Az elsődleges antitestek jelölésének öt legjobb módszere

Minden olyan alkalmazásban, amely antitesteket használ a jelek kimutatására (pl. Western blotting, ELISA, immunhisztokémia vagy FACS), az antitestek jelölésére kétféle megközelítés létezik: a közvetlen és az indirekt jelölés. A standard Western blotting indirekt jelölést alkalmaz, mivel a célantigén kimutatására elsődleges ellenanyagot használ, amelyet egy másodlagos ellenanyag követ, amelyhez egy detektáló molekula kapcsolódik.

Némely helyzetben jobb lehet kihagyni a másodlagos ellenanyagot és az összes kapcsolódó lépést, és közvetlenül jelölni az elsődleges ellenanyagot. A közvetlen primer antitest jelölésért kiáltó esetek közé tartoznak:

• A másodlagos antitest nem specifikus kötődése
• Nem specifikus kötődéssel rendelkezik.standard organizmusok primer antitesteit – ebben az esetben nehéz lehet jó másodlagos antitesteket találni
• Az azonos fajból származó antitestekkel történő multiplexálás esetén
• Ha le kell rövidíteni a kísérleti időt a másodlagos antitest inkubáció és a kapcsolódó mosási lépések kiküszöbölésével

Az antitest paraméterek

A kiválasztott antitestet nemcsak fluoreszcens festékekkel, hanem fluoreszcens fehérjékkel is jelölheti, enzimekkel és színes részecskékkel. Mindezek általában egy terminális lizincsoporton keresztül kapcsolódnak, ezért minden lépés során kerülnie kell az amintartalmú puffereket (például Tris) és molekulákat. Ellenkező esetben többnyire a puffer molekulákat fogja megjelölni! Kerülni kell a gyakori puffer tartósítószert, a nátrium-azidot is, mivel az zavarja a jelölési reakciót.

A jelölésre szánt antitestnek legalább 0,5 mg/ml koncentrációban és >90%-os tisztaságban kell lennie. Minél kevesebb zavaró fehérje és aminocsoportot tartalmazó molekula van az antitestkészítményben, annál hatékonyabb lesz a jelölési reakció. De még ha az antitestje úszik is glicinben és BSA-ban, a zavaró anyagokat dialízissel mindig eltávolíthatja. Az antitest tisztaságát azzal is javíthatja, ha egy A-fehérje-oszlopon vezeti át, vagy akár saját affinitás-tisztító oszlopot is készíthet megfelelő antigénnel.

Főbb házon belüli antitestjelölési módszerek

NHS (szukcinimidil) észter módszer

Ez a módszer az antitestek konjugálására alkalmas széles körben elérhető fluoreszcens festékekkel, például rodamin-származékokkal. Általában foszfát pufferben végzik, ezt követően oszlopon történő elválasztással a nem jelölt festéktől. A fő hátránya, hogy az észterek instabilak, mivel nedvességre érzékenyek. A jelölt antitestet a reakció befejezése után azonnal fel kell használni.

Izotiocianát módszer

Ezzel a módszerrel fluoreszcén-izotiocianátot (FITC) állíthatunk elő, amely nagyon népszerű a fluoreszcens fehérjék és antitestek előállításában. Ha dolgoztál már fluoreszcens mikroszkópiával, akkor foglalkoztál már FITC-vel. Különböző standard festékek izotiocianát analógjai is kaphatók.

Az izotiocianát stabilabb, mint az NHS, de nehezebb előállítani, és a jelölési reakciója valószínűleg kevésbé lesz hatékony ezzel a módszerrel. Az NHS-hez hasonlóan a felesleges festéket a reakció után kromatográfiával kell eltávolítani.

Karbodiimid módszer

A karbodiimidből származó vegyületek a fehérjék karboxilcsoportjait reaktív intermedierekké alakítják, amelyek reagálhatnak a lizinekkel. A karbodiimidek nagy reaktivitása azt jelenti, hogy viszonylag inert anyagokkal, például mágneses vagy arany részecskékkel ellátott antitestek jelölésére használhatók. A leggyakrabban használt karbodiimid az EDC. Néha NHS-t adnak a reakcióhoz, hogy segítsék a viszonylag stabil köztitermékek képződését.

A módszer egyszerű, de az NHS-hez hasonlóan az EDS is higroszkópos, ezért a jelölés után azonnal fel kell használni az antitestet.

Kétcímkés módszer

Itt az antitestet egy másik fehérjével jelöljük, amely katalizátorként szolgál, például HRP-vel vagy alkalikus foszfatázzal. Mivel mindkét molekula számos aminocsoportot tartalmaz, a közvetlen keresztkötés (mint az NHS-módszer esetében) ugyanannak a molekulának a polimerjeihez vezetne. Ezért a kötést két külön lépésben végezné el. Az antitestet az X molekulához, a katalizátort pedig az Y molekulához térhálósítja. Az X és Y molekulákat gondosan kell kiválasztania, mert kölcsönhatásba kell lépniük a konjugátum kialakításához. Például választhatja a maleimidet X-nek és egy tiolt Y-nak.

Míg a kapott konjugátum stabilabb lesz, mint amit az NHS-módszerrel kap, ez a módszer háromszor annyi munkát igényel; külön jelölési és tisztítási lépéseket az antitesthez, a katalizátorhoz és a konjugáló reakcióhoz. A jó hír az, hogy vásárolhat előre megjelölt katalitikus molekulát, majd ennek megfelelően címkézheti az antitestet.

Periodát módszer

Ez a módszer specifikus HRP-antitest konjugátumok előállítására alkalmas. A periodát a HRP-t a lizinmaradványokkal kölcsönhatásba lépő aldehidmolekulák létrehozásával aktiválja. Magának a HRP-nek csak néhány lizinmaradványa van, így az enzim polimerizációja nem jelent jelentős problémát. A HRP és az antitest közötti kötések reverzibilisek, hacsak nem stabilizáljuk őket nátrium-cianohidrid hozzáadásával.

Ez volt a legjobb házi antitest-jelölési módszerek ismertetése. Rengeteg kereskedelmi készlet van a piacon, amelyek hasonló alapkémia alapján működnek, és amelyek sokkal könnyebbé tehetik az életét. Ha a laborodnak van rá pénze.

Van más antitestjelölő módszered, amit megosztanál velünk? Vegye fel a kapcsolatot a hozzászólások rovatban.

Irodalom:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chemistry and Radiochemistry: Az első 10 év. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.