndx-1 (RNSi), ndx-2 (RNSi) és metil-viologén (MV) fokozzák-e a Pvl képződését. Az NDX-1 és az NDX-2 a 8-oxo-dGDP-t 8-oxo-dGMP-vé hidrolizálja24,28. Ennek megfelelően az ndx-1 (RNSi) és az ndx-2 (RNSi) a 8-oxo-dGDP növekedéséhez vezet a nukleotidkészletben. A 8-oxo-dGDP jelenléte csökkenti az NDX-4 8-oxo-dGTPáz aktivitását, ami a 8-oxo-dGTP felhalmozódását okozza a poolban24. A 8-oxo-dGTP a DNS-replikáció során beépül a DNS-be, ami a 8-oxoG felhalmozódását eredményezi a DNS-ben24,28. Az MV szuperoxid-gyököket termel, amelyek később oxidatív elváltozásokat okoznak a DNS-ben29. Az ndx-1 (RNSi), ndx-2 (RNSi) vagy MV egyszeri kezelése azonban nem volt hatással a Pvl előfordulására az exo-3 mutánsokban. (az adatok nem láthatóak). Ezután megvizsgáltuk, hogy a dut-1 (RNSi) kezeléssel kombinálva az egyes oxidatív DNS-károsító szerek tovább fokozzák-e a Pvl növekedését az exo-3 mutánsokban (7a. ábra). Minden vizsgált kezelés körülbelül 10%-kal fokozta a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl növekedését az exo-3 mutánsokban (7b. ábra), ami arra utal, hogy a DNS oxidatív elváltozásai is okozhatják a Pvl növekedését.

In vitro kísérletekben az NTH-1 gyenge DNS-glikoziláz aktivitást mutatott a DNS 8-oxoG-vel szemben, amellett, hogy az oxidatív pirimidin elváltozásokkal szemben sokkal nagyobb aktivitása van30. Ezért gyanítjuk, hogy a dut-1 (RNSi)-indukált Pvl további oxidatív ágensek által kiváltott nagyobb mértékű növekedése az NTH-1 aktivitásától függ. Bár megerősítettük a fenotípus NTH-1-től való függését, az NTH-1 hiánya nem változtatta meg a Pvl-t mutató férgek arányát (7b. ábra).