Az azefát citotoxikus és genotoxikus hatása az emberi spermiumokra

Abstract

A foszfororganikus peszticidek (OP-k) kiterjedt használata megváltoztathatja a sperma minőségét és a spermiumok DNS-ét a spermatogenezis különböző szakaszaiban. Az acefát egy rendkívül toxikus, széles körben használt OP, ezért célunk az volt, hogy értékeljük az acefát hatását az emberi sperma minőségére és a sperma DNS integritására. Az egészséges férfiaktól gyűjtött spermiumokat 0, 50, 100 és 200 μg/ml acefátnak tettük ki, és 1, 2 és 3 órán át inkubáltuk. Ezt követően vizsgáltuk a spermiumok mozgékonyságát, vitalitását, a plazmamembrán funkcionális integritását, a spermiumok kapacitációját és DNS-károsodását. Az eredmény azt mutatta, hogy a motilitás 100 μg/ml-nél 3 óra után, 200 μg/ml-nél pedig 1 óra, 2 óra és 3 óra után jelentősen csökkent. 200 μg/ml-nél az életképesség jelentősen csökkent 2 óra és 3 óra után. 100 μg/ml-nél 3 óra után, 200 μg/ml dózisnál pedig 2 óra és 3 óra után a funkcionális integritás jelentősen károsodott. Hasonlóképpen, a spermiumok kapacitációját jelentősen befolyásolta 200 μg/ml dózis 1 óra, 2 óra és 3 óra után, valamint 100 μg/ml dózis 3 óra után. A DNS-károsodás csak 200 μg/ml dózisban növekedett szignifikánsan 3 óra után. Bevezetés

Az elmúlt évtizedekben számos tanulmány kimutatta, hogy az ember által előállított vegyi anyagok és más mérgező anyagok miatt az állatokban és az emberekben romlott a reprodukciós funkció . Sajnos viszonylag kevés tanulmány foglalkozott szisztematikusan a környezeti expozíciónak az emberi reproduktív egészségre gyakorolt hatásával. A legújabb tanulmányok szerint világszerte évente mintegy 60-80 millióan szenvednek meddőségben (12 hónapos rendszeres, védekezés nélküli szexuális együttlét után sem sikerül teherbe esniük). A férfiak szubfertilitási eseteinek 98 százaléka elsősorban a spermiumok hiányos minőségére vezethető vissza. A szubfertilitás azonban idiopátiásnak is tekinthető, és lehet olyan kockázati tényezők következménye, mint a környezeti endokrin diszruptorok, beleértve a peszticideket is.

A szerves foszfát peszticidek foszfor- és tiofoszforsavak észterei, és toxicitásukat az acetilkolin-észteráz hatását gátló képességükkel hozták összefüggésbe, ami az acetilkolin felhalmozódásához vezet az idegkötésekben . Számos epidemiológiai tanulmány felismerte a szerves foszfát peszticideknek (OP-k) való kitettség és a reprodukciós rendellenességek, például meddőség, születési rendellenesség, kedvezőtlen terhességi eredmények és perinatális halálozás közötti összefüggést . A szerves foszfát peszticidek feltehetően megváltoztatják a reproduktív funkciókat azáltal, hogy csökkentik az agyi acetilkolin-észteráz aktivitását, ami hatással van az agyalapi mirigy gonadotropinjára, ami meddőséget okoz . A sperma minőségére gyakorolt hatásokat olyan paraméterekkel lehet értékelni, mint a spermiumkoncentráció, a mozgékony spermiumok százalékos aránya és a normális morfológiájú spermiumok százalékos aránya, valamint a spermiumok mozgási paraméterei. Számos tanulmány kimutatta, hogy az OP-nak kitett férfiaknál nagy a kockázata a rendellenes spermaparaméterek kialakulásának, beleértve a csökkent spermiumkoncentrációt, a csökkent spermiummozgékonyságot, a csökkent spermiumszámot és a spermiumok magasabb nemi kromoszóma aneuploiditását . Egy Kínában különböző OP-vel végzett vizsgálat egyértelmű kapcsolatot mutatott ki a vizeletben lévő rovarölőszer-metabolitok jelenléte és a spermiumkoncentráció és a spermiumok mozgékonysága között frissen házasodott férfiaknál . Az OP-kkel végzett in vitro vizsgálatok bizonyították, hogy ezek a peszticidek károsíthatják az emberi spermiumok DNS-ét, így genotoxikus hatásokat okozhatnak .

A Srí Lankán széles körben használt és toxikus OP-k közül az acefát (O,S-dimetil-acetil-foszforamidotioát) egy rovarölő szer, amelyet széles spektrumú rovarölő tulajdonsága miatt a mezőgazdaságban és háztartási célokra használnak. Az azefát szisztémás rovarölő szer, amely kontakt- és gyomorhatással rendelkezik. Az acefát toxikus mechanizmusa nemcsak az acetilkolinészteráz (AchE) gátlásának tulajdonítható, hanem késleltetett neurotoxikusként is hat. Sing és Jiang arról számolt be, hogy az acefát erős neurotoxikus, mutagén, karcinogén és citotoxikus vegyület. Hasonlóképpen Farag és munkatársai kimutatták, hogy 14 és 28 mg/kg/nap dózisú acefát csökkentette a spermiumok mozgékonyságát és a spermiumok számát felnőtt hím egerekben. Egy másik két vizsgálat megerősítette, hogy az acefát jelentősen csökkenti a termékenységet, a spermadinamikát, a nemi szervek súlyát és a nemi hormonokat hím albínó patkányokban . Ezért más OP-khoz hasonlóan ez a vegyület is potenciális kockázatot jelent az emberek reproduktív egészségére.

Az acefátot széles körben használják Sri Lanka mezőgazdasági termelői, akik a legjobb reproduktív korban vannak. Az elmúlt két-három évtizedben világossá vált, hogy a peszticideknek való foglalkozási expozíció befolyásolhatja a férfiak termékenységét , így jelezve e fiatal termesztők magas expozíciós kockázatát. A peszticidek szabályozása főként állatmodelleken alapul, az emberi expozícióra és a sperma minőségére vonatkozó adatok továbbra is ritkák és korlátozottak. Ezért a jelen tanulmányt az acefátnak az emberi férfi termékenységre és a spermasejtek DNS integritására gyakorolt hatásának in vitro vizsgálatára végeztük.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vizsgálati anyag

Formázatlan acefát (kereskedelmi név: Surrender; molekuláris képlet: C4H10NO3PS; molekulatömeg: 183,16 g/mol; tisztaság: 99,0%; a gyártó által ajánlott szántóföldi adagolás: 1 g acefátot 1 liter vízhez) a Hayleys Agriculture Ltd. (Colombo, Srí Lanka) cégtől szereztük be. Mivel az acefát könnyen oldódik a Biggers Whitten Whittingham (BWW) vízben, ezt használtuk kontrollként.

2.2. Sperma gyűjtése és előkészítése

A spermamintákat a Sri Lanka-i Sri Jayewardenepura Egyetemről származó egészséges férfi (20-30 éves) donoroktól gyűjtöttük steril mintaüvegben. A spermagyűjtés előtt a donorok tájékoztatót és beleegyező nyilatkozatot kaptak, amelyben kérték a vizsgálatban való részvételi hajlandóságukat. Minden résztvevő alanyt arra kértek, hogy a spermagyűjtés előtt 3-5 napig tartózkodjon minden szexuális tevékenységtől. A vizsgálatba olyan férfiakat (átlagéletkoruk ) választottak ki, akiknél a spermium koncentrációja, mozgékonysága, morfológiája, viszkozitása, cseppfolyósodási ideje és pH-ja normális volt, és nem voltak éretlen formák és leukociták. A spermaparamétereket (motilitás, vitalitás, hipozmotikus duzzadásvizsgálat és morfológia) az Egészségügyi Világszervezet irányelveinek megfelelően értékelték. Mivel az acefát hatása felerősödhet az abnormális spermiumok esetében, fontos, hogy elfogadható minőségű spermiumokkal rendelkező donorokat válasszunk a vizsgálathoz.

Az etikai jóváhagyást (etikai engedély ref. nnumber: 712/13) a Sri Jayewardenepura Egyetem Orvosi Tudományok Karának Etikai Felülvizsgáló Bizottsága, Nugegoda, Sri Lanka, szerezte meg.

2.3. A vizsgálathoz a donorok kiválasztása és a vizsgálat elvégzése Dózisszintek meghatározása

A dózisszintek meghatározásához az acefát LD50 értékét végeztük el a spermiumok motilitására vonatkozóan. Ezért 1 mg acefátot tartalmazó mintát készítettünk 1 ml BWW-ben, ami megfelel az acefát ajánlott szabadföldi dózisának (1 g acefát 1 L vízbe). Az elkészített mintákat ezt követően BWW-vel hígítottuk, hogy különböző koncentrációjú acefátot kapjunk. A spermiumszuszpenziókat (50 × 106 spermium/ml-re rögzítve) Eppendorf-csövekbe helyeztük, és a kívánt mennyiségű BWW-t vagy vizsgálati oldatot adtuk hozzá (a cső végső térfogata 1 ml). A mintákat alaposan összekevertük, majd 1 órán át párásított inkubátorban (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokió, Japán) 37°C-on, 5% CO2 -ben inkubáltuk. Az inkubáció után a spermiumok százalékos motilitását minden egyes koncentrációnál két független megfigyelő határozta meg fáziskontrasztos optikájú Olympus mikroszkóp alatt (X 400; Olympus Corporation, Japán). A spermaminták toxikus dózisainak meghatározására szolgáló kísérleti felmérés alapján kiderült, hogy az acefát LD50 értéke 200 μg/ml. Ezért az LD50 alatti szubletális koncentrációkat, beleértve az LD50 értéket is, használták a jelen vizsgálatban.

Az alábbiakban a jelen vizsgálathoz kiválasztott dózisszinteket adjuk meg: Magas dózis: 200 μg/ml (az LD50 értékkel egyenértékű). Közepes dózis: 100 μg/ml. Alacsony dózis: 50 μg/ml. Továbbá úgy döntöttünk, hogy az időpontokat 1 óráról 2 órára és 3 órára terjesztjük ki, hogy meghatározzuk az acefát-expozíció elhúzódó hatásait.

2.4. Az acefát-expozíció hosszan tartó hatását. Peszticid inkubáció

A friss spermamintákat () BWW-vel hígítottuk, hogy 40 × 106 spermium/mL végső spermiumkoncentrációt érjünk el. Ezt követően a mintákat 50, 100 és 200 μg/mL koncentrációjú peszticiddel vagy BWW-vel inkubáltuk. Az inkubációkat 1 mL végső térfogatban végeztük 1, 2 és 3 órán keresztül 37°C-on, inkubátorban (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokió, Japán), 5% CO2 és 95% O2 atmoszférában.

2.5. A spermiumok motilitásának meghatározása

A mozgékony spermiumok összlétszámát (kb. 100 sejt) két független megfigyelő becsülte meg fáziskontrasztos optika (X 400; Olympus Corporation, Japán) alatt. Az előre irányuló motilitás százalékos arányát kiszámítottuk.

2.6. Citotoxicitási vizsgálat

A spermiumok életképességét Eosin Y festési technikával értékeltük, és kiszámítottuk az elhalt és élő spermiumokat. Életképesség százalékos aránya = (összes sejtek száma – festett sejtek száma/összes sejtek száma) × 100. A sejtek teljes száma = 100.

2,7. A spermium plazmamembrán funkcionális integritásának meghatározása

A spermium plazmamembrán funkcionális integritását a Jeyendran et al. által leírt hipozmotikus duzzadás (HOS) teszt segítségével vizsgáltuk. Preparátumonként legalább 100 spermiumot számoltunk meg.

2.8. A kapacitáció meghatározása

Egy 150 μL BWW táptalaj aliquotját egy előmelegített tenyésztőedénybe (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) helyeztük, és egy előmelegített 22 × 22 mm-es fedőlappal fedtük le. A fedőlap egyik sarkába 20 μL spermamintát adtunk. A tenyésztőedényt egy 37 °C-on kiegyenlített, termosztatikusan szabályozott légfűtéses szekrénnyel (Nikon, London, Egyesült Királyság) felszerelt inverz mikroszkópba (Diaphot, Nikon, London, Egyesült Királyság) helyeztük. A spermiumok kapacitációs állapotát a hiperaktiváció alapján objektív fényképezési módszerrel, egy Olympus IX71 fáziskontraszt mikroszkóp segítségével értékeltük. Mivel a hiperaktiváció flagellák jelensége, a hiperaktiváció vizuálisan is értékelhető a spermiumok mozgékonysága alapján; a flagellák mozgási mintázatát a nem hiperaktivált és hiperaktivált spermiumok megszámlálásához értékeltük . A kísérleteket két példányban végeztük, és egymástól függetlenül négyszer ismételtük meg.

2.9. A DNS-károsodás meghatározása a spermiumokban

A spermiumkeneteket tisztított mikroszkópos tárgylemezeken készítettük el, és a normális DNS-t tartalmazó spermiumok százalékos arányát 500 spermium megszámlálásával határoztuk meg fluoreszcens mikroszkópia (BH-2, Olympus Ltd., Japán) alatt, 490 nm-es gerjesztéssel. Az egy mezőre vonatkozó megfigyelési idő kevesebb mint 40-50 másodpercet vett igénybe. A sárgától vörösig terjedő színt mutató spermiumot denaturált DNS-nek, a zöld színt mutató spermiumot pedig normál DNS-nek minősítették .

2.10. Statisztikai elemzés

A felnőtt hímek spermiumszáma normális eloszlású volt, és a csoportok közötti összehasonlítást kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük a Minitab szoftvercsomag (Minitab Co., USA) segítségével a peszticidek fő hatására. Amennyiben szignifikáns kezelési hatást találtunk, az egyes csoportok átlagai közötti különbségeket “Tukey 95%-os” módszerrel vizsgáltuk. Az adatokat átlag ± Standard Error Mean (SEM). értéket .

3. Eredmények

3.1. értékre állítottuk be. Spermamotilitás

A kontrollhoz képest a százalékos motilitás szignifikánsan () csökkent (1. táblázat) a közepes dózisnál (100 μg/ml) 16%-kal 3 óra inkubáció után. Ezzel szemben 200 μg/mL-nél rendkívül szignifikáns () csökkenést regisztráltak 1 óra, 2 óra és 3 óra inkubáció után a kontrollhoz képest. Továbbá a motilitás csökkenése egyértelmű minden dózisban az inkubációs idő növekedésével.

3.2. táblázat. Citotoxicitás

Az életképesség százalékos aránya csökkent (1. táblázat) minden kezelési csoportban az idő múlásával, de jelentős csökkenést (20%-kal; ) regisztráltak a 200 μg/ml (nagy dózis) esetében az inkubációt követő 2 óra elteltével a kontrollokhoz képest. Nagymértékben szignifikáns () csökkenést regisztráltak a nagy dózisban 3 óra inkubáció után, és 31%-kal csökkent a kontrollhoz képest.

3.3. A spermium plazmamembránjának funkcionális integritása

Az 1. táblázat a spermiumsejtek funkcionális integritásának eredményeit mutatja 1 óra, 2 óra és 3 óra inkubáció után. A funkcionális integritás szignifikáns csökkenését () a középső dózisban 13.5%-kal 3 óra elteltével, valamint nagy dózisban 26%-kal 2 óra inkubáció után a kontrollokhoz képest. Magas dózisban (35%-os) csökkenést regisztráltak 3 óra inkubáció után.

3.4. Spermakapacitáció

A kapacitált spermiumok csökkenése minden kezelési csoportban megfigyelhető volt (1. táblázat). A kapacitált spermiumok százalékos aránya szignifikánsan () csökkent 100 μg/ml dózisban 18%-kal 3 óra inkubáció után, magas dózisban pedig 32%-kal, 36%-kal, illetve 38%-kal 1 óra, 2 óra és 3 óra inkubáció után.

3.5. DNS-károsodás a spermiumokban

A DNS-károsodott spermiumok számának százalékos aránya a dózis és az inkubációs idő növekedésével nőtt. A DNS-károsodás jelentős () növekedését azonban csak magas dózisnál (33%-kal) regisztrálták 3 órás inkubáció után. Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze.

4. Megbeszélés

AOP rovarölő szereket széles körben használják Srí Lankán, a felhasználók kevéssé vagy egyáltalán nem védekeznek, így az egyének magas expozíciós kockázatnak vannak kitéve. Ráadásul ezek a mezőgazdászok a legjobb reproduktív korukban elkerülhetetlenül hosszú időn keresztül vannak kitéve. A jelen vizsgálat célja az volt, hogy kimutassa az acefát, egy OP és a sperma minősége közötti összefüggést, valamint a spermiumok DNS-károsodását különböző inkubációs időpontokban. A jelen vizsgálatból kapott eredmények azt mutatták, hogy az acefát károsítja a spermiumok mozgékonyságát, életképességét, membránintegritását és a spermiumok kapacitációját, valamint DNS-károsodást idézett elő in vitro. Hasonló eredményeket kaptak a klórozott szénhidrogének , szerves foszfátok és benzol metabolitok esetében is .

A spermiumok mozgékonyságának mind a közepes (100 μg/ml), mind a magas (200 μg/ml) acefát dózisok esetén megfigyelt jelentős csökkenése a spermiumok megtermékenyítő képességének károsodását eredményezheti . A legmagasabb dózisnak való 3 órás expozíció után a spermiumok százalékos motilitása a WHO által ajánlott értékek alá csökkent. A spermiumok mozgékonyságát a spermiumok citotoxikus hatásának és a spermiumok megtermékenyítő képességének csökkenésének egyik legérzékenyebb érzékelőjének tekintik. A mitokondriális membránpotenciál különböző peszticidek által okozott változásai a spermiumok mozgékonyságának csökkenéséhez vezethetnek. A spermiumok mozgékonysága a mitokondriumok oxidatív útvonalain keresztül előállított intenzív átalakulástól és energiaköltségtől is függ, és a peszticidek megzavarhatják az oxidatív útvonalakat, ami késleltetett spermiummozgékonyságot eredményezhet, ami végül sejthalálhoz vezethet . Továbbá a peszticidek anyagcseretermékei zavarhatják a mitokondriumok oxidatív reakcióit, ami felesleges reaktív oxigénfajok (ROS) termeléséhez vezethet, csökkentve az ATP termelését, ami a motilitás károsodását eredményezi . Az oxidatív stressz a jelentések szerint a szerves foszfátok, köztük az acefát toxicitásának elsődleges mechanizmusa. Az integritás elvesztése a membrán áteresztőképességének növekedéséhez és a spermiumok mozgásának szabályozásában részt vevő ionok intracelluláris koncentrációjának szabályozására való képesség elvesztéséhez vezethet . A membrán károsodásának általános hatása lehet a felelős a spermiumok mozgékonyságának és életképességének folyamatos csökkenéséért az ejakuláció után .

Az életképesség az élő spermiumok aránya, amelyet a sejt- és/vagy membránintegritás értékelésével határoznak meg . Az eozin festési teszt a spermiummembrán szerkezeti integritásáról, míg a HOS teszt a spermiummembrán funkcionális integritásáról szolgáltatott információt . A spermiumok életképessége az ép, funkcionális és félig áteresztő plazmamembránokhoz kapcsolódik . A peszticidek kalciumion-emelkedést idézhetnek elő, ami károsíthatja a spermiummembránokat, így befolyásolva a spermiumok életképességét jóval azelőtt, hogy azok elérnék a petesejtet . A plazmamembrán jelen vizsgálatban megfigyelt változásai a spermiumok mozgékonyságának, életképességének és membránintegritásának csökkenését eredményezhetik .

A hipereaktiváció a spermiumok kapacitációjának befejezését jelzi, és elengedhetetlen a cumulus masszán és a zona pellucidán való áthatoláshoz . A jelen vizsgálatban kimutatták, hogy a hiperaktivált spermiumok nagy koncentrációban csökkentek, és az inkubációs idő növekedésével csökkentek, ami a spermiumok károsodott kapacitációjára utal. A spermiummembrán és a mitokondriumok alapvető fontosságúak a hiperaktiváció működtetésében, és a spermiummembrán és a spermium mitokondriumok bármilyen károsodása a kapacitált spermiumok csökkenéséhez vezethet . Ismert, hogy az OP az AchE gátlásán keresztül károsítja a kapacitációt, amikor in vitro spermiummal inkubálják . Mindazonáltal megfelelő mennyiségű AchE vagy AchE utánzó enzim hozzáadásával a közeghez a hatás megfordult , ami a spermium membrán AchE aktivitásának fontosságát jelzi a kapacitáció beindításában.

A jelen vizsgálat a kettős szálú DNS jelentős károsodását mutatja a legnagyobb dózisban (200 μg/ml) 3 órás inkubáció után. A spermium DNS integritása létfontosságú a genetikai információ továbbításához a reprodukció során, és a DNS bármilyen károsodása meddőséget eredményezhet . A DNS bázisok és a foszfodiészter gerincek különösen érzékenyek az oxidatív stressz okozta károsodásra, mivel plazmamembránjuk nagy mennyiségben tartalmaz többszörösen telítetlen zsírsavakat, citoplazmájuk pedig alacsony koncentrációban tartalmaz tisztító enzimeket . Ezért a magas ROS-szintek kettős szálú DNS-töréseket eredményezhetnek, amelyeket gyakran megfigyelnek a terméketlen férfiak spermiumaiban . Feljegyezték, hogy az acefát jelentősen növeli a celluláris reaktív oxigénfajokat (ROS), ami bázispár-hibák és szálszakadások kialakulásával a DNS módosítását eredményezi . A DNS-töredezett spermiumok kevésbé mozgékonyak és kevésbé érzékenyek a hiposzmotikus duzzadásra, ami a spermiummembrán alacsonyabb funkcionális integritását jelzi, így a spermiumok funkciójának csökkenéséhez vezet a DNS-károsodás növekedésével . A leukocitákban DNS-károsodást okozó növényvédő szerek a spermiumok DNS-károsodásához is vezethetnek .

5. Következtetések

A jelen tanulmány az acefát expozícióval járó spermiumfunkció lehetséges károsodására utal. Az ebben a vizsgálatban vizsgált acefát magas koncentrációja (200 μg/ml, ami megfelel az LD50-nek) megváltoztatta az emberi spermiumok motilitását, életképességét, a plazmamembrán funkcionális integritását és a spermiumok kapacitációját, valamint DNS-károsodást idézett elő in vitro. Az eredmények és a természetes emberi biológiai reakciók, mint például a vegyi anyagok lebomlása és kiürülése, figyelembevétele után azt lehet javasolni, hogy a vizsgált magasabb dózis (200 μg/ml) és afelett kockázatot jelenthet az emberi egészségre.

Rövidítések

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotikus oldat
NaCl:	Nátrium-klorid
OP:	Organofoszfát peszticid
ROS:	Reaktív oxigén fajok.

Etikai jóváhagyás

Az etikai jóváhagyást a Sri Jayewardenepura Egyetem Orvosi Tudományok Karának etikai felülvizsgálati bizottságától kaptuk, Nugegoda, Sri Lanka. Az etikai engedély száma: 712/13.

Érdekütközések

A szerzők nem jelentenek be érdekellentétet a cikk publikálásával kapcsolatban.

Köszönet

Nagyra értékeljük Neelika Malavige professzor asszony, a Sri Jayewardenepura Egyetem Orvosi Karának Mikrobiológiai Tanszékéről a széndioxid inkubátor biztosításáért és a Colombói Egyetem Természettudományi Karának Állattani Tanszékéről a projekthez szükséges vegyszerek biztosításáért.

Nagyra értékeljük.