Az arrestin-2 komplex szerkezete egy G-protein-kapcsolt receptorhoz kötődve
A Arr2-NTSR1 komplex funkcionális jellemzése és szerkezetének meghatározása
Az arrestinok kölcsönhatása a nem látható GPCR-rel viszonylag gyenge és nagyon dinamikus, de a stabil komplex előállítása elengedhetetlen lépés a szerkezeti vizsgálatokhoz. Ezért szerkezeti vizsgálatainkat megelőzően jellemeztük az NTSR1 és az arrestinok kölcsönhatását a kereskedelmi forgalomban kapható NanoBiT rendszer segítségével, amely hatékony módszer a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására.17 Az NTSR1 kölcsönhatását Arr2-vel és Arr3-mal is kimutattuk, amit a peptid agonista, a neurotenzin (NTS) megnövelt koncentrációja fokoz. A három C-terminális hidrofób maradékot alaninná mutált arrestin mutánsok (3 A mutánsok; I386A, V387A és F388A az Arr2-ben, valamint I387A, V388A és F389A az Arr3-ban),18,19 amelyek az arrestinek preaktivált formájaként ismertek, fokozott kötődési aktivitást mutattak az NTSR1-hez (ábra. 1b).
Az arrestin-NTSR1 kölcsönhatást tovább teszteltük Tango assay-vel, egy olyan sejtalapú vizsgálattal, amely a membránfehérjék oldható kötőpartnerekhez való kötődési aktivitását határozza meg.7,20 Tango próbáink azt mutatták, hogy az NTSR1 Arr2-hez való kötődési aktivitása körülbelül két-háromszorosára nőtt, amikor az NTS peptid agonistát vagy az ML314 kis molekulájú agonistát, egy ismert pozitív-alloszteres modulátort (PAM),21,22 adtunk hozzá. Az Arr2 NTSR1-hez való kötődési aktivitása körülbelül négyszeresére nőtt, amikor mind az NTS-t, mind az ML314-et használták. Az NTSR1 Arr2-hez való kötődését tovább fokozta a 3A mutáció bevezetése (1c. ábra).
A fenti eredmények alapján szerkezeti vizsgálatokat végeztünk az Arr2 3A mutánsával NTSR1-komplexben NTS és ML314 jelenlétében, de a komplex a minta üvegesítésével járó káros hatások miatt a krio-EM rácsokon disszociált. E disszociációs probléma leküzdése érdekében a vad típusú humán NTSR1-et a humán 3A mutáns Arr2 C-terminálisán egy három aminosavból álló linkerrel (GSA) fuzionáltuk. A komplex expressziójának növelése érdekében a receptor N-terminusához citokróm b562 RIL domént (BRIL) is fuzionáltunk. Az Arr2-t tovább stabilizáltuk a Fab30 könnyű lánc, az Arr2 aktív formájának stabilizálására használt antitestfragmentum23 C-terminálisán egy 12 aminosavas linkerrel (GSAGSAGSAGSA) történő fúziójával. A fúziós komplex konstrukciót His8-címkézett Fab30 nehézlánccal és egy GPCR-kinázzal, a GRK5-tel koexprimáltuk, amely foszforilálta a receptort a jobb arrestin kötődés érdekében. A komplex fehérjét nikkel-affinitás oszlop segítségével tisztítottuk 2 µM NTS és 10 µM ML314 jelenlétében, majd koncentráltuk és gélszűréses kromatográfiával tovább tisztítottuk a szerkezeti vizsgálatokhoz (1d, e ábra, részleteket lásd az “Anyagok és módszerek” fejezetben).
A tisztított BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 komplex fehérje viszonylag magas, 58 °C-os olvadási hőmérsékletet (Tm) mutatott, amelyet termostabilitási shift assay24 segítségével határoztunk meg (1f ábra). Negatív EM festéssel vizsgálva egyenletes eloszlást mutatott (1g. ábra). Az egyes részecskék krio-EM adatait FEI Titan Krios mikroszkóppal gyűjtöttük. Összesen 17 206 mikrofelvételt rögzítettünk, és több mint 5 millió komplex részecskét választottunk ki és válogattunk szét a további adatfeldolgozáshoz. A 2D osztályozás a komplex részecskék többféle konformációját azonosította. Az intenzív 3D osztályozást követően 220 464 részecskét (az összes kiindulási részecske ~4,5%-át) választottunk ki a szerkezetrekonstrukcióhoz (Kiegészítő információk, S1. ábra). A sűrűségtérkép 4,8 Å átlagos felbontást mutatott, amelyet a 0,143-as Fourier-héj korreláció (FSC) kritériuma alapján határoztak meg, az Arr2 és a Fab változó régióból (Fv) álló magszerkezet pedig 4,5 Å-ig terjedő felbontási tartományt mutatott (2a. ábra és Kiegészítő információk, S1, S2 ábrák). Az NTSR1 és az Arr2 közötti konformációs heterogenitás azonban még mindig jelen van, amint azt a többtestű elemzés is mutatja (Kiegészítő információk, S3. ábra), annak ellenére, hogy a teljes adathalmaz nagyon kis hányadát használtuk fel a végső rekonstrukcióhoz.
Az Arr2-NTSR1 komplex szerkezeti modellje. a Az NTSR1-Arr2-Fab30 komplex szerkezetének elektronsűrűségtérképe. Míg a teljes komplex szerkezetének ésszerű kontúrszintje körülbelül 0,016, ezen a térképen a kontúrszintet 0,013-ra állítottuk be, hogy a teljes micéliumot megjelenítsük. Az NTSR1 barna színnel, az Arr2 zölddel, a Fab30 szürkével, az NTSR1 transzmembrán doménjét körülvevő micella pedig ezüsttel van jelölve. b Az NTSR1-Arr2-Fab30 komplex teljes szerkezeti modellje. A legfontosabb szerkezeti elemeket a mag interfész (beleértve a két interfészfoltot) és a receptor és az Arr2 közötti farok interfész kiemelt dobozokkal van jelölve. A komplex összetevőire ugyanaz a színkód vonatkozik, mint az (a) panelen. c Az NTSR1 és a rodopszin szuperpozíciója az Arr2 és a vizuális arrestin különböző orientációjú, derékszögben metsződő magszerkezeteit eredményezi. Az egymásra helyezett Arr2-NTSR1 és vizuális arrestin-rhodopszin komplexek négy nézete, az Arr2-t zölddel, az NTSR1-et barnával, a vizuális arrestint magentával és a rodopszint lilával színezve. A rodopszin-vizuális arrestin komplex szerkezeti modelljének PDB-kódja 5W0P.
A mérsékelt felbontás ellenére az EM-térkép lehetővé tette az NTSR1, Arr2 és Fab30 helyzetének és orientációjának egyértelmű meghatározását a komplex összeállításában (2. ábra). A komplex modellt az NTSR1-NTS komplex kristályszerkezetének (PDB: 4GRV),14 és a foszforilált vazopresszin C-terminális peptiddel (V2Rpp) és Fab30-mal (PDB: 4JQI)23 kötött Arr2 szerkezetének a sűrűségtérképhez való dokkolásával építettük fel, majd kézi modellbeállítás, valós térbeli finomítás, valamint a Rosetta finomítás és a modell újraépítésének iteratív ciklusai következtek az EM-térkép alapján.25 A végleges komplex modell tartalmazza az NTSR1 maradékokat R49-től T416-ig, amelyből hiányzik az ICL3 (A270-től P292-ig) és a 8-as hélix és a C-terminális farok közötti linker régió (P384-től S404-ig). Az Arr2 modellje a T6-tól M352-ig terjedő maradékokat tartalmazza, a Fab30 modellje pedig összesen 409 maradékot tartalmaz, amelyek mind a Fab könnyű láncát, mind a nehéz láncát alkotják. Az N-terminálisan fuzionált BRIL és az ML314 kismolekula nem látható a sűrűségtérképen, és így nem szerepel a komplex modelljében. A szerkezeti modell statisztikáit és geometriáját a Kiegészítő információk, S1. táblázat foglalja össze.
Az Arr2-NTSR1 komplex általános szerkezete
Az Arr2-NTSR1 komplex a két komponens aszimmetrikus összeépülésével jön létre úgy, hogy az Arr2 vízszintes tengelye körülbelül 20°-ban metszi a sejtmembrán belső felszínét, ami az arrestin hidrofób C élű hurkainak (L191 és M192, valamint L334-től L338-ig) kölcsönhatását eredményezi a sejtmembránnal (2a, b ábra). Ez összhangban van a vizuális arrestin-rhodopszin komplex kristályszerkezetével, amely először mutatta az aszimmetrikus arrestin-GPCR összeszerelődést, és megerősítette az arrestin hidrofób C élű hurkainak membránhorgonyként való működését, amely stabilizálja az arrestin kötődését a membránba ágyazott receptorhoz, amit később kísérletileg is megerősítettek.7,26,27 Az Arr2 hidrofób C-edge hurkainak kölcsönhatása a sejtmembrán réteggel arra utal, hogy a lipidkötő képesség az arrestin család tagjainak általános tulajdonsága.
Az Arr2-NTSR1 komplex és az Arr1-rhodopszin komplex aszimmetrikus összeállásának hasonlósága ellenére az arrestin relatív orientációja a receptorhoz képest drámaian különbözik e két arrestin-receptor komplex között. A két komplex receptor TMD-jének szuperpozíciója azt mutatja, hogy az Arr2 orientációja 90°-kal elfordul a transzmembrán tengelye körül a vizuális arrestinéhoz képest (2c. ábra). Ebben az új orientációban az ICL3 és a receptor TM5 és TM6 pozíciói egyaránt az Arr2 N-terminális doménje felé mutatnak, ami lehetővé teszi, hogy az ICL3 a C-terminális farokhoz hasonlóan kölcsönhatásba lépjen az Arr2 N-doménjével (2b. ábra).
A komplexösszeállítás konformációs stabilitásának felmérésére hat független, két mikroszekundumos all-atomos molekuladinamikai szimulációt végeztünk az Arr2-NTSR1 komplexre a stabilizáló Fab30 nélkül. A szimulációk során az L334-től L338-ig terjedő C-peremű hurok a membránlipidekhez kapcsolódva, az NTSR1 C-terminális farka pedig az Arr2 N-terminális doménjével kölcsönhatásban maradt (Kiegészítő információk, S4. és S5. ábra). Az arrestin magszerkezete azonban korlátozott mértékben képes elfordulni a cryo-EM szerkezet körül, és a meghosszabbított ujjhurok leválhat az NTSR1 TMD magjáról (Kiegészítő információk, S5. ábra). Ezek a szimulációs adatok arra utalnak, hogy az ujjhurok, valamint az Arr2 és a receptor közötti mag interfész rendkívül dinamikus, és az Arr2-NTSR1 komplex krio-EM szerkezet által rögzített összeállítása valószínűleg a sok konformációs állapot közül egyet képvisel, ami összhangban van azzal, hogy az Arr2-NTSR1 komplex összeállításának konformációs heterogenitása még mindig létezik a végleges krio-EM rekonstrukcióban használt 3D osztály részecskéiben (Kiegészítő információk, Ábra. S3).
Az Arr2-NTSR1 mag interfész
Az Arr2-NTSR1 komplex olyan intermolekuláris kölcsönhatások révén áll össze, amelyek két különálló fő interfészből állnak: egy mag interfész, amely két különálló foltból áll az arrestin központi gerinchurkai és a receptor TMD intracelluláris oldala között, és egy farok interfész az Arr2 N-terminális doménje és a receptor C-terminális farka között (2b. ábra). Az Arr2 és az NTSR1 közötti maginterfész egyik foltja az arrestin ujjhurokja (E66-tól L71-ig), amely a receptor TMD intracelluláris üregébe illeszkedik, és amelyet a receptor ICL1, ICL2, TM5 és 6, ICL1, TM5 és 6 vesz körül (3a. ábra). Ebben a konfigurációban az ujjhurok felső felülete közvetlen határfelületet képez a receptor TM7 és a 8-as hélix közötti fordulattal (3a. ábra).
Az Arr2 ujjhurok és az NTSR1 TMD közötti mag interfészfolt. a Az Arr2 ujjhurok és a receptor TMD intracelluláris ürege közötti interfészfolt. Az arrestin ujjhurok és a receptor TM7 és H8 közötti fordulat főbb határfelületi maradékainak helyét gömbök jelzik. Az NTSR1 barna színnel, az Arr2 pedig zölddel van színezve. b Az arrestin ujjhurok D67 és L68 maradékai és a receptor V367, S368, A369 és N370 maradékai közötti diszulfid keresztkötési jelek a TM7 és a 8-as hélix közötti fordulaton erősek voltak. Összehasonlításképpen, az Arr2 és a vizuális arrestin ujjhurok C-terminális végén lévő L71 maradék között nem vagy csak nagyon gyenge keresztkötési jeleket figyeltek meg. c Konzervált negatív töltésű maradékok az Arr2 és Arr3 és a vizuális arrestin ujjhurokjában. d Az NTSR1 és a rodopszin szuperpozíciója eltérő orientációjú magszerkezeteket (kihagyva), de jól illeszkedő Arr2 és vizuális arrestin ujjhurkokat eredményez. A rodopszin az egyértelműség kedvéért kimaradt. A vizuális arrestin magenta színnel, az Arr2 pedig zölddel van színezve.
A komplex szerkezet határfelületének validálása érdekében sejtalapú diszulfid-keresztkötési kísérleteket végeztünk. Ebben a kísérletsorozatban helyspecifikus ciszteinmaradványokat vezettünk be az Arr2 és az NTSR1 határfelületére. Mindkét ciszteinmutációval rendelkező fehérjét különálló fehérjeként együttesen expresszáltuk sejtekben. A keresztkötési termékeket a sejtek oxidáló reagenssel történő kezelésével képeztük, és SDS-PAGE-vel, majd western blottinggal követtük nyomon az Arr2 C-terminusához fuzionált Flag tag kimutatására. Ugyanezt a módszert alkalmaztuk a vizuális arrestin-rhodopszin komplex határfelületének validálására.7,9 Összesen 177 maradékpár keresztkötési reakcióját végeztük el, amelyek közül erős keresztkötési jeleket figyeltünk meg az Arr2 D67 és L68 maradékai között az ujjhurok központi régiójában, az NTSR1 V367-től N370-ig terjedő maradékai között, amelyek a TM7 és a 8-as hélix közötti fordulóban találhatók (3b. ábra, és ezen határfelületi maradékok pozícióit gömbök formájában ábrázoltuk a 3a. ábrán). Összehasonlításképpen, az ujjhurok C-terminális végén lévő L71 maradék nem vagy csak nagyon gyenge keresztkötési jelet mutatott ezekkel az NTSR1 maradékokkal (3a., b. ábra). Több ujjhurok-maradék is keresztkötést mutatott az ICL1 (Q98) és a TM6 (R294 és A297) maradékokkal, amelyek a receptor TMD intracelluláris üregének összetevői (Kiegészítő információk, S6. ábra). Ezek a keresztkötési adatok validálták az Arr2 ujjhurok és a receptor közötti interfészfoltot, és kimutatták, hogy az arrestin ujjhurok az Arr2-GPCR komplex központi interfészének kulcsfontosságú komponenseként szolgál.
Az Arr2 ujjhurok aminosav szekvenciái savas maradékokkal gazdagodnak, hasonlóan a vizuális arrestinéhoz (3c. ábra), amelyről ismert, hogy kötődik a pozitív töltésű TMD üreghez.7 Az NTSR1 és a rodopszin egymásra helyezésekor az Arr2 ujjhurokja ugyanazt a helyet foglalja el, mint a vizuális arrestin megfelelő régiója, de nem illeszkedik olyan mélyen a TMD-üregbe, mint a vizuális arrestin (3d. ábra), ami arra utal, hogy az Arr2 ujjhurok és az NTSR1 TMD intracelluláris üregének társulása dinamikusabb lehet, mint a vizuális arrestin és a rodopszin között.
Az Arr2 és az NTSR1 közötti központi interfész másik foltja az Arr2 crest régióinak kölcsönhatása a receptor ICL1-ével és ICL2-ével, ami eltér a vizuális arrestin-rhodopszin komplexben tapasztaltaktól. A két arrestin ujjhurkának hasonló orientációjával ellentétben a két receptor szuperpozíciója két olyan orientációban hagyta az arrestinok magstruktúráit, amelyek körülbelül 90°-os szögben különböznek egymástól, amint az a 2c. ábrán látható. Az Arr2 és a vizuális arisztin magstruktúrák eltérő orientációja a GPCR-komplexeikben az arisztinok gerinc régióinak a receptorok intracelluláris hurkaihoz, különösen az ICL1 és ICL2 hurkokhoz való eltérő kötődési módját eredményezi ebben a két arisztin-GPCR-komplexben (ábrák. 2c és 4).
Az Arr2 és az NTSR1 közötti mag interfészfolt. a Az Arr2 és az NTSR1 közötti interfészfolt, amelyben az NTSR1 ICL1-je kölcsönhatásba lép az Arr2 lariat hurokjával és alsó hurkával is. Az interfészfolt maradékainak pozícióit gömbök jelzik, és a b panelen látható diszulfid keresztkötéssel validálták. b Disulfid keresztkötés a receptor alsó hurok G286-os maradékának és a receptor ICL1 L94, Q95 és S96 maradékai között. c Disulfid keresztkötés a receptor ICL3 maradékai és az Arr2 N-domain felső felületének maradékai között. d Az Arr2 N-domain P14 és K160 maradékainak disulfid keresztkötése az ICL3 Q273, G274, Q275, C277, T278, V279 és G280 maradékokkal. e Az Arr2 és az NTSR1 közötti központi határfelület az NTSR1 ICL3 (szaggatott vonallal jelölve) és az Arr2 N-domén felszíne közötti potenciális határfelülettel, amelyet a (c) és (d) panelekben látható diszulfid-kereszthivatkozási adatok sugallnak. Az Arr2 N-domainján lévő potenciális határfelületi maradékok helyét gömbök jelzik. Ugyanazt a színkódot használjuk, mint az (a) panelen.
Az NTSR1 és a rodopszin szerkezeti összehasonlítása azt mutatja, hogy konzervált TMD-konformációval rendelkeznek, amelyben az ICL1 egy elnyújtott hurkot, az ICL2 pedig egy rövid hélixet alkot az arrestinhez kötött komplexeikben. A rodopszin ICL2 hélixe a vizuális arrestin középső hurokja, alsó hurokja és lariat hurokja által alkotott hasadékba illeszkedik (MBL hasadéknak nevezve).7 Azonban az Arr2-ben ugyanezt az MBL hasadékot az NTSR1 ICL1-je foglalja el (4a. ábra) az arrestin eltérő orientációja miatt. Ennek megfelelően az NTSR1 ICL2-je elfordul az MBL hasadéktól, hogy a lariat hurok tetejére pozícionálódjon (4a. ábra). A diszulfid-keresztkötési kísérletek keresztkötési jeleket mutattak ki az NTSR1 ICL1-jének L94-től S96-ig terjedő receptormaradványai és az Arr2 alsó hurokjának G286-os maradékai között, ami összhangban van az NTSR1 ICL1-jének az Arr2 ezen gerinc régiójával való kapcsolódási pontjával (ábra. 4b).
A receptor ICL3, annak ellenére, hogy a sűrűségtérképen nem látható, az Arr2-NTSR1 komplex konformációja alapján valószínűleg interfészt képez a β-arrestin N-doménjével (2b. ábra). A diszulfid-keresztkötési adatok azt mutatták, hogy az NTSR1 ICL3 Q275, C277, T278 és V279 maradékai az Arr2 N-domain felső felületén lévő T56, T58, V81 és N83 maradékokkal keresztkötődnek (4c. ábra és Kiegészítő információk, S6. ábra). Ezek az ICL3 maradékok szintén erős keresztkötési jeleket mutattak az Arr2 K160 maradékával (4d. ábra). További diszulfid keresztkötési jeleket figyeltünk meg az NTSR1 ICL3 Q273-tól G280-ig terjedő legtöbb maradék és az Arr2 P14 maradékai között (4d. ábra). Ezek a keresztkötési adatok arra utalnak, hogy a receptor ICL3-ja az N-domén közelében helyezkedik el, és kölcsönhatásba léphet az Arr2 N-domén felületén lévő maradékokkal (4e. ábra).
Az Arr2-NTSR1 farokfelület
Míg az Arr2-NTSR1 magfelület rendkívül dinamikus, az NTSR1 C-terminális farok és az Arr2 N-doménje közötti farokfelület hasonlónak tűnik a vizuális arrestin-rhodopszin komplexben9 lévőhöz (5. ábra). Megfigyeltük az NTSR1 körülbelül tíz C-terminális farokmaradványának elektronsűrűségét 0,016-os kontúrszinten (amelynél a teljes komplex szerkezet sűrűsége megfelelően megjeleníthető), amelyek az Arr2 első β-szálához kötődnek (5a. ábra). A C-terminális farok ezen régiójáról azonban a sűrűségtérkép korlátozott felbontása miatt nehéz részletes információkat azonosítani, beleértve a specifikus maradékokat is. Az NTSR1-Arr2-Fab30 fúziós fehérje tömegspektrometriás elemzése (5b. ábra és Kiegészítő információk, S7. ábra) kimutatta, hogy az NTSR1 C-terminális farkának S401-től T416-ig hét szerin- vagy treonin-maradék foszforilálódott, ami arra utal, hogy ez a régió valószínűleg részt vesz az arrestin N-domén pozitív töltésű felületéhez való kötődésben. A diszulfid-keresztkötési kísérletek azt mutatták, hogy az Arr2 P14 maradék az első β-szál C-terminális fordulójánál erősen keresztkötődött a receptor H406-tól S410-ig terjedő maradékával (5d. ábra és Kiegészítő információk, S6. ábra), ami azt jelezte, hogy a receptor H406-tól C-terminális maradékai valószínűleg az arrestin N-doménjéhez kötődő régió (ábra. 5c).
Az NTSR1 C-terminális farka és az Arr2 pozitív töltésű N-doménje közötti interfész. a Az Arr2 első β-szálához kötődő NTSR1 C-terminális farka teljes EM-térképe. A 0,016-os kontúrszintű sűrűségtérkép a receptor körülbelül tíz C-terminális farokmaradványát fedi le. A receptor C-terminális farka barnával, az Arr2 zölddel, az EM-térkép pedig szürkével van színezve. b Az NTSR1-Arr2-Fab30 fúziós fehérje tömegspektrometriás elemzése kimutatta, hogy a C-terminális maradékok S401, S403, S404, S409, S410, T413, T416 és Y418 foszforiláltak a fehérjemintában. c Az NTSR1 C-terminális farka és az Arr2 első β-szála közötti határfelület. A diszulfid-keresztkötés (a d panelben látható) arra utal, hogy az NTSR1 C-terminális farkának az Arr2 N-doménjéhez kötődő régiója valószínűleg a H406 és L417 maradékok között található. A keresztkötési jeleket mutató maradékok a (d) panelben szereplő keresztkötési adatok alapján vannak jelölve. d A P14-nek az Arr2 N-domain felső felületén lévő P14 és a receptor C-terminális H406-tól S410-ig terjedő maradékai közötti diszulfid keresztkötési adatok; valamint a β-arrestin R103 maradékának a receptor C-farkának L417 maradékával történő keresztkötése.
A Arr3-GPCR kölcsönhatás modellje
A humán genomban a β-arrestin két altípusa található: az Arr2 és az Arr3, amelyek több mint 53%-os szekvenciaazonossággal rendelkeznek, de van néhány átfedő és néhány eltérő funkciójuk is. Mivel az Arr3 az Arr2-hez hasonló NTSR1-kötési affinitást mutatott (1b. ábra), meg akartuk vizsgálni, hogy az Arr3 NTSR1-hez való kötődési módja konzerválódik-e az Arr2-ével. Disulfid-keresztkötési kísérleteink azt mutatták, hogy az Arr3 ujjhurok E67-L72 maradékai (amelyek megfelelnek az Arr2 E66-L71-nek) keresztkötődtek az NTSR1 TM7 és a 8-as hélix közötti fordulóban lévő megfelelő maradékcsoporttal (A369 és N370) (Kiegészítő információk, S8. ábra), ami arra utal, hogy e két β-arrestin között konzervált ujjhurok interfész van a receptor TM7-ével és H8-ával.
Ezeken kívül a diszulfid-keresztkötési adatok azt mutatták, hogy az Arr3 P15 maradék (amely megfelel az Arr2 P14-ének) keresztkötődött a receptor C-terminális farkának N405-T407 maradékával, ami hasonló farokfelületre utal az Arr3 és az NTSR1 között (Kiegészítő információk, S8. ábra). Hasonló keresztkötési mintázat volt megfigyelhető az NTSR1 ICL3 maradékai és az Arr3 N-domain maradékai között, beleértve a P15-öt az első β-szál C-terminusán és a K161-et (ami megfelel az Arr2 K160-ának) a felső β-szálak közötti hurokban (Kiegészítő információk, S8. ábra). Ezek a keresztkötési adatok együttesen azt sugallják, hogy az Arr3 és az NTSR1 általános összeszerelődése hasonló az Arr2 és az NTSR1 összeszerelődéséhez ebben a core engaged konfigurációban.
A β-arrestin rekrutáció modellje az 5-HTR1A és 5-HTR1B által
Sok GPCR, beleértve a szerotonin receptorokat 5-HTR1A és 5-HTR1B, valamint számos dopamin receptort, vagy nem rendelkeznek vagy tartalmaznak egy nagyon rövid C-terminális farkat, és a javaslat szerint az ICL3-at alternatív interfészként használják a β-arrestinek rekrutálására.28 Az 5-HTR1A és 1B hosszú ICL3-mal rendelkezik, több foszforilációs hellyel a β-arrestinek pozitív töltésű N-domainjaival való potenciális kölcsönhatáshoz. Biokémiai kötődési vizsgálataink azt mutatták, hogy mindkét receptor Arr2-hez és 3-hoz hasonló aktivitással kötődik, mint az NTSR1 Arr2-vel (Kiegészítő információk, S9. ábra). Amikor azonban a vizuális arrestin-rhodopszin komplex szerkezetét használtuk sablonként, nehéz volt modellezni az 5-HTR1A vagy 1B foszforilált ICL3 kötődési módját a β-arrestinek N-domainján lévő pozitív töltésű réshez. Ennek az az oka, hogy a TM5 és 6, valamint a rodopszin ICL3-ja a vizuális arrestin-rhodopszin komplex szerkezetében az arrestin N-domén pozitívan töltött felületével ellentétes helyen helyezkedik el.
A Arr2-NTSR1 komplex szerkezet azonban egy eltérő komplex-összeállítást mutat, amelyben az Arr2 90°-kal el van forgatva a vizuális arrestin pozíciójától az arrestin-rhodopszin komplexben (2c. ábra). Az NTSR1 TM5-je és TM6-a tehát az Arr2 N-doménjének elülső felülete fölött helyezkedik el, lehetővé téve a receptor ICL3-jának (a szerkezetben nem látható), hogy elérje az Arr2 pozitív töltésű N-doménjét (4e. ábra). Disulfid-keresztkötési adataink bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy az NTSR1 ICL3 képes kölcsönhatásba lépni az Arr2 és 3 N-doménjének pozitív töltésű hasadékával (4c-e ábra, Kiegészítő információk, S6 és S8 ábrák). Ezért az Arr2-NTSR1 komplex szerkezete alkalmas sablonként szolgálhat a β-arrestinek 5-HTR1A és 5-HTR1B interfészének modellezéséhez.
Az Arr2-NTSR1 szerkezetet sablonként használva, valamint az 5-HTR1B ergotaminhoz kötött 5-HTR1B kristályszerkezetét kiindulási modellként használva (PDB: 4IAR),29 létrehoztunk egy Arr2-5-HTR1B komplex homológiamodellt, amelyben az Arr2 és az 5-HTR1B közötti központi interfész hasonló az Arr2-NTSR1 komplexéhez (6a, b ábra). Ezután diszulfid-keresztkötési kísérleteket végeztünk a homológiamodellben bemutatott Arr2-5-HTR1B komplex összeállításának tesztelésére (6c. ábra és Kiegészítő információk, S10. ábra).
Az Arr2 és az 5-HTR1B kötődési módja. a Arr2-5-HTR1B homológia modell az Arr2-NTSR1 komplex mint sablon alapján. A dobozokkal kiemeltek az Arr2 és az 5-HTR1B közötti core interface foltok. b Az Arr2 és az 5HTR1B közötti core interface foltok a (c) panelben látható diszulfid keresztkötéssel validált interface maradékokkal (gömbökként ábrázolva). c Disulfid keresztkötés az Arr3-5-HTR1B core interface foltok maradékpárjai között. d Az 5-HTR1B ICL3 karikatúraszerű bemutatása a TM5-ről és TM6-ról kiterjesztve, a foszforilációs kódú maradékokat pirossal kiemelve. e Disulfid-kereszthivatkozás a maradékpárok között az Arr2 N-domén és az 5-HTR1B ICL3 közötti határfelületen. f Karikatúraszerű modell az 5-HTR1B ICL3 és az Arr2 pozitív töltésű N-doménje közötti kölcsönhatás szemléltetésére. A modell jelzi az arrestin kölcsönhatását a receptor TMD magjával és az ICL3-mal, valamint az arrestin C-peremű hurkok lipidhorgonyzását (csillaggal jelölve). A kettős nyíl jelzi az arrestin konformációs kilengését a receptormag körül.
Keresztkötési jeleket figyeltünk meg az Arr2 ujjhurok D67 L68, V70 és L71 maradékai és az 5-HTR1B TM7 és a 8-as hélix közötti fordulóban lévő N373, E374 és D375 maradékok között (6c. ábra). Az ujjhurok D67, L68, V70 és L71 maradékai a TM6 belső felületén keresztkapcsolódtak a receptor R308 és K311 maradékával (Kiegészítő információk, S10 ábra). Ezek a keresztkötési adatok alátámasztották az Arr2 ujjhurok konzervált kötődési módját az 5-HTR1B TM-domén intracelluláris üregével (6a, b ábra). A diszulfid-keresztkötési adatok szintén mutattak keresztkötési jeleket az Arr2 R285 és G286 maradékai között az arrestin alsó hurokban az 5-HTR1B ICL1 K79 maradékával (6c. ábra és kiegészítő információk, S10. ábra). Ez a specifikus keresztkötés csak az Arr2-NTSR1 modellben az arrestin orientációjával áll összhangban, de nem kompatibilis a vizuális arrestin-rhodopszin komplexszel. Ezek a keresztkötési adatok együttesen alátámasztották az Arr2 crest régió és az 5-HTR1B TM-domén intracelluláris oldala közötti központi interfészt, amely konzerválódik az Arr2-NTSR1 komplexben lévővel (6a-c. ábra).
Az 5-HTR1B több szerin- és treoninmaradékot tartalmaz a hosszú ICL3 központi területén, amelyek foszforilálódhatnak a pozitív töltésű arrestin N-domén felületéhez való kötődéshez (6d. ábra). Ciszteinpáros mutációkat terveztünk a receptor ICL3 és az Arr2 N-doménje közötti potenciális határfelületen, és azt találtuk, hogy az ICL3 T268, S295, L298 és E300 maradékai keresztkötést mutattak a felső β-lap felszínén lévő maradékokkal, beleértve az Arr2 T56, V81, N83, K147 és K157 maradékát (6e. ábra és Kiegészítő információk, S10 ábra). Az ICL3 S260 és T268 maradékai keresztkötési jeleket mutattak az Arr2 első β-szálán lévő K11 maradékkal és az Arr2 első β-szálát követő fordulaton lévő N15 maradékkal (6e. ábra és kiegészítő információk, S10. ábra). Az S260 maradék a TM5 C-terminális vége közelében van, és keresztkötése a K11-gyel az Arr2 N-doménjének pozitívan töltött oldalán csak az Arr2-NTSR1 orientációban lehetséges, de a vizuális arrestin-rhodopszin orientációban nem, mivel a vizuális arrestin-rhodopszin komplex szerkezetében a receptor TM5 és 6 egyaránt az arrestin N-doménjének pozitívan töltött felületének hátsó helyén helyezkedik el.
Az 5HTR1A és az 5-HTR1B között is közel azonos Arr2 keresztkötési mintázatot figyeltünk meg. Kereszthivatkozási jeleket figyeltünk meg az Arr2 D67, L68, V70 és L71 ujjhurok-maradványai és az 5-HTR1A TM7 és a 8-as hélix közötti fordulóban lévő N404, K405 és D406 (az 5-HTR1B N373, E374 és D375 maradékának megfelelő) maradékai között (Kiegészítő információk, S11. ábra). Az ujjhurok D67 és L68 maradványai szintén keresztkötést mutattak a TM6 belső felületén a receptor R339 és K342 maradványaival (amelyek megfelelnek az 5-HTR1B R308 és K311 maradványainak) (Kiegészítő információk, S11. ábra). Megfigyeltünk továbbá diszulfid keresztkötést az Arr2 alsó hurok R285 és G286 maradékai és az 5-HTR1A ICL1 L67 maradékai között (ami megfelel az 5-HTR1B K79-nek) (Kiegészítő információk, S11. ábra). Ezek a keresztkötési adatok alátámasztják, hogy az Arr2 és az 5-HTR1A, valamint az 5-HTR1B között hasonló maginterfész van, amely konzerválódik az Arr2-NTSR1 komplexben lévővel (6a, c ábra).
Az 5-HTR1A ICL3 több mint 100 aminosav-maradékot tartalmaz (233-tól 336-ig), 12 szerin- vagy treonin-maradékkal, amelyek hat részleges foszforilációs kódot alkotnak glutaminsav- vagy aszparaginsav-maradékokkal együtt (Kiegészítő információk, S12 ábra). Ciszteinpár-mutációkat terveztünk, hogy feltérképezzük az e receptor ICL3 és az Arr2 N-doménje közötti potenciális interfészt. A keresztkötési adatok azt mutatták, hogy az ICL3 V230, T240, P250, R261, K270 és D285 maradékai keresztkötődtek az Arr2 N-domainjában lévő V81 és K160 maradékokkal (Kiegészítő információk, S11. ábra). Az Arr2 első β-szálának P14 maradéka erősen keresztkötődött az 5-HTR1A ICL3 N300, P308, P315, P318, P321 és R323 maradványaival (Kiegészítő információk, S11. ábra).Ezek a keresztkötési adatok az Arr2-5-HTR1B komplex homológiamodelljével együtt átfogó képet adtak arról, hogy az 5-HTR1A és az 5-HTR1B hogyan rekrutálja az Arr2-t.
Ebben a cikkben az Arr2 szerkezetét közöljük az NTSR1-gyel, egy A osztályú GPCR-rel komplexben, krio-EM egyszemcsés elemzéssel. Míg a receptor C-terminális farka és a pozitív töltésű arrestin N-domén közötti kötődési mód konzerválódik a vizuális arrestin-rhodopszin komplexben lévővel, ez a szerkezet a vizuális arrestin-rhodopszin komplexben látottól eltérő Arr2 orientációt mutat. A homológiamodellezés és a diszulfid-keresztkötéses interfész-térképezés azt mutatja, hogy ez a központi interfész konzerválódik az Arr2 komplexekben az 5-HTR1A és 1B alcsaláddal. Ezekben a komplex modellekben az Arr2 orientációja lehetővé teszi, hogy a receptor ICL3-ja elérje az Arr2 N-domain felszínét, lehetőséget biztosítva egy C-terminális farok nélküli GPCR számára, hogy ICL3-ját az arrestin N-domainnal való kölcsönhatásra használja. Mivel az Arr2 és Arr3 ubikvitálisan expresszálódó fehérjepartnerek számos nem vizuális GPCR jelátvitelében, az Arr2 és az NTSR1 és az 5-HTR1 alcsalád tagjaival való kölcsönhatásának szerkezeti és biokémiai vizsgálatai alternatív modellt nyújtottak az Arr2 és Arr3 nem vizuális GPCR-ekkel való kölcsönhatásának megértéséhez.